ES2661464T3

ES2661464T3 - Moléculas informadoras unidas a la membrana y su uso en clasificación de células

Info

Publication number: ES2661464T3
Application number: ES11813826.2T
Authority: ES
Inventors: Daniel Helman; Mira TOISTER-ACHITUV; Meirav BAR-SHIMON; Moshe Smolarsky
Original assignee: Merck Serono SA
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 2010-12-19
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2018-04-02
Anticipated expiration: 2031-12-19
Also published as: CA2821397C; US20140011213A1; US20180328925A1; AU2011346496A1; CA2821397A1; JP6159256B2; EP2652150A1; US11513120B2; EP2652150B1; WO2012085911A1; IL226761B; IL210093A0; AU2011346496B2; JP2014507121A

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende: (a) una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido señal, unido en su extremo C a (b) una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido mimético de biotina (BMP), unido en su extremo C a (c) una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un tramo polipeptídico que permite el anclaje del BMP a una membrana celular, en donde el BMP tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

Description

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pueden estar presentes codificando varias subunidades diferentes de una proteína de múltiples subunidades. Así, por ejemplo, una citoquina de interés estaría codificada por una única secuencia de ácidos nucleicos que codifica la POI mientras un IgG o IgM estaría codificado por dos o tres secuencias de ácidos nucleicos que codifican la POI, respectivamente.

En una realización de la descripción, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la POI es una secuencia de ácido nucleico que codifica la POI que codifica un único polipéptido, mientras que en otra realización de la descripción, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la POI comprende dos secuencias de ácidos nucleicos que codifican para diferentes subunidades de un anticuerpo. En muchos casos la proteína de interés se debe secretar al medio, y por tanto en esos casos se debe unir en su extremo amino, opcionalmente mediante un péptido enlazador, a un péptido señal.

La proteína de interés puede ser cualquier proteína que se pueda expresar en una célula eucariótica. Como ejemplos no limitantes, y para aclarar que proteínas se pueden considerar como proteínas de interés, la proteína de interés se selecciona del grupo que consiste en un producto de fusión Fc, un anticuerpo, una citoquina, una hormona, un factor de crecimiento, un neurotransmisor, una enzima, un ligando receptor, una sialomucina, una proteína nuclear, una proteína reguladora y una toxina, o una fracción funcional de las mismas, es decir, una fracción de la proteína que es a su vez un anticuerpo (por ejemplo un Fab), una citoquina, una hormona, un neurotransmisor, una enzima, un ligando receptor, una sialomucina o una toxina. Un producto de fusión Fc es una proteína expresada como una fusión a un péptido señal y el fragmento Fc de inmunoglobulina como el copartícipe de fusión en el extremo N o el extremo C, que facilita la expresión y la secreción de altos niveles de muchos diferentes tipos de POIs, como se describió anteriormente. El dominio Fc ayuda a mejorar la solubilidad de proteínas hidrofóbicas y proporciona un control para la fácil detección y purificación de las proteínas de fusión; y puede escindirse mediante tratamiento con proteasa, si se desea.

Se ha encontrado de acuerdo con la presente invención que las células altamente productoras que expresan varias proteínas de interés, tales como un producto de fusión Fc (sCD164-Fc), un anticuerpo (anti-IL22RA mAb), una hormona de crecimiento (factor estimulante de la colonia de granulocitos (GCSF)) o citoquina (IL6) y expresar altos niveles de estas proteínas pueden aislarse eficazmente por selección de células que expresan altos niveles de BMP en su superficie.

En otro aspecto más, la presente descripción describe un método para la selección de células eucarióticas que secretan una proteína de interés (POI), que comprende identificar células que presentan BMP en su superficie celular, en donde el nivel de la presentación de BMP en la superficie celular se correlaciona con la cantidad de POI secretada, el método comprende las etapas de:

(a) transfectar células con un vector que comprende

(i): una molécula de ácido nucleico que comprende la primera, segunda y tercera secuencias de ácidos nucleicos anteriores y una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la POI; o

(ii): una molécula de ácido nucleico que comporende ambas moléculas de ácido nucleico en el (i) anterior,

estableciendo así un conjunto estable de células transfectadas con BMP;

(b): marcar las células transfectadas con BMP con un resto unido a biotina detectable; e

(c): identificar y aislar las células transfectadas marcadas con el resto unido a biotina detectable.

En ciertas realizaciones de la descripción, cada una de dicha al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la POI está unida operativamente antes a una secuencia EMCV IRES y después a un promotor capaz de dirigir la transcripción de la molécula de ácido nucleico, o ambas.

Las células utilizadas para la producción de la proteína de interés pueden ser cualquier célula eucariótica susceptible a manipulaciones genéticas, tales como células de mamíferos, plantas, insectos o levaduras. Las células mamíferas pueden ser células de ovario de hámster chino (CHO), células NS0 de mieloma de ratón bebé, células de riñón de hámster (BHK), células de riñón embrionario humano (HEK), células de la retina humana, células COS, células SP2/0, células W138, células MRCS, células Per.C6. Las células vegetales pueden ser células de tabaco, zanahoria y arroz. En una realización de esta descripción, las células son células CHO.

En ciertas realizaciones de la descripción, las células se marcan poniéndolas en contacto con una proteína o resto de unión a biotina detectable seleccionada del grupo que consiste en avidina fluorescente y estreptavidina fluorescente y las células marcadas se identifican y aíslan después por medio de un FACS. Sin embargo, cualquier método se podría utilizar para identificar y aislar las células marcadas, por ejemplo, pero no limitado a, un método que utilice perlas recubiertas con restos de unión a biotina.

El método de la presente descripción proporciona una alta correlación entre la cantidad de producto del gen

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Sulfato de dextrano (Sigma, Cat. # D4911), DH5α bacteria competente, Life-Technologies Cat. # 18263-012 DMSO, Merck, Cat. # K31630931 Escalera de DNA: escalera de 1kb para DNA, Biolabs Cat No. # 3232L Escalera de DNA: escalera de 100 pares de bases para DNA, Biolabs Cat No. # 3231L Tampón de muestra de electroforesis LDS, Invitrogen, Cat. # NP0007, (USA). Etanol, Merck Cat. 00983.1000. FACS Accudrop Beads, BD, Cat.# MAB345249 Glucosa, Sigma, cat. # G7021 Glutamina, Sigma, cat. # G5972 Hispeed plasmid Maxi Kit, Quiagen GmbH, Germany, Cat. # 12663 HT Biological Industries Cat. # 03-085-1C Ácido clorhídrico 37%, Merck, Cat. # 1.00314. Ácido clorhídrico, Merck, cat. # UN-1789 1.00314.2500 LB + placas de ampicilina – Hy-Labs Cat. # PD178 Medio LB para crecimiento bacteriano – Hy-Labs Cat. # BP302/400S. Reactivo LipofectAmine, Gibco BRL Cat. # 18324-020. L-Metionina sulfoximina (MSX), Sigma Cat. # M5379 Sustrato luminogénico: ECL Amersham kit, Cat. # RPN2109. Metanol Merck Cat. # 1.06009.2500 Mgc12-1M, SIGMA, Cat. # M1028 Tampón de ejecución NuPAGE MOPS, X20, Invitrogen Cat. # NP0001 Tampón de transferencia NuPage, Invitrogen Cat. # NP0006-1 Tampón de ejecución NuPAGE Tris Glicina, X10, Invitrogen Cat. #LC2675 Fenol rojo, Sigma, Cat. # P0290 Plurónico F-68, Sigma Cat. # P5556 Monolaurato de polioxietilensorbitan (Tween 20), Sigma Cat. # P-1379 Proteína estándar marcadora pre-marcada Cat. # LC5925, Invitrogen Combinado inhibidor de proteasa, Sigma Cat. # P8340 Membrana de nitrato de celulosa pura BA-85, Schleicher & Schuell, 78x90 mm, Cat. # 401184. Puromicina, InvivoGen Cat. # ant-pr-1 Las muestras de referencia Anti-IL22RA (MSB0010074/C12) se obtuvieron a partir de EMD (GVA) 5,9 mg/ml en

PBS, pH 6,0). Las enzimas de restricción se adquirieron en New England Biolabs. Estreptavidina conjugada con R-ficoeritrina (SA-PE), 0,2 mg/ml, BioLegend, Cat. # 405203 (véase CoO en 9,3 y CoA

en 9,4). Leche desnatada en polvo, Fluka Cat. # 70166

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suplementado con 20 µg/ml de puromicina y MSX 25 µM y se permitió crecer hasta que la viabilidad de la célula fue >=90% y el número de células viables fue ≥ 70 x 106. En esta etapa se realizaron análisis de fluorescencia y el siguiente ciclo de clasificación. En general, se hicieron tres clasificaciones sucesivas.

Clonación por FACS ACDU. La clonación se realizó mediante el dispositivo de Unidad de Deposición Celular Automatizada (ACDU) del clasificador celular FACSAria, de células en crecimiento en ProCHO5 que contiene 20 µg/ml de puromicina y MSX 25 µM. 2 x 106 células se recogieron, se lavaron dos veces en PBS + 0,1% de ácido plurónico y se marcaron en 0,5 ml de SA-PE (BioLegend) a una concentración de 2 µg/ml (dilución 1:100). Las células se incubaron en una placa de 24 pocillos durante 30 minutos a 80 rpm a 37ºC. Después el marcaje, las células se recogieron, se lavaron dos veces en PBS + 0,1% de ácido Plurónico, se resuspendieron en 4 ml de PBS + 0,1% ácido Plurónico (concentración celular de ̴ 0,1-0,2 células/ml). Las células fluorescentes superiores al 2,5% se clonaron por el ACDU, en el modo de precisión “célula única”, en placas de 96 pocillos que contienen 180 µl/pocillo de una mezcla ACFM del 80% de C6366 de Sigma y 20% de ProCHO5 para células que se cultivaron en ProCHO5. Las placas se analizaron mediante Cellavista en el día 0 y después cada 2-3 días para la detección de pocillos con una colonia única. Dos semanas después de la clonación, los sobrenadantes de los pocillos en los que se detectó el crecimiento de la colonia, se muestrearon y se ensayaron por ELISA. Los pocillos que contienen > 1 colonia por pocillo se omitieron. Las células se recogieron de los pocillos con los títulos más altos y se transfirieron primero a matraces T25 conteniendo 4 ml de una mezcla de 50% de C6366 de Sigma y 50% de medio ProCHO5 sin agitación. De tres a cinco días después se añadieron 2-4 ml del 100% del medio ProCHO5 a los matraces T25 y las células se incubaron con agitación. De uno a tres días después se añadieron 8 ml de ProCHO5 y la suspensión se transfirió a matraces T80 (total de 87,5% de ProCHO5 y 12,5% de C6366). De uno a dos días después se añadieron 10 ml de medio fresco a las células. Las células se sembraron en 25 ml de medio fresco a 0,2 x 106 células/ml para otro ciclo de crecimiento. Para determinar la productividad específica de las células se sembraron a una concentración de 0,5 x 106 células/ml durante 24 horas a 37ºC en 50 tubos de filtro a 320 rpm.

ELISA para sCD164-Fc. Se empleó el siguiente procedimiento:

1.: Placas de microtitulación se recubrieron con 0,5 mg/ml con un anticuerpo monoclonal para CD164 en PBS y se incubaron durante una noche a ̴ 4ºC.

2.: Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado (PBS que contiene 0,05% de Tween 20).

3.: Las placas se bloquearon con un tampón de bloqueo (PBS que contiene 0,5% de I-Block), 200 µl/pocillo, durante 1 hora a 37ºC con agitación.

4.: Después del bloqueo, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y 100 ml de alícuotas de muestras ensayadas, curva estándar (0,78-50 ng/ml) y muestras de control en el tampón de ensayo (PBS que contiene 0,25% I-Block y 0,05% de Tween 20), se añadieron a las placas y se incubaron durante 60 minutos a 37ºC con agitación.

5.: Las placas se lavaron otra vez tres veces con tampón de lavado, y 100 ml del segundo anticuerpo se añadió a la fracción Fc (fragmento F(ab’)2 antihumano de cabra conjugado con HRP diluido 1:40.000 en el tampón de ensayo) en cada pocillo.

6.: Las placas se incubaron durante 60 minutos a 37ºC con agitación.

7.: Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y 100 ml de solución de sustrato (TMB) se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron 20 minutos a temperatura ambiente (sin agitación).

8.: La reacción se paró por la adición de 50 µl/pocillo de solución de parada (HCl 4N).

9.: La aborbancia se midió a 492 nm en un lector de ELISA.

10.: Las soluciones estándar se prepararon mediante diluciones en serie del Std. SCD164-Fc de 293 células HEK para proporcionar un intervalo de curva estándar de 0,78 a 50 ng/ml (el intervalo lineal estaba entre 0,78-12,5 ng/ml) en un tampón de ensayo. Una muestra de la recolección del crudo del conjunto de SCD164-Fc se diluyó con tampón de ensayo para obtener ̴ 10 ng/ml y se utilizó como muestra de control.

11.: Los resultados de los datos de densidad óptica se procesaron y los resultados se calcularon mediante el software Magelan.

12.: La dilución de las muestras, preparación de las series de dilución de la curva estándar, y distribución de las muestras en las placas se llevó a cabo mediante un procesador de muestras robótico.

ELISA para GCSF. Se empleó el siguiente procedimiento:

1. Placas de microtitulación se recubrieron con 1 µg/ml con un anticuerpo monoclonal para GCSF en PBS y se incubaron durante una noche a ̴ 4ºC.

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3.: Las placas se bloquearon con tampón de bloqueo (PBS que contiene 1% BSA), 200 µl/pocillo, durante 1 hora a 37ºC con agitación.

4.: Después del bloqueo, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y 100 ml de alícuotas de muestras ensayadas, curva estándar y muestras de control se añadieron a las placas y se incubaron durante 60 minutos a 37ºC con agitación.

5.: Las placas se lavaron otra vez tres veces con tampón de lavado, y 100 ml de solución de detección GCSF de anticuerpo antihumano biotinilado se añadieron a cada pocillo.

6.: Las placas se incubaron durante 60 minutos a 37ºC con agitación.

7.: Las placas se incubaron con un segundo anticuerpo, Estreptavidina HRP, siguiendo el mismo procedimiento descrito en las etapas 5-6 anteriores.

8.: Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado.

9.: 100 ml de solución de sustrato (TMB) se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron 20 minutos a temperatura ambiente (sin agitación).

10.: La reacción se paró mediante la adición de 50 µl/pocillo de solución de parada (HCl 3N).

11.: La absorbancia se midió a 492 nm en un lector de ELISA.

12.: Las soluciones estándar se prepararon mediante diluciones en serie del GCSF recombinante humano estándar para proporcionar una curva estándar de 1,56-100 ng/ml (el intervalo lineal estaba entre 3-50 ng/ml).

13.: Los resultados de los datos de densidad óptica se procesaron y los resultados se calcularon mediante el software Magelan.

14.: Un procesador de muestras robótico realizó la dilución de las muestras, la preparación de las series de dilución de la curva estándar, y la distribución de las muestras en la placa.

ELISA para IL-6. Se empleó el siguiente procedimiento:

1.: Placas de microtitulación se recubrieron con 1 mg/ml con un anticuerpo monoclonal para IL-6 en PBS y se incubaron durante una noche a ̴ 4ºC.

3.: Las placas se bloquearon con tampón de bloqueo (PBS que contiene 1% de BSA), 200 µl/pocillo, durante 1 hora a 37ºC con agitación.

4.: Después del bloqueo, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y 100 ml de alícuotas de muestras ensayadas, muestras de curvas estándar y muestras de control se añadieron a las placas y se incubaron durante 60 minutos a 37ºC con agitación.

5.: Las placas se lavaron otras tres veces con tampón de lavado, y 100 ml de anticuerpo de detección: anti-IL6 biotinilada, se añadieron a cada pocillo.

6.: Las placas se incubaron durante 60 minutos a 37ºC con agitación.

7.: Las placas se incubaron con un segundo anticuerpo, Avidina-HRP, siguiendo el mismo procedimiento descrito en las etapas 5-6 anteriores.

8.: Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado.

9.: 100 ml de solución de sustrato (TMB) se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente (sin agitación).

11.: La absorbancia se midió a 450 nm en un lector de ELISA.

12.: Las soluciones estándar se prepararon mediante diluciones en serie del estándar de referencia IL6 para proporcionar una curva estándar de 31,75-2.000 pg/ml (el intervalo lineal estaba entre 31,75-500 pg/ml).

13.: Los resultados de los datos de densidad óptica se procesaron y los resultados se calcularon mediante el software Magelan. Un procesador robótico realizó las diluciones de las muestras, la preparación de las series de

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dilución de la curva estándar, y la distribución de las muestras en la placa.

Recogida de la cosecha del cultivo celular Anti-IL22AR para análisis. Las células productoras (0,5 x 106) se sembraron en 20 ml de medio ProCHO5 en 50 tubos de filtro y se cultivaron durante 24 horas a 37ºC en un agitador a 320 rpm. La cosecha se centrifugó y se filtró a través de un filtro de 0,22 µm. El sobrenadante clarificado se analizó mediante el ensayo de ELISA seguido por el ensayo de transferencia de Western.

ELISA para Anti-IL22. Se empleó el siguiente procedimiento:

1.: Placas de microtitulación se recubrieron con 100 µl por pocillo de 2,0 µg/ml de IgG antihumano de cabra (H+L) en un tampón de recubrimiento y se incubaron durante una noche a ̴ 4ºC en una caja húmeda. Las placas se almacenaron a -20ºC durante 3 meses después de la incubación de una noche.

2.: Las placas se lavaron cuatro veces con tampón de lavado (PBS que contiene 0,05% de Tween 20).

3.: Las placas se bloquearon con tampón de bloqueo (1% de BSA en PBS-T al 5%), 200 µl/pocillo, durante 1 hora a temperatura ambiente.

4.: Después del bloqueo, las placas se lavaron cuatro veces con tampón de lavado y 100 ml de alícuotas de muestras ensayadas, la curva estándar (1,56-100 ng/ml) y las muestras de control en el tampón de ensayo (1% de leche en PBSx1). Las placas se cubrieron con un sellador de placas y se incubaron durante 60 minutos a 37ºC sin agitaión.

5.: Las placas se lavaron otra vez cuatro veces con tampón de lavado, y 100 µl del segundo anticuerpo IgG antihumano de cabra Fab HRP diluido 1:100.000 en un tampón de ensayo) se añadieron a cada pocillo.

6.: Las placas se incubaron durante 60 minutos a 37ºC.

7.: Las placas se lavaron cuatro veces con tampón de lavado y 100 µl de solución sustrato (TMB) se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron 15-20 minutos a temperatura ambiente (sin agitación).

8.: La reacción se paró mediante la adición de 100 µl/pocillo de solución de parada (HCl 1N).

9.: La absorbancia se midió a 450 nm en un lector ELISA.

10.: Las disoluciones estándar se prepararon mediante diluciones en serie del Std. Anti IL22RA MSB0010074/C12 en PBS, pH 6,0 para proporcionar un intervalo de curva estándar de 1,56 a 100 ng/ml (el intervalo lineal estaba entre 1,56 a 50 ng/ml) en el tampón de ensayo. Una muestra de la recolección del crudo del conjunto relevante se diluyó con tampón de ensayo para obtener ̴ 25 ng/ml y se utilizó como una muestra de control.

12.: La dilución de las muestras, preparación de las series de dilución de la curva estándar, y la distribución de las muestras en la placa se llevó a cabo mediante un procesador de muestras robótico.

Análisis SDS-PAGE/transferencia de Western. Las muestras de los sobrenadantes clarificados de los clones anti-IL22RA en medio ProCHO5 se diluyeron en un tampón de muestra SDS PAGE. Las muestras de clones anti-IL22RA (0,1 µg por carril para ELISA) se separaron en geles de SDS-PAGE al 10% Bis Tris bajo condiciones no reductoras. El estándar de proteína MW premarcado (15 mcl) se cargó también en el gel. La electroforesis se llevó a cabo a un voltaje constante (100 V) durante ̴ 2 horas con un sistema de electroforesis Novex Xcell SureLock Mini-Cell. Al final de la ejecución del SDS PAGE las proteínas se transfirieron desde el gel a una membrana de nitrocelulosa en un módulo de transferencia con un tampón de transferencia utilizando un suministro de potencia ajustado a 35 voltios durante 1 hora. La membrana se lavó con PBS-0,05% de Tween 20 durante 5 minutos, seguido por la incubación con tampón de bloqueo durante una noche a 4ºC. La membrana se incubó con los siguientes anticuerpos diluidos en tampón de trabajo, durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación: a) IgG Fc HRP antihumano de cabra b) cadena ligera kappa antihumana de cabra seguido por HRP de asno anti-cabra. La membrana se lavó después en PBS-0,05% Tween 20 tres veces durante 5 minutos cada vez. Las bandas se visualizaron por incubación en reactivo ECL durante 1 minuto seguido por la exposición de una película en un revelador “Mini-Medical” del procesador de película de rayos X AFP. Después de desarrollar la película se escaneó.

Ejemplo 1. Diseño de Plataforma

El diseño de la plataforma para la evaluación de los niveles de expresión de BMP y BAP en la superficie celular se creó primero con la proteína informadora localizada en un casete de expresión individual para asegurar una suficiente expresión y permitir la evaluación de la expresión (Fig. 1; vectores MB-065, MB-066 & MB-067). Después de la verificación de la expresión de la proteína informadora y la detección en la superficie celular por FACS, nuevos vectores que contienen BMP se construyeron con un enlace estrecho entre los genes informadores basados en BMP y los GOI en un mRNA bicistrónico. Los plásmidos estaban compuestos de los GOIs dirigidos por el potente

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promotor humano de CMV (hCMV) y el gen informador estaba localizado después del EMCV IRES. Esta arquitectura dispone la transcripción de ambos genes en el mismo mRNA [47] (Fig. 1; vectores MB-070, MB-076).

La molécula informadora contenía una proteína o péptido unida a la membrana y un resto informador (BMP o BAP). La primera proteína unida a la membrana estaba compuesta por el CD59a de ratón, que es una pequeña proteína de 101 aminoácidos [27] anclada a través de su C terminal al lado externo de la membrana celular por glicosil fosfatidilinositol (GPI) [40] (vectores MB065, MB066, MB-070-MB072 en la Fig. 1). La secuencia de ácidos nucleicos de la construcción BMP-CD59a es como se expone en SEQ ID NO: 10. Alternativamente, se creó un péptido sintético de 60 aminoácidos (SEQ ID NO: 1), con dos sitios potenciales de N-glicosilación, que estaba anclado a la membrana celular a través del dominio TM del receptor IGF-1 de ratón (SEQ ID NO: 2; vector MB-073 & MB-075; Fig. 1) o un dominio de anclaje GPI de CD48 (los restos Cis se reemplazaron por Ser; SEQ ID NO: 3; vectores MB074 & MB-076; Fig. 1). La predicción de la secuencia del dominio TM se realizó mediante el servidor TMHMM v.2.0,

[32] y la secuencia de anclaje GPI se realizó mediante la predicción de sitios de modificación GPI [33, 36]. El extremo N de la proteína o péptido de membrana o la señal de anclaje GPI se unen mediante un enlazador a la BMP que codifica la secuencia de aminoácidos de CHPQGPPC [22, 23] (SEQ ID NO: 5) o la BAP que codifica la secuencia de aminoácidos de GLNDIFEAQKIEWHE [24] (SEQ ID NO:13).

Las células transfectadas con vectores que contienen BMP se marcaron directamente con estreptavidina marcada fluorescentemente (F-SA, Fig. 2A). Se requirió el marcaje de las células que expresan BAP antes de la biotinilación de este péptido informador. Esto se logró mediante la cotransfección de las células con secuencia BirA optimizada con CHO [27] para obtener la biotinilación in vivo por la propia célula (datos no mostrados) [27-29, 31, 48] o por biotinilación in vitro de BAP en la superficie celular por la adición de la enzima bacteriana BirA exógenamente [30, 49] (Fig. 2B).

La plataforma se amplió con el fin de seleccionar de manera estricta las células que producen altos niveles del gen de interés mediante la fusión de BMP con el gen de resistencia PAC. El BMP-PAC permite la selección de puromicina después de la transfección seguida de la selección FACS de acuerdo con los niveles de BMP. Se construyó un plásmido para la expresión de un anticuerpo modelo, compuesto de dos casetes de expresión uno para la cadena pesada y uno para la cadena ligera. La expresión de la cadena pesada es dirigida por el potente promotor CMV IE2 murino (mCMV IE2) y el gen informador se localiza después en un EMCV IRES. La expresión de la cadena ligera es dirigida por el promotor CMV IE1 murino (mCMV IE1) y un marcador de selección QSy (glutamina sintetasa) se localiza después en otro EMCV IRES. Esta arquitectura dicta la transcripción de la cadena pesada y los genes BMP-PAC en un único mRNA y la transcripción de la cadena ligera y el QSy en otro mRNA [47] (Fig. 3; vector MB98).

La molécula de selección del informador contiene: la BMP precedida por un péptido señal derivado de una molécula CD59a murina. La BMP se une en su C terminal a un péptido sintético de 60 aminoácidos, con dos sitios potenciales de N-glicosilación. Este portador sintético se une a un dominio TM del receptor IGF-I de ratón. El dominio TM se une al gen de resistencia de selección PAC mediante un enlazador corto (Fig. 2C, Fig. 3; vector MB-098). La predicción de la secuencia del dominio TM se realizó mediante el servidor TMHMM v.2.0. La BMP está codificada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

El PAC en esta construcción específica está unido a la membrana celular. Por lo tanto, el PAC debe contener una actividad de N acetilación eficiente como una proteína unida a membrana, que es diferente de su estado citoplásmico natural.

Ejemplo 2. Construcción de los vectores de expresión

Para este proyecto se construyeron tres conjuntos de vectores en diferentes estados del proyecto:

En el primer conjunto el péptido mimético de biotina (BMP), el péptido aceptor de biotina (BAP) y los genes BirA se clonaron en vectores directamente después del promotor hCMV. Estos vectores se utilizaron inicialmente para probar el nivel de expresión de BMP y BAP en la superficie celular y la capacidad para detectar estos marcadores con estreptavidina fluorescente (F-SA) por FACS, y en experimentos posteriores como vectores de control. El segundo conjunto de vectores contenía el casete BMP-CD59-GPI después del EMCV IRES uniendo así el marcador de selección FACS al GOI de una manera más estrecha y directa que en los vectores utilizados anteriormente. El tercer conjunto contenía un portador peptídico sintético en lugar del CD59a de ratón (que incluye GPI), anclado a la membrana celular a través de los dominios GPI o TM (Fig. 1). Como un marcador de selección, el gen PAC se insertó en el vector después del promotor SV40, dando como resultado un PAC citosólico en las células transfectadas.

Todos los vectores se construyeron de acuerdo con procedimientos conocidos como se muestra por ejemplo en F.

M. Ausubel y colaboradores [50].

Ejemplo 3. Evaluación de las moléculas informadoras para la clasificación de células altamente productoras POI.

3.1 Expresión y detección de las moléculas informadoras en la superficie celular.

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La generación de células que expresan GOI y BMP o GOI y BAP o GOI y BAP y BirA se realizó por las transfecciones de plásmidos LipofectAmine en células CHO-S seguido por la selección con puromicina o puromicina y zeocina en células cotransfectadas con plásmido que contienen BirA.

Los conjuntos estables se analizaron para los niveles de expresión de los genes informadores. El nivel de BAP se analizó después de la biotinilación por el BirA añadido exógenamente y marcado después con F-SA (Fig. 4) o biotinilación intracelularmente en aquellas células cotransfectadas con BirA, seguido de marcaje con F-SA (datos no mostrados).

El nivel de BMP se analizó directamente mediante la unión de F-SA. Los resultados muestran la señal de fluorescencia específica de las moléculas informadoras en las células transfectadas sin antecedentes significativos en las células no transfectadas y no marcadas (Fig. 5A).

En la Fig. 5, las células CHO-S, no transfectadas y transfectadas con plásmidos que contienen BMP-CD59a directamente después del promotor hCMV (A) o después de EMCV IRES (B) se marcaron, o no se marcaron con F-SA y se analizaron para sus niveles de marcado fluorescente por FACS. El nivel de fluorescencia de la BMP marcada con estreptavidina (Fig. 5) es menor que la de BAP marcada con estreptavidina (Fig. 4).

La posible razón para la diferencia en la intensidad del marcaje fluorescente de las células marcadas con BMP y BAP podría residir en la afinidad significativamente menor del péptido mimético de biotina por la estreptavidina frente a la biotina natural en el caso del BAP (varios ordenes de magnitud). A pesar de esta diferencia, se obtuvo una alta intensidad de marcaje de las células que expresan BMP, significativamente por encima de los antecedentes para permitir la clasificación de las células marcadas por FACS.

Dos picos con baja y alta fluorescencia se ven en las células transfectadas y marcadas (Figs. 5A-B; curvas --··--). Estos dos picos probablemente indican expresadores de BMP bajos y altos. Se especula que los expresadores bajos expresan también bajos niveles de PAC incluso aunque el PAC se localice en casetes de expresión separados. Sin embargo el nivel de PAC es suficiente para que las células sobrevivan bajo la presión de selección de puromicina.

3.2 Clasificación y generación de células altamente productoras. Las células se transfirieron con un vector que contiene tres diferentes GOIs (sCD164-Fc, GCSF, IL-6) y la quimera de BMP-CD59a (vectores MB-070, MB-071, MB-072), el portador GPI del péptido BMP (vectores MB-074 & MB-076) o el portador TM del péptido BMP (vectores MB-073 & MB-075) (Figs. 6-12) donde el GOI y BMP se localizan en el mismo casete de expresión bicistrónico separado por un EMCV IRES. Los conjuntos estables generados po bio-selección con puromicina (expresado en un casete diferente) se analizaron para los niveles de expresión de las moléculas informadoras por FACS y los GOIs por ELISA específico.

Los dos picos con fluorescencia baja y alta se ven en células transfectadas y marcadas (Figs. 6-12; curvas --· · --). Esos dos picos indican expresadores de BMP bajos y altos. Se especula que los expresadores expresan también bajos niveles de PAC. Es probable que el nivel de PAC sea suficiente para que las células sobrevivan bajo la presión de selección de puromicina pero la expresión de BMP y posiblemente también el nivel de POI de esas células es baja.

En todos los casos (Figs. 6-12) se detectaron los niveles significativos de BMP así como de GOIs. Las células se marcaron con F-SA y las células con fluorescencia más alta del 4% se clasificaron. Las células clasificadas se propagaron y analizaron para determinar los niveles de BMP y GOIs. El procedimiento de clasificación y los análisis se repitieron sucesivamente tres veces. En todas las clases, la mayor población expresada de BMP se enriqueció, y como consecuencia, el nivel de productividad del GOI fue elevado (Se observó una correlación positiva entre los niveles de expresión de GOI y BMP) (Fig. 6 a Fig. 12).

Ejemplo 4. Construcción de los vectores de expresión que codifican para un producto de fusión PAC informador.

4.1 Construcción del vector MB-098 (Fig 3) – El vector MB-098 se construyó de acuerdo con procedimientos conocidos como se muestra por ejemplo en F. M. Ausubel y colaboradores. [50].

4.2 Generación de conjuntos estables que contienen BMP-PAC informadores, evaluación de la actividad de PAC y análisis de la productividad. Las células CHO-S transfectadas en ProCHO5 con el vector que contiene BMP-PAC se sometieron a la selección con 20 µg/ml de Puromicina (Invivogen, Cat. # ant-pr-1) y MSX 25 µM (Sigma Cat. # M5379). Bajo estas condiciones surgieron células estables que indican que el PAC está activo en la forma unida a la membrana. Los conjuntos estables expresan el mAb anti-IL22RA con una productividad específica de 8,5-9,4 de PCD (Fig. 13).

4.3 Clasificación y generación de conjuntos productores altos que contienen BMP-PAC informadores. Las células estables se analizaron y clasificaron por FACS en medio ProCHO5 (Fig. 14). Losl análisis muestran que se detecta BMP en los conjuntos transfectados. Se ven dos subpoblaciones antes de las clasificaciones, que expresan los niveles de BMP altos y bajos. Las clasificaciones consecutivas realizadas mediante la selección de las células expresoras de BMP superiores al 4% dieron como resultado una elevación de PCD que se correlacionó con los

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niveles de BMP. El resumen de los resultados se ven en la Tabla 1. Tabla 1: Resumen de los resultados de clasificación utilizando BMP y BMP-PAC*.

Informador: GOI MFI antes de las clasificaciones MFI después de las clasificaciones PCD antes de las clasificaciones PCD después de las clasificaciones

BMP-CD59**: sCD164-Fc 1.734 18.995 1,6 7,3

BMP-CD59**: GCSF 10.406 17.676 3,8 6,6

BMP-CD59**: IL-6 246 3.642 0,3 6,6

BMP-IGF1-R-TM**: GCSF 4.449 47.367 3,1 12,0

BMP-CD48-GPI**: GCSF 2.326 28.679 3,0 13,0

BMP-IGF1-R-TM**: sCD164-Fc 680 9.113 1,1 12,0

BMP-CD48-GPI**: sCD164-Fc 773 20.908 0,8 10,8

BMP-IGF1-R-TM-PAC**: Anti-IL22RA mAb 4.449 17.367 3,1 12,0

*Se muestran los resultados de la intensidad de fluorescencia media (MFI) y los niveles de POI antes y después de tres clasificaciones.

**Las células transfectadas se cultivaron en medio ProCHO5

Las células estables (3 réplicas) transfectadas con un vector que contenía mAb anti-IL22RA y BMP-PAC en ProCHO5 (Fig. 14) se seleccionaron en 20 µg/ml de Puromicina y MSX 25 mM y se combinaron en conjuntos unidos. Las células se analizaron para el nivel de BMP (línea roja). Los conjuntos se clasificaron sucesivamente tres veces de acuerdo con sus niveles de BMP marcados con F-SA. Después de cada ciclo de clasificación las células se recuperaron y se determinó la fluorescencia así como la productividad. Los valores del nivel de fluorescencia y productividad se muestran en la breve descripción de la Fig. 14.

3.5. Clonación de los conjuntos clasificados por el dispositivo FACS ACDU – aislamiento de clones.

Después de los tres ciclos de clasificación consecutivos, las células fluorescentes superiores a ̴ 4% de anti-IL22RA mAb que producen los conjuntos # 2418UN-Hx3 en ProCHO5 se clonaron por medio del dispositivo de Unidad de Deposición Celular Automatizada (ACDU) del FACSAria, que permite la clonación de células únicas en placas de 96 pocillos. La clonación de las células cultivadas en ProCHO5 + 20 mg/ml de puromicina y 25 µM/ml de MSX se realizó en placas de 96 pocillos que contienen un 80% de medio C6366 y 20% de C6614. Las colonias se detectaron por Cellavista el día de la siembra y después cada 2-3 días. Los pocillos con más de una colonia se descartaron. Desde la clonación en adelante los medios de cultivo no contenían puromicina.

Se tomaron muestra de los sobrenadantes de 358 pocillos y se analizaron para la productividad (título) mediante ELISA (Fig. 15). Cuarenta clones derivados del conjunto con los títulos más altos se transfirieron primero a matraces T25 y después a tubos de 25 ml para evaluar la productividad específica (Fig. 16). Los mejores 15 clones derivados de ambos conjuntos se cultivaron con MSX 25 µM para la evaluación de la productividad en tubos de 50 ml (Fig. 17).

3.6 Identificación del producto proteico en el medio de cultivo celular crudo por SDS PAGE/ transferencia de Western. Los clones candidato se cultivaron en medio ProCHO-5. El producto producido por estos clones en el medio de cultivo celular crudo se analizó (Fig. 18) por SDS PAGE/transferencia de Western. La detección de los productos se realizó con anticuerpos para Fc humano y para las subunidades de cadena kappa ligera de mAb anti-IL22RA (A y B respectivamente).

Los resultados muestran que el producto intacto (heterodímero), con el peso molecular aparente de ̴ 150 kDa se identificó para ambos anticuerpos. Además, la cadena ligera libre secretada por todos los clones candidatos (monómero y dímero de acuerdo con el peso molecular aparente) se observó en las transferencias de Western marcada con el anti-LC (Figs. 18B y 19B).

El peso molecular del heterodímero en el medio de cultivo celular crudo de todos los clones se ajusta al del producto purificado de la muestra de referencia de mAb anti-IL22RA. No se encontró diferencia significativa en los pesos

Claims

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