JP2009261371A - 細胞の表層にビオチンを提示した微生物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、ビオチンを細胞表層に提示する微生物を提供し、この微生物は、ビオチン化酵素を菌体内で発現し、そして該ビオチン化酵素の認識配列を有するアクセプターペプチドを細胞表層に発現し、それにより該アクセプターペプチドのリジンがビオチン化されてビオチンが表層に提示されている。本発明はさらに、アミノ酸からなる分子だけでなく任意の分子を含む目的分子を微生物の細胞表層に提示する方法を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、細胞表層にビオチンが提示されている微生物を提供する。この微生物は、ビオチン化酵素および該ビオチン化酵素の認識配列を有するアクセプターペプチド(ビオチンアクセプターペプチドともいう;以下、簡潔に「BAP」とも称する)を共発現している。より詳細には、ビオチン化酵素が菌体内または分泌発現し、そしてBAPが細胞表層に提示される。このようなBAPおよびビオチン化酵素の共発現により、ビオチン化酵素によりBAPにビオチンが付加され、その後ビオチンが付加されたBAPが細胞表層に提示される。
ビオチンはストレプトアビジンまたはアビジンと非常に強い相互作用を有する。したがって、本発明によれば、ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンとの相互作用を利用して、ビオチンを細胞表層に提示する微生物によって目的分子を細胞表層に提示する方法が提供される。ビオチンを細胞表層に提示する微生物は、遺伝子操作によって作製することのできない非天然の分子であってもその細胞表層に提示することを可能とする。
BirAを細胞内に発現し、かつビオチン化ペプチドが表層に提示された酵母を得るために、以下の手順を行った。まず、酵母細胞内にBirA(大腸菌由来ビオチンリガーゼ)を発現させるためのベクターを構築した。配列番号2に記載のForwardプライマーおよび配列番号3に記載のReverseプライマーを用いて大腸菌ゲノムをテンプレートにしてPCRを行い、BirA遺伝子とFLAGコード断片との連結物を増幅した。pRS406プラスミド(Stratagene社より入手)をベースにして、酵母の2μmプラスミドの複製開始点(Ori)およびColE1の複製開始点、酵母選択マーカーTRP1、および大腸菌選択マーカーのアンピシリン耐性遺伝子を備え、PGKプロモーターで発現できるプラスミドpGK404を調製した。このプラスミドpGK404、および、BirA遺伝子とFLAGコード断片との連結物のそれぞれをNheIおよびBglIIで切断し、ライゲーションした。最終的に得られたベクターpGK404-BirAの模式図を図1(A)に示す。ベクターpGK404-BirAは、BirA−FLAGを菌体内発現する組み込み型のベクターである。ベクターpGK404-BirAをEcoRVで切断して、酵母サッカロマイセス・セレビシエYPH499株を酢酸リチウム法により形質転換した。
比較のために、pGK404-BirAのみで形質転換した酵母(比較例1)およびpFGK426-BAPのみで形質転換した酵母(比較例2)も調製した。
まず、形質転換酵母の培養液5mlからの細胞を超音波処理によって細胞破砕し、得られた上清を1000×gにて25℃で5分間遠心分離し、全細胞タンパク質画分を得た。この全細胞タンパク質画分を、一次抗体としてマウス抗FLAG IgG抗体(Sigma社より入手)および二次抗体としてアルカリホスファターゼ(AP)標識抗マウスIgG抗体(Promega社より入手)を用いるウェスタンブロッティングに供し、BirAおよびBAPの発現について分析した。その結果を図2の左側の電気泳動写真として示す。この電気泳動写真において、レーン1は未形質転換酵母(「YPH499」)、レーン2は比較例2の形質転換酵母(「BAP」)、レーン3は比較例1の形質転換酵母(「BirA」)、そしてレーン4は実施例1の形質転換酵母(「BAP+BirA」)の結果を示す。Mは分子量マーカーである。BirAおよびBAPの発現は、100kDaと75kDaとの間の位置にBAP−FLO428のバンドおよび37kDaの位置にBirAのバンドが現れることにより判断した。これにより、実施例1の形質転換酵母(「BAP+BirA」)が、BirAおよびBAPを発現していることが確認できた。
形質転換酵母をYPDA培地(酵母エキス−ペプトン−デキストロース−アデニン培地)、3ml中で30℃にて18時間培養し、酵母培養液を15μl採取し洗浄した。次いで、この酵母培養液に、ストレプトアビジン−フルオロセインイソシアネート(FITC)(Sigma社より入手)の終濃度が20μg/mlになるように加え、1時間静置した後洗浄し、これを顕微鏡で観察した。
形質転換酵母をYPDA培地3ml中で30℃にて18時間培養し、酵母培養液を15μl採取し洗浄した。次いで、この酵母培養液に、ストレプトアビジンを終濃度20μg/mlになるように加え、1時間静置した後洗浄した。さらにビオチン−FITC(PIERCE社より入手)を終濃度が0.01μg/mlになるように加え、1時間静置した後洗浄し、これを顕微鏡で観察した。
表層提示用のベクターpHLA、および、実施例1において記載したように調製したBAPをコードする遺伝子とFLAG遺伝子との連結物のそれぞれをBamHIおよびHindIIIで切断し、ライゲーションした。得られたベクターは、HCEプロモーター、PgsA遺伝子断片、およびBAPをコードする遺伝子とFLAGコード断片との連結物を含む。このベクターで大腸菌novablueをエレクトロポレーション法により形質転換した。得られた菌体を24時間培養し、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)1mlで3回洗浄した。次いで、この菌体を300μlのPBSに懸濁し、そして抗FLAG−FITC(Sigma社より入手)を約5μg/mlになるように、あるいはストレプトアビジン−FITCを約5μg/mlになるように添加し、30分間振盪した。次いで、PBSで洗浄し、蛍光活性化細胞選別(FACS)で解析し、細胞表層におけるFLAGおよびビオチンの存在を調べた。対照として、形質転換していない大腸菌を用いた。
Claims (9)
- ビオチンを細胞表層に提示する微生物であって、ビオチン化酵素を発現し、そして該ビオチン化酵素の認識配列を有するアクセプターペプチドを細胞表層に発現するように組み換えられて、それにより該アクセプターペプチドのリジンがビオチン化されてビオチンが細胞表層に提示されている、微生物。
- 前記ビオチン化酵素が、大腸菌由来ビオチンリガーゼであり、そして前記ビオチン化酵素の認識配列が、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列GLNDIFEAQKIEWHEである、請求項1に記載の微生物。
- 前記微生物が酵母または大腸菌である、請求項1または2に記載の微生物。
- 目的分子を微生物の細胞表層に提示する方法であって、請求項1から3のいずれかに記載の微生物および該目的分子を結合したストレプトアビジンまたはアビジンを混合する工程を含む、方法。
- 目的分子を微生物の細胞表層に提示する方法であって、請求項1から3のいずれかに記載の微生物、該目的分子を結合したビオチン、およびストレプトアビジンまたはアビジンを混合する工程を含む、方法。
- 目的分子を細胞表層に提示する微生物を生成する方法であって、請求項1から3のいずれかに記載の微生物および該目的分子を結合したストレプトアビジンまたはアビジンを混合する工程を含む、方法。
- 目的分子を細胞表層に提示する微生物を生成する方法であって、請求項1から3のいずれかに記載の微生物、該目的分子を結合したビオチン、およびストレプトアビジンまたはアビジンを混合する工程を含む、方法。
- 請求項6に記載の方法により生成された、目的分子を細胞表層に提示する微生物。
- 請求項7に記載の方法により生成された、目的分子を細胞表層に提示する微生物。
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