ES2257388T3 - Procedimientos y composiciones para la seleccion de integrinas. - Google Patents
Procedimientos y composiciones para la seleccion de integrinas.Info
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Abstract
Un procedimiento para seleccionar o identificar un compuesto que modula, inhibe o activa la actividad de una integrina alfa4beta7 o alfaEbeta7, que comprende: - poner en contacto (i) una preparación de membrana marcada que comprende integrina alfa4beta7 o alfaEbeta7 y un compuesto candidato con (ii) un material soporte que une integrina alfa4beta7 o alfaEbeta7, respectivamente, por medio de un ligando de las mismas y contiene un centelleador, - evaluar la cantidad de integrina alfa4beta7 o alfaEbeta7 unida al soporte, y - comparar la cantidad de integrina unida al soporte en presencia y en ausencia del compuesto candidato, y/o en presencia de un anticuerpo bloqueante, y seleccionar o identificar el compuesto que modula dicha cantidad.
Description
Procedimientos y composiciones para la selección
de integrinas.
La presente invención se refiere a procedimientos
de selección de compuestos que modulan la actividad de integrinas,
más particularmente las integrinas de la subfamilia
\alpha\beta7. La invención está de más preferencia basada en la
tecnología SPA que selecciona compuestos que modulan integrinas de
la subfamilia \alpha\beta7, más específicamente la actividad de
las integrinas \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7. La invención
también incluye las composiciones, productos, equipos para uso para
llevar a cabo los procedimientos anteriores, así como los compuestos
identificados por dichos procedimientos y sus usos.
Las integrinas son una familia de moléculas de
adhesión de transmembrana involucradas en las comunicaciones
célula-célula y célula-matriz
extracelular. Las integrinas comprenden diversas familias de
moléculas heterodiméricas, comprendiendo una subunidad \alpha y
una \beta, expresadas de manera no covalente en la superficie de
la célula (Wardlaw, Drugs of the Future, 1999, 24(3), 279).
La subunidad de integrina \beta7 puede constar de dos cadenas
\alpha, \alpha4 y \alphaE y se expresa principalmente en
linfocitos. Como un heterodímero \alpha4, se une a la molécula de
adhesión celular de adresina de la mucosa MADCAM-1 y
media en el reclutamiento selectivo de células de memoria T y B a la
mucosa gastrointestinal y al tejido linfoide asociado al intestino.
Como un heterodímero \alphaE, se une a la
E-cadherina y media en la adhesión de linfocitos T
intraepiteliales a las células epiteliales.
La expresión de MADCAM-1 parece
estar regulada en sitios asociados con enfermedad intestinal
inflamatoria (Briskin y col., 1997, AJP 151(1), 97). La
administración del anticuerpo monoclonal
anti-\alpha4\beta7 ACT-1 a monos
tamarines cabeza de algodón con colitis crónica inhibe el
reclutamiento de diversas subclases de leucocitos hacia la mucosa
del colon inflamada (Hesterberg y col., 1996, Gastroenterology 111,
1373). Se observó reducción de la actividad inflamatoria del colon
en ratones SCID reconstituidos con células T CD45Rbhi CD4+ tras la
administración de anticuerpos contra \beta7 y/o contra
MADCAM-1 (Picarella y col., 1997, J. Immunol. 158,
2099, Walsh y col., 1996, Immunology 89, 112-119,
sugieren la unión dependiente de \alpha4\beta7 de eosinófilos a
transfectantes VCAM-1 y
MadCAM-1).
Con respecto a \alphaE\beta7, esta integrina,
de acuerdo con nuestros conocimientos, nunca se ha usado como un
blanco para la selección de medicamentos. Sin embargo, los
inventores de la presente solicitud ahora han obtenido resultados
experimentales que muestran que esta molécula puede jugar un rol
crítico en el reclutamiento de células T y también representa un
blanco interesante para diversas enfermedades tales como, más
específicamente, asma. Al respecto, la deficiencia de \alphaE
reduce la hiperrespuesta de las vías aéreas en ratones con desafío
antigénico y un anticuerpo anti-\alphaE (M290)
demostró buena actividad en un modelo de ratón de eosinofilia
inducida por ovoalbúmina (resultados sin publicar por parte de los
inventores). Además, \alphaE\beta7 también puede estar
involucrada en las enfermedades inflamatorias del intestino.
Consecuentemente, las integrinas
\alpha4\beta7 y \alphaE\beta7 representan un blanco
interesante para el desarrollo de fármacos o compuestos
farmacológicamente activos. En particular, compuestos que tienen la
capacidad de modular la actividad de esas integrinas podrían
representar compuestos altamente potenciales para el tratamiento de
todas las enfermedades donde estén involucradas tales como
enfermedades inflamatorias (por ejemplo, enfermedad intestinal
inflamatoria, esclerosis múltiple, psoriasis, epidermodisplasia
verruciforme, artritis inflamatoria), enfermedades alérgicas (por
ejemplo, dermatitis, enfermedades relacionadas con T
ayudante-1, enfermedad pulmonar obstructiva crónica,
asma, etc.) y enfermedades inmunes.
La disponibilidad de ensayos adecuados para
seleccionar compuestos que tienen tal propiedad podría entonces
resultar de mayor interés. Al respecto, los ensayos de integrina
actuales son ensayos de adhesión que usan placas recubiertas con
ligandos en contacto con células que expresan integrinas y un
compuesto de prueba. Sin embargo, esta prueba no es adecuada para
formato de alto rendimiento y carece de sensibilidad y/o
reproducibilidad. Se usó un ensayo de centelleo por proximidad (SPA)
para el estudio de inhibidores de interacciones de
VCAM-1 y \alpha4\beta1 (Doyle y col., 1996,
Int. J. Peptide Protein Res. 47, 427-436). De
acuerdo con nuestros conocimientos no se informaron ensayos eficaces
en la técnica que permitan una selección eficaz, fiable, sensible y
reproducible de compuestos que modulan la actividad de las
integrinas que tienen una subunidad \beta7.
La presente invención describe composiciones y
procedimientos para la selección de compuestos que modulan, inhiben
o activan la actividad de integrinas \alpha4\beta7 o
\alphaE\beta7 con fiabilidad y eficacia. Los procedimientos de
acuerdo con esta invención son simples, fiables, sensibles, cómodos
y económicos y permiten la selección de compuestos en base a alto
rendimiento. En particular, la invención puede usarse para
seleccionar en paralelo, gran cantidad de compuestos, incluyendo
bibliotecas combinatorias de compuestos para identificar fármacos
candidatos o blanco. Este tipo de invención permite entonces, por
primera vez, seleccionar compuestos activos usando integrinas
\alpha4\beta7 o \alphaE\beta7 como blancos, para la
selección, mejora y/o desarrollo de productos terapéuticamente
activos.
Un objetivo de esta invención reside más
específicamente en un procedimiento para seleccionar o identificar
un compuesto que modula la actividad de integrinas \alpha4\beta7
o \alphaE\beta7. El procedimiento de más preferencia comprende
la identificación, selección, caracterización o selección de
compuestos que inhiben la actividad de la integrina
\alpha4\beta7 o \alphaE\beta7.
Un objetivo particular de la presente invención
reside en un procedimiento que selecciona o identifica un compuesto
que modula, inhibe o activa la actividad de una integrina
\alpha4\beta7 o \alphaE\beta7, el procedimiento
comprende:
- -
- poner en contacto (i) una preparación de membrana marcada que comprende integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7 con un compuesto candidato con (ii) un material soporte que une integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7, respectivamente, mediante un lingando de la misma y contiene un centelleador, y
- -
- evaluar la cantidad de integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7 unida al soporte.
El material soporte puede estar compuesto de o
comprender diversos elementos, tales como: polímeros, geles,
vidrios, elementos artificiales u orgánicos, etc. El soporte puede
estar funcionalizado adicionalmente y se le puede dar diversas
formas, incluyendo la forma de perlas. Ya que el procedimiento de
preferencia usa la tecnología de centelleo por proximidad (SPA), el
material soporte además comprende un material centelleador, el que
puede ser excitado tras la unión de la integrina marcada con el
mismo o cuando el material de integrina marcada se lleva próximo al
mismo. En una forma de realización de preferencia, el material
soporte comprende un centelleador y está recubierto con un ligando
de la integrina, es decir con un compuesto que es capaz de
(específicamente) interactuar con integrina o una parte funcional de
la misma.
En el procedimiento de la presente invención,
determinar la cantidad de integrina unida al material soporte
comprende de preferencia la determinación de la señal de centelleo
del soporte. De más preferencia, el procedimiento comprende comparar
la cantidad de integrina unida al soporte en presencia y en ausencia
de un compuesto candidato y/o en presencia de un anticuerpo
bloqueante e identificar el compuesto que modula dicha cantidad.
Además, la invención puede usarse para seleccionar grandes
cantidades de compuestos candidatos en paralelo, tales como parte o
la totalidad de las bibliotecas combinatorias de compuestos.
La invención puede usarse para seleccionar,
identificar, caracterizar, mejorar, comparar, etc. compuestos que
modulan, inhiben o activan la actividad de la integrina
\alpha4\beta7 o \alphaE\beta7. La invención es
particularmente más adecuada para seleccionar inhibidores de
integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7.
Otro objetivo de esta invención reside en un
equipo para usar en la selección de moduladores de integrina
\alphaE\beta7 o \alpha4\beta7, el equipo comprende una
preparación de la membrana marcada que comprende integrina
\alphaE\beta7 o \alpha4\beta7 o una parte funcional de la
misma y/o material soporte en el que el material soporte comprende
un ligando que une integrina \alphaE\beta7 o \alpha4\beta7
o una parte funcional de las mismas y contiene un centelleador.
Figura 1: Representación esquemática del ensayo
basado en SPA.
Como se indicó, esta invención reside,
generalmente, en procedimientos mejorados de selección para
moduladores de integrinas. Estos procedimientos, generalmente, usan
formatos SPA y preparaciones de membrana que comprenden la integrina
seleccionada o partes funcionales de la misma (ver figura 1). Los
procedimientos pueden usarse para seleccionar activadores así como
inhibidores de integrina, por ejemplo compuestos que incrementan o
disminuyen la unión de integrinas a los ligandos de las mismas. De
preferencia, se seleccionan inhibidores, es decir, compuestos que
disminuyen los niveles de dicha interacción, típicamente al menos un
20%, de preferencia al menos un 50%.
Típicamente, la presente invención reside en un
procedimiento de selección o identificación de un compuesto que
modula, inhibe o activa la actividad de una integrina
\alpha4\beta7 o \alphaE\beta7, el procedimiento
comprende:
- -
- poner en contacto (i) una preparación de membrana marcada que comprende integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7 con un compuesto candidato con (ii) un material soporte que une integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7, respectivamente, y contiene un centelleador, y
- -
- evaluar la cantidad de integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7 unida al soporte.
En una forma de realización de preferencia, la
cantidad de integrina unida al soporte en presencia de un compuesto
candidato se compara con la cantidad de integrina unida al soporte
en ausencia de un compuesto candidato y/o en presencia de un
anticuerpo bloqueante, compuestos que modulan dicha cantidad
representan compuestos que modulan la actividad de la integrina.
Como se indicó, la presente invención de
preferencia incluye un ensayo de centelleo tal como el ensayo de
centelleo por proximidad (SPA). La tecnología del ensayo de
centelleo próximo (SPA) incluye el uso de material de soporte de
centelleo (por ejemplo perlas) que contienen un centelleador
orgánico tal como difeniloxazol (PPO). Los ensayos usualmente se
llevan a cabo en tampones acuosos usando isótopos radiactivos tales
como ^{3}H, ^{125}I, ^{14}C, ^{35}S o ^{33}P que emiten
radiación de baja energía, la energía de estos es fácilmente
disipada en un ambiente acuoso. Por ejemplo, los electrones emitidos
por ^{3}H tienen una energía promedio de sólo 6 keV y tienen paso
del haz muy corto (-1 \simtm) en agua. Si una molécula marcada con
uno de estos isótopos está unida a la superficie del material de
soporte, ya sea directamente o mediante interacción con otra
molécula previamente acoplada al material de soporte, la radiación
emitida activará el centelleador y producirá luz. La cantidad de luz
producida, que es proporcional a la cantidad de moléculas marcadas
unidas al material soporte, puede medirse convenientemente con un
contador de centelleo líquido (LS). Si la molécula marcada no está
unida al material de soporte, su energía radiante es absorbida por
el solvente acuoso que la rodea antes de llegar al material de
soporte y no se produce ninguna luz. Así, los ligandos unidos dan
una señal de centelleo, pero los ligandos libres dan un valor basal
muy bajo, y se elimina la necesidad de una etapa de separación que
agrega tiempo al procedimiento, característica de los ensayos de
unión de ligandos radiactivos convencionales. Disminuyen las
manipulaciones necesarias en los ensayos a unas simples etapas de
pipeteo lo que lleva a una precisión y reproducibilidad mayor y a un
rendimiento superior.
En una forma de realización de más preferencia,
el procedimiento comprende el uso de perlas de SPA recubiertas con
un ligando de integrina, típicamente un ligando endógeno de
integrina. El recubrimiento se lleva a cabo, de preferencia por
medio de interacción química o física con las perlas, aunque pueden
contemplarse otros medios de unión. En particular, el recubrimiento
puede llevarse a cabo usando perlas con estreptavidina y moléculas
de ligando biotiniladas.
Esta invención es el resultado de la selección y
validación de integrinas como blancos para el desarrollo de fármacos
en enfermedades inflamatorias, alérgicas e inmunes, así como de la
selección de condiciones eficaces de ensayos de selección de tales
fármacos. Al respecto, la invención muestra inesperadamente que
formatos de ensayo SPA particulares que usan preparaciones de
membrana pueden usarse para identificar compuestos que interfieren
con interacciones de proteína-proteína complejas
entre moléculas complejas tales como receptores heterodiméricos, en
particular receptores heterodiméricos recombinantes. La invención
además muestra que es factible el alto rendimiento, ya que pueden
usarse formatos con placas con 384 pocillos, con volúmenes
bajos.
La presente invención describe ahora un
procedimiento nuevo para seleccionar compuestos activos usando un
formato de ensayo SPA y material de soporte. El material de soporte
tiene la capacidad de unir el complejo de integrinas seleccionado en
conformación esencialmente nativa o partes funcionales de la
misma.
Al respecto, el soporte puede estar compuesto, al
menos en parte, de silicato, poliviniltolueno (PVT),
(poli)acrilamida, agarosa, sefarosa, poliestireno, etc. Los
ejemplos específicos de materiales de soporte incluyen PVT o
material de silicato, opcionalmente recubiertos con ligandos tales
como WGA, estreptavidina, polilisina, etc. El material de mayor
preferencia comprende silicato de itrio (YtSi) o PVT recubierto o
funcionalizado, en particular recubierto con un ligando de la
integrina.
En una forma de realización de más preferencia,
el soporte contiene un centelleador (o un centelleador orgánico). El
centelleador es de preferencia insoluble en agua y excitable a un
estado de energía superior tras la unión de la integrina marcada al
soporte. El centelleador debería producir suficiente energía
lumínica para ser detectada usando un dispositivo adecuado (contador
de centelleo, por ejemplo). Un ejemplo típico de centelleador es
difeniloxazol (PPO). Este centelleador se excita eficazmente por
isótopos radiactivos que emiten rayos beta.
El material de soporte adecuado para uso en la
presente invención puede encontrarse en el comercio, tal como por
ejemplo en productos Amersham perlas de PVT recubiertas con WGA
(RPNQ0001), perlas de PVT con WGA tratadas con PEI (RPNQ0003),
perlas de PVT recubiertas con estreptavidina (RPNQ0007; RPNQ0007),
perlas de silicato de itrio recubiertas con polilisina (RPNQ0010),
perlas de silicato de itrio recubiertas con WGA (RPNQ0011), perlas
de silicato de itrio recubiertas con estreptavidina (RPNQ0012) y
perlas de SPA de silicato de itrio de unión a ARN (RPNQ0013).
Aunque el material de soporte puede ser de formas
variadas, típicamente está en la forma de perlas (al respecto, ver
"Proximity News", 39 (Dic. 1998), 1). Debería entenderse que
una persona experta en la técnica puede ajustar la forma y
composición precisa del material del soporte usando los
conocimientos generales.
En una forma de realización de preferencia, el
material de soporte, (por ejemplo, las perlas) está unido a (o
recubierto con) un ligando (endógeno) de integrina \alpha4\beta7
o \alphaE\beta7. El término ligando designa a cualquier molécula
que tiene la capacidad de interactuar con la integrina seleccionada.
En una forma de realización de más preferencia, el ligando es un
ligando endógeno de la integrina, es decir, un compuesto que se sabe
que interacciona fisiológicamente con la integrina seleccionada.
Por cierto, resulta de más preferencia usar moléculas selectivas del
ligando, es decir, moléculas que interactúan de preferencia con la
integrina deseada y usar moléculas de ligando fisiológicas para
producir los resultados más fiables.
Al respecto, en una primera variante de
preferencia, el procedimiento usa material de soporte recubierto con
(o unido a) MADCAM-1 o una parte funcional del
mismo. MADCAM-1 es un ligando endógeno de la
integrina \alpha4\beta7. Las secuencias de ácido nucleico y
aminoácidos de MADCAM-1 están disponibles en
Genbank, número de acceso MN_007164.
En una segunda variante de preferencia, el
procedimiento usa material de soporte recubierto con
E-cadherina o una parte funcional de la misma. La
E-cadherina es un ligando endógeno de la integrina
\alphaE\beta7. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de
E-cadherina están disponibles en Genbank, número de
acceso XM_007840.
El término parte funcional designa a cualquier
variante o fragmento del ligando que retiene la capacidad de
interactuar con la integrina seleccionada. En particular, la parte
funcional puede estar constituida por un fragmento del ligando
conteniendo el sitio de unión y desprovisto del domino
citoplasmático. La parte funcional puede también comprender una
variante del ligando, teniendo una o diversas modificaciones de
aminoácidos (por ejemplo deleción, sustitución, mutación y/o
adición), que aún exhibe la capacidad de unirse a la integrina.
Tales variantes también incluyen variantes que se producen
naturalmente tales como polimorfismos, formas de corte y empalme,
homólogos de especies diferentes, etc.
El ligando puede recubrir el material de soporte
de diferentes maneras, tales como mediante interacciones covalentes
o no covalentes. De preferencia, el ligando recubre de manera
covalente, a través de una unión química o espaciador, tal como por
ejemplo estreptavidina/biotina.
Generalmente, se usan desde 0,05 hasta 5 mg de
material de soporte (por ejemplo, perlas recubiertas) para cada
ensayo. Debería entenderse que un experto en la técnica podría
ajustar la cantidad precisa de material de soporte, dependiendo del
material de soporte, cantidades de reactivos, etc.
Como se indicó anteriormente, esta invención usa
una preparación de membrana marcada comprendiendo la integrina
seleccionada, cuya actividad debe detectarse bajo las condiciones
descritas anteriormente. Los inventores demostraron, por cierto que
la selección es mucho más eficaz y fiable cuando se usan
preparaciones de membrana, en vez de polipéptidos de integrina
aislados o purificados. Además, los inventores han demostrado que
las preparaciones de membrana pueden usarse en la selección para
evaluar la interacción entre moléculas receptoras complejas y el
ligando en un formato de alto rendimiento.
La preparación de la membrana puede ser una
célula entera o una preparación derivada de una célula entera
comprendiendo una fracción de la membrana de la misma, en la que
dicha célula o fracción de membrana comprende la integrina
\alpha4\beta7 o \alphaE\beta7 o una parte funcional de las
mismas. La preparación de membrana puede también ser una preparación
de membrana artificial comprendiendo la integrina seleccionada, por
ejemplo una micela o un liposoma producido mezclando lípidos y los
polipéptidos de integrina juntos bajo condiciones adecuadas. En una
forma de realización de preferencia, la preparación de membrana es
un lisado celular producido a partir de una célula que expresa el
polipéptido de integrina seleccionada o una parte funcional de la
misma.
En una forma de realización particular, el
procedimiento usa una preparación de membrana, tal como un lisado
celular o una fracción celular, comprendiendo la integrina, derivada
(u obtenida) de células de mamífero o bacterianas
(recombinantes).
La integrina puede ser de diversos orígenes, tal
como humano o animal, de preferencia humano. La integrina puede ser
una integrina que se produce naturalmente, por ejemplo, preparada en
un cultivo de células que producen naturalmente dicha molécula
(cultivo tisular, cultivo celular, etc.), o una molécula
recombinante preparada a partir de células conteniendo el ácido
nucleico recombinante que la codifica. Al respecto, la integrina
puede obtenerse a partir de células transfectadas conteniendo un
ácido nucleico que codifica dicha molécula. Las secuencias de ácido
nucleico que codifican una integrina humana \alphaE\beta7 o
\alpha4\beta7 fueron clonadas y se describen en la técnica, por
ejemplo estas secuencias están disponibles en Genbank bajo los
números de acceso XM_029724; XP_039011; XP_008508; XM_039011.1;
XM_008508.5. La secuencia puede transfectarse en células usando
plásmidos y/o vectores diversos, conteniendo promotores diversos,
para producir la molécula recombinante. El lisado de tales células
(u otras preparaciones derivadas del mismo) puede usarse en los
ensayos de selección de esta invención. Las células pueden ser de
diversos orígenes tales como mamíferos, eucarióticas (por ejemplo
levaduras), procarióticas (por ejemplo bacterias), vegetal, etc.
Usualmente, las células de preferencia son de mamífero, de manera
que la integrina recombinante es funcional y se procesa de acuerdo a
los mecanismos naturales. Sin embargo, pueden usarse células no
humanas para incrementar además la selectividad del procedimiento,
es decir, para producir membranas celulares que expresan la
integrina humana seleccionada y ningún otro polipéptido de integrina
humana. Al respecto, las células de mamífero o humanas de
preferencia son células que esencialmente no expresan naturalmente
moléculas de integrina.
Las células pueden ser células primarias o
cultivos celulares establecidos. Pueden cultivarse en cualquier
medio adecuado, posteriormente tratarse para preparar la preparación
de membrana que contiene integrinas (extractos celulares, fracciones
celulares y similares). Típicamente, se somete a las células a
tratamiento físico y/o químico para producir el material que
contiene integrinas. En un experimento típico, las células se
someten a lisis enzimática y/o química y/o física, usando de
preferencia tripsina, ciclos de congelación/descongelación,
ultrasonido, etc., solos o en combinaciones diversas. Los extractos
(o fracciones) celulares se recogen y pueden además concentrarse,
suspenderse en tampones adecuados, purificarse, acondicionarse,
etc.
Típicamente la preparación de membrana con
integrinas usada es un lisado o fracciones celulares (u otro
material derivado de células). La preparación de membrana con
integrinas puede comprender también extractos celulares
(transfectados) totales.
En una forma de realización de preferencia la
preparación de membrana se obtiene a partir de una célula (de
mamífero) recombinante que expresa una molécula de polipéptido de
integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7, aún de más
preferencia a partir de una célula recombinante que expresa
integrina humana \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7, o una parte
funcional de las mismas. Para producir tal preparación de membrana,
pueden usarse diversas células, tales como células que expresan
naturalmente la integrina seleccionada, o células transducidas con
un ácido nucleico que codifica la misma o una parte funcional de la
misma. El término parte funcional es como se definió anteriormente
para el ligando. Por cierto, no es necesario que la integrina
expresada sea idéntica a la integrina que se produce naturalmente,
siempre que (i) retenga un sitio de unión funcional y (ii) sea capaz
de interactuar con el ligando que recubre el material de soporte. De
acuerdo a esto, la integrina puede carecer de dominios
citoplasmáticos o aminoácidos y/o contener variaciones de
aminoácidos comparadas con las moléculas de tipo salvaje.
Como se indicó, la preparación de membrana está
marcada para permitir la detección de una interacción con el
material de soporte recubierto. La preparación de membrana marcada
está marcada de preferencia radiactivamente. La marcación radiactiva
puede llevarse a cabo usando isótopos radiactivos diversos,
incluyendo ^{3}H, ^{125}I, ^{14}C, ^{35}S, ^{33}P o
^{32}P. De preferencia, el isótopo radiactivo debería emitir
radiación de baja energía, cuya energía se disipa fácilmente en un
ambiente acuoso. Por cierto, se necesita que las membranas marcadas
no unidas no activen esencialmente el centelleador contenido en el
material de soporte. La naturaleza del isótopo puede seleccionarse
también dependiendo del tipo del centelleador. Por ejemplo, en caso
de usar PPO como centelleador, el isótopo debería emitir de
preferencia rayos beta, tal como por ejemplo ^{3}H. En una forma
de realización de preferencia, las preparaciones de membrana están
tritiadas.
El marcado puede llevarse a cabo de acuerdo con
diversas técnicas conocidas, tal como la incorporación de elementos
marcados en las membranas celulares (por ejemplo aminoácidos,
lípidos, etc. marcados), o poniendo las preparaciones de membrana en
contacto con un marcador (ligando marcado, etc.). De preferencia,
las membranas se marcan incorporando elementos marcados durante el
cultivo celular. Aún de más preferencia, se marcan incorporando
aminoácidos marcados. De acuerdo con esto, en una forma de
realización de preferencia, la preparación de membrana se marca
radiactivamente cultivando una célula en presencia de un aminoácido
marcado radiactivamente previo a la preparación de la preparación de
membrana. El aminoácido marcado puede ser por ejemplo metionina, que
se incorpora en muchos polipéptidos, ya que está codificado por el
codón ATG de inicio. Debería entenderse que pueden usarse otros
aminoácidos marcados.
La cantidad de preparación de membrana marcada
para el ensayo puede ser ajustada por un experto en la técnica. En
un experimento típico, se usa entre 1 x 10^{4} hasta 5 x 10^{8}
cpm/ml de preparación de membrana marcada para cada reacción de
ensayo, de más preferencia aún entre 1 x 10^{5} hasta 5 x 10^{7}
cpm/ml. En un experimento típico, se usan entre 1 x 10^{6} y 5 x
10^{6} cpm/ml.
El ensayo puede llevarse a cabo en cualquier
soporte o dispositivo adecuado, incluyendo placa, tubo, matraz y
similar. Generalmente, el contacto se lleva a cabo en placas de
pocillos múltiples, permitiendo realizar múltiples ensayos en
paralelo. Los soportes típicos incluyen placas de microtitulación,
especialmente de 96 o 384 pocillos y formatos de placas de
microtitulación de alto rendimiento, que son fáciles de manejar y de
iluminar por medio de excitación convencional. Pueden usarse también
otros formatos, incluyendo placas de microtitulación mayores o
nanotecnologías.
Dependiendo del soporte y del compuesto de
prueba, pueden usarse en el ensayo cantidades variables de
reactivos. Típicamente, pueden distribuirse las siguientes
cantidades en un volumen final máximo de 250 \mul por pocillo:
0,05-5 mg/ml de perlas
recubiertas con ligando, y
1 x 10^{4} a 5 x 10^{8} cpm/ml de preparación
de membrana marcada radiactivamente.
La reacción puede llevarse a cabo en cualquier
tampón de ensayo adecuado, comprendiendo por ejemplo cualquier
tampón, solución salina, solución acuosa, etc., que permita poner en
contacto los reactivos y que no altere su actividad biológica.
Debería entenderse que las cantidades (o
concentraciones) respectivas precisas de reactivos y compuestos de
prueba pueden ser ajustadas por el usuario, dependiendo del tipo de
compuesto, el tipo de integrina, la longitud del período de
incubación, etc. Además, si es necesario, los reactivos pueden
mezclarse en presencia de agentes adicionales para mejorar el
rendimiento del ensayo.
La etapa de contacto i) puede durar hasta 6
horas, típicamente menos de 4 horas. Por cierto, los reactivos
diversos son incubados de preferencia durante un período de tiempo
suficiente para permitir que se produzca la interacción. Dependiendo
de los ensayos, este período usualmente dura menos de
aproximadamente 3 horas. En un experimento típico, la mezcla se
lleva a cabo durante aproximadamente 1 hora o menos. El soporte
puede agregarse durante aproximadamente 10 minutos o varias horas.
Típicamente, la mezcla de reacción se agita durante los primeros
5-30 minutos y la mezcla se deja durante otros
15-100 minutos o más.
La cantidad de integrina unida al soporte puede
evaluarse de diversas maneras, como una indicación de la actividad
del compuesto candidato. Generalmente, se evalúa por conteo de
centelleo usando dispositivos convencionales. En particular, los
conteos pueden medirse directamente en la mezcla de reacción, sin
necesidad de etapas de separación. Alternativamente, el lípido de
unión al soporte puede detectarse o cuantificarse usando otras
técnicas convencionales, tales como cromatografía, inmunoensayo,
etc.
Una forma de realización de preferencia de esta
invención incluye un procedimiento de selección o identificación de
un compuesto que modula la actividad de integrina \alpha4\beta7,
comprendiendo:
poner en contacto, en presencia o en ausencia del
compuesto candidato, (i) una preparación de membrana marcada que
comprende integrina \alpha4\beta7 o una parte funcional de la
misma con (ii) un material de soporte recubierto con
MADCAM-1 o una parte funcional del mismo que se une
selectivamente a \alpha4\beta7 contenida en dicha preparación de
membrana, comprendiendo dicho material de soporte un centelleador,
y
evaluar el efecto del compuesto candidato en la
actividad de integrina \alpha4\beta7 comparando la señal de
centelleo en presencia y en ausencia del compuesto candidato y/o en
presencia de un anticuerpo bloqueante, los compuestos que modulan
dicha señal de centelleo representan compuestos que modulan dicha
actividad.
Otra forma de realización de preferencia de esta
invención reside en un procedimiento de selección o identificación
de un compuesto que modula la actividad de integrina
\alphaE\beta7, comprendiendo:
poner en contacto, en presencia o en ausencia del
compuesto candidato, (i) una preparación de membrana marcada que
comprende integrina \alphaE\beta7 o una parte funcional de la
misma con (ii) un material de soporte recubierto con
E-Cadherina o una parte funcional de la misma que se
une selectivamente a \alphaE\beta7 contenida en dicha
preparación de membrana, comprendiendo dicho material de soporte un
centelleador, y
evaluar el efecto del compuesto candidato en la
actividad de integrina \alphaE\beta7 comparando la señal de
centelleo en presencia y en ausencia del compuesto candidato y/o en
presencia de un anticuerpo bloqueante, los compuestos que modulan
dicha señal de centelleo representan compuestos que modulan dicha
actividad.
Los procedimientos anteriores están dirigidos de
preferencia a la identificación o selección de inhibidores de
integrinas.
El compuesto de prueba puede ser cualquier
producto en forma aislada o mezclado con cualquier otro material
(por ejemplo cualquier otro producto(s)). El compuesto puede
estar definido en términos de estructura y/o composición, o puede
estar indefinido. Por ejemplo, el compuesto puede ser un producto
aislado y estructuralmente definido, un producto aislado de
estructura desconocida, una mezcla de diversos productos conocidos y
caracterizados o una composición indefinida comprendiendo uno o
varios productos. Los ejemplos de tales composiciones indefinidas
incluyen por ejemplo muestras de tejido, fluidos biológicos,
extractos celulares, preparaciones vegetales, etc. El compuesto de
prueba puede ser cualquier producto orgánico o inorgánico,
incluyendo un polipéptido (o una proteína o péptido), un ácido
nucleico, un lípido, un polisacárido, un producto químico o
cualquier mezcla o derivados de los mismos. Los compuestos pueden
ser de origen natural, de origen sintético, incluyendo bibliotecas
de compuestos.
Como se discutirá más adelante, la presente
invención está particularmente adaptada para la selección de gran
cantidad de compuestos, tales como bibliotecas combinatorias de
compuestos. Por cierto, la presente invención provee composiciones y
procedimientos que permiten la selección eficaz y simple de varios
compuestos en períodos de tiempo cortos. En particular, los
presentes procedimientos pueden automatizarse parcialmente, y por lo
tanto permiten la selección eficaz y simultánea de grandes series de
compuestos.
Generalmente, la actividad del
compuesto(s) de prueba es desconocida, y el procedimiento de
esta invención se usa para identificar compuestos que exhiben la
propiedad seleccionada (por ejemplo moduladores de integrinas). Sin
embargo, en situaciones particulares cuando la actividad (o tipo de
actividad) del compuesto(s) de prueba se conoce o espera, el
procedimiento puede usarse para caracterizar adicionalmente dicha
actividad (en términos de especificidad, eficacia, etc.) y/o para
optimizar dicha actividad evaluando derivados de dichos compuestos
de prueba.
La invención también incluye equipos para uso en
la selección de moduladores de integrinas \alphaE\beta7 o
\alpha4\beta7, que comprenden una preparación de membrana
marcada comprendiendo integrinas \alphaE\beta7 o
\alpha4\beta7 o una parte funcional de las mismas y/o un
material de soporte en el que el material de soporte se une a la
integrina \alphaE\beta7 o \alpha4\beta7 o a una parte
funcional de la misma y contiene un centelleador. El equipo también
puede incluir los reactivos y/o protocolos para tecnología SPA,
tales como tampones, etc.
Los transfectantes de la línea celular K562 de
leucemia mielógena crónica humana que expresan \alphaE\beta7 y
las proteínas tales como proteína de fusión de
E-Cadherina-Fc, fueron como los
descritos en Brenner y col. (Molecular basis for Leukocyte Integrin
\alphaE\beta7 Adhesion to Epithelial
(E)-Cadherin, Structure-Function
analysis of integrin \beta7 subunit). Estos pueden prepararse de
acuerdo con técnicas conocidas. La biotinilación de
(E)-Cadherina se llevó a cabo de acuerdo con el
protocolo clásico (Cf: Amersham proximity news: Biotinylation
techniques...). El medio de cultivo incluyendo todos los suplementos
se adquirió en LifeTech (Paris, Francia), [^{3}H] metionina
(TRK583, 85 Ci/mmol) y las perlas de SPA con estreptavidina
(RPNQ0007) se adquirieron en Amersham (Paris, Francia).
Se cultivaron las células K562 en RPMI 1640 con
medio L-glutamina (Life Tech
Nº21875-0.34), Clon Fetal I 10%,
L-Glu 2 mM adicional, Pen/Strep 100 X, Geneticina
550 mg/l, Higromicina B 550 mg/l. Las células se dividen cada
2-3 días. Usualmente resuspendemos a una
concentración de 0,4 millones/ml en matraces COSTAR de 150 cm^{2}
(retirándolos).
Se cultiva la línea celular humana K562 (50 x
10^{6} células/100 ml) durante 18 horas en RPMI1640 libre de
metionina (LifeTech Nº11876-026) con 10% FBS en
presencia de 80 \muCi de [^{3}H] metionina (Amersham NºTRK583,
85 Ci/mmol). Se lavan las células dos veces con 25 ml de PBS, se
centrifugan a 1500 rpm durante 10 min. y se resuspenden en 10 ml de
tampón de lisis hipotónico (20 mM Hepes, 2 mM CaCl_{2}, 20 mM NaCl
y 25 \mug/ml de aprotinina) para 50 x 10^{6} células y se
mantienen a -80ºC.
Se mezclan las perlas de SPA con estreptavidina
con biot-E-Cadherina (5 \mug/mg
perlas) durante 30 minutos a temperatura ambiente en tampón de
ensayo (HBSS (Gibco, 14025-076), 0,5 mM Mn^{2+}
(MnCl_{2}), 25 mM HEPES, pen/strep [1X], Complete^{TM} libre de
EDTA (inhibidor de Proteasas): un comprimido/50 ml de tampón de
ensayo (Boehringer Mannheim Nº1873580), 15% glicerol), se
centrifugan a 3000 rpm durante 5 minutos y se resuspenden en el
tampón de ensayo a 70 \mug/100 \mul/pocillo.
El ensayo de centelleo por proximidad se lleva a
cabo a temperatura ambiente en tampón de ensayo. Cada ensayo se
lleva a cabo en un volumen de reacción de 200 \mul conteniendo 0,7
mg/ml de perlas SPA recubiertas y 2,3 x 10^{6} cpm/ml de membranas
tritiadas. La señal no específica se determina en presencia de
concentraciones altas de anticuerpo bloqueante. Se incuban las
placas de microtitulación a temperatura ambiente durante 45 minutos
en un agitador orbital y se realiza el conteo en un contador de
centelleo Wallac Microbeta^{TM}.
Se completó la selección de varias bibliotecas.
Se seleccionaron diversas entidades químicas y se confirmó su
capacidad para inhibir la actividad de integrinas.
Células que expresan \alpha4\beta7:
RPMI8866.
Ligando: Proteína de Fusión
MADCAM-Fc.
El biotinilado de la Proteína de Fusión
MADCAM-Fc se llevó a cabo de acuerdo con el
protocolo clásico (Cf: Amersham proximity news: Biotinylation
techniques...).
El medio de cultivo incluyendo todos los
suplementos se adquirió en LifeTech (Paris, Francia), [^{3}H]
metionina (TRK583, 85 Ci/mmol) y las perlas de SPA con
estreptavidina (RPNQ0007) se adquirieron en Amersham (Paris,
Francia).
Se cultivaron las células RPMI 8866 en RPMI 1640
con medio L-glutamina (Life Tech
Nº21875-0.34), Gentamicina 0,1 mg/ml, FBS 10%. Las
células se dividen cada 2-3 días. Usualmente
resuspendemos a una concentración de 0,4 millones/ml.
Se cultiva la línea celular humana RPMI 8866 (25
x 10^{6} células/50 ml) durante 18 horas en RPMI1640 libre de
metionina (LifeTech Nº11876-026) con 10% FBS y
gentamicina en presencia de 80 \muCi de [^{3}H] metionina. Se
lavan las células dos veces con 25 ml de PBS, se centrifugan a 1500
rpm durante 10 min. y se resuspenden en 10 ml de tampón de lisis
hipotónico (20 mM Hepes, 2 mM CaCl_{2}, 20 mM NaCl y 25 \mug/ml
de aprotinina) para 50 x 10^{6} células y se mantienen a
-80ºC.
Se mezclan las perlas de SPA con estreptavidina
con biot-MADCAM (12 \mug/mg perlas) durante 30
minutos a temperatura ambiente en tampón de ensayo (HBSS, 0,5 mM
Mn^{2+} (MnCl_{2}), 25 mM HEPES, pen/strep [1X], Complete^{TM}
libre de EDTA (inhibidor de Proteasas): un comprimido/50 ml de
tampón de ensayo (Boehringer Mannheim Nº1873580), 15% glicerol), se
centrifugan a 3000 rpm durante 5 minutos y se resuspenden en el
tampón de ensayo a 70 \mug/100 \mul/pocillo.
El ensayo de centelleo por proximidad se lleva a
cabo a temperatura ambiente en tampón de ensayo. Cada ensayo se
lleva a cabo en un volumen de reacción de 200 \mul conteniendo 0,7
mg/ml de perlas SPA recubiertas y 1,25 x 10^{6} cpm/ml de
membranas tritiadas. La señal no específica se determina en
presencia de concentraciones altas de anticuerpo bloqueante. Se
incuban las placas de microtitulación a temperatura ambiente durante
45 minutos en un agitador orbital y se realiza el conteo en un
contador de centelleo Wallac Microbeta^{TM}.
En conclusión, de acuerdo con los ejemplos
anteriores se creó una prueba SPA para \alpha4\beta7, usando
perlas con \alpha4\beta7 tritiado y MADCAM-1.
Esta prueba es muy robusta, tanto en el formato de 96 como de 384
pocillos y nos permite seleccionar rápidamente bibliotecas de
compuestos para ordenar inhibidores de la cavidad de unión de
MADCAM-1 con sensibilidad exquisita. Esta prueba no
necesita integrinas purificadas, se lleva a cabo usando extractos
crudos de células (transitoriamente transfectadas). Según nuestro
conocimiento, este es el primer ensayo eficaz descrito hasta el
momento para integrinas con la subunidad \beta7, el que abre
nuevas posibilidades para el desarrollo de moléculas activas. Las
moléculas activas aisladas u obtenidas así pueden usarse como
candidatos de fármacos, o implicarse en otros programas de
optimización, para diseñar bibliotecas de compuestos orientadas o
introducir otras modificaciones químicas.
Claims (22)
1. Un procedimiento para seleccionar o
identificar un compuesto que modula, inhibe o activa la actividad de
una integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7, que
comprende:
- -
- poner en contacto (i) una preparación de membrana marcada que comprende integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7 y un compuesto candidato con (ii) un material soporte que une integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7, respectivamente, por medio de un ligando de las mismas y contiene un centelleador,
- -
- evaluar la cantidad de integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7 unida al soporte, y
- -
- comparar la cantidad de integrina unida al soporte en presencia y en ausencia del compuesto candidato, y/o en presencia de un anticuerpo bloqueante, y seleccionar o identificar el compuesto que modula dicha cantidad.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 para
seleccionar o identificar un inhibidor de integrina
\alpha4\beta7.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 para
seleccionar o identificar un inhibidor de integrina
\alphaE\beta7.
4. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la preparación de membrana
es una célula entera o una preparación derivada de una célula entera
comprendiendo una fracción de membrana de la misma, en el que dicha
célula o fracción de membrana comprende integrina \alpha4\beta7
o \alphaE\beta7 o una parte funcional de las mismas.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el
que la preparación de membrana es un lisado celular.
6. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la preparación de membrana se
obtiene a partir de una célula recombinante que expresa integrina
\alpha4\beta7 o \alphaE\beta7 o una parte funcional de las
mismas.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el
que la célula recombinante expresa integrinas \alpha4\beta7 o
\alphaE\beta7 humanas, o una parte funcional de las mismas.
8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la preparación de
membrana está marcada radiactivamente, de más preferencia
tritiada.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el
que la preparación de membrana se marca radiactivamente cultivando
una célula en presencia de un aminoácido marcado radiactivamente
previamente a la preparación de la preparación de membrana.
10. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el material de soporte
comprende silicato de itrio, poliviniltolueno (PVT),
(poli)acrilamida, agarosa, sefarosa o poliestireno.
11. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 10,
en el que el soporte es una perla.
12. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el material de soporte está
recubierto con un ligando de integrina \alpha4\beta7 o
\alphaE\beta7.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que el soporte está recubierto con MADCAM-1 o una
parte funcional de la misma.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que el soporte está recubierto con E-cadherina o
una parte funcional de la misma.
15. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el centelleador es
difeniloxazol.
16. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende poner en contacto el compuesto candidato en un tampón de
ensayo con:
- 0,05-5 mg/ml de perlas
recubiertas con ligando, y
- 1 x 10^{4} a 5 x 10^{8} cpm/ml de
preparación de membrana marcada radiactivamente.
17. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la determinación de la
cantidad de integrina unida al material de soporte comprende la
determinación de la señal de centelleo del soporte.
18. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que se prueban varios compuestos candidato en paralelo.
19. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la etapa de poner en contacto los componentes se lleva a cabo
en una placa de microtitulación.
20. Un procedimiento de la reivindicación 1, para
seleccionar o identificar un compuesto que modula la actividad de
integrina \alpha4\beta7, que comprende:
- poner en contacto, en presencia o ausencia de
un compuesto candidato, (i) una preparación de membrana marcada que
comprende integrina \alpha4\beta7 o una parte funcional de la
misma con (ii) un material de soporte recubierto con
MADCAM-1 o una parte funcional de la misma que se
une selectivamente a \alpha4\beta7 contenida en dicha
preparación de membrana, comprendiendo dicho material de soporte un
centelleador, y
- evaluar el efecto del compuesto candidato en la
actividad de integrina \alpha4\beta7 comparando la señal de
centelleo en presencia y en ausencia del compuesto candidato y/o en
presencia de un anticuerpo bloqueante, los compuestos que modulan
dicha señal de centelleo representan compuestos que modulan dicha
actividad.
21. Un procedimiento de la reivindicación 1, para
seleccionar o identificar un compuesto que modula la actividad de
integrina \alphaE\beta7, que comprende:
- poner en contacto, en presencia o ausencia de
un compuesto candidato, (i) una preparación de membrana marcada que
comprende integrina \alphaE\beta7 o una parte funcional de la
misma con (ii) un material de soporte recubierto con
E-cadherina o una parte funcional de la misma que se
une selectivamente a \alphaE\beta7 contenida en dicha
preparación de membrana, comprendiendo dicho material de soporte un
centelleador, y
- evaluar el efecto del compuesto candidato en la
actividad de integrina \alphaE\beta7 comparando la señal de
centelleo en presencia y en ausencia del compuesto candidato y/o en
presencia de un anticuerpo bloqueante, los compuestos que modulan
dicha señal de centelleo representan compuestos que modulan dicha
actividad.
22. Un equipo para usar en la selección de
moduladores de integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7, que
comprende una preparación de membrana marcada comprendiendo
integrina \alpha4\beta7 o \alphaE\beta7 o una parte
funcional de las mismas y un material de soporte en el que el
material de soporte comprende un ligando que se une a integrinas
\alpha4\beta7 o \alphaE\beta7 o a una parte funcional de las
mismas y contiene un centelleador.
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