ES2230542T3 - Inhibidor del factor de crecimiento celular endotelial vascular. - Google Patents

Abstract

LOS INHIBIDORES DEL FACTOR DEL CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) DE LA INVENCION SON FORMAS SOLUBLES QUE SE PRODUCEN NATURALMENTE O DE FORMA RECOMBINANTE CON O SIN UNA REGION DE TRANSMEMBRANA DE TERMINAL C DEL RECEPTOR PARA EL VEGF, UN FACTOR DE CRECIMIENTO MUY SELECTIVO PARA LAS CELULAS ENDOTELIALES. LAS FORMAS SOLUBLES DE LOS RECEPTORES SE UNIRAN AL FACTOR DE CRECIMIENTO CON UNA ALTA AFINIDAD PERO NO DARAN COMO RESULTANDO UNA TRANSDUCCION DE SEÑAL. ESTAS FORMAS SOLUBLES DE LOS RECEPTORES SE UNEN AL VEGF E INHIBEN SU FUNCION.

Description

Inhibidor del factor de crecimiento celular endotelial vascular.

Antecedentes de la descripción

Recientemente se ha identificado una nueva clase de mitógenos diméricos derivados de células con selectividad por las células endoteliales vasculares, y se ha denominado factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF). El VEGF se ha purificado a partir de medio de crecimiento condicionado de células de glioma de rata [Conn y col., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87, págs. 2628-2632]; y medio de crecimiento condicionado de astrositos del folículo pituitario bovino [Ferrara y Henzel, (1989), Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, págs. 851-858; Gozpadorowicz y col., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 86, págs. 7311-7315] y medio de crecimiento condicionado de células U937 humanas [Connolly, D. T. y col., (1989), Science, 246, págs. 1309-1312]. El VEGF es un dímero con un peso molecular aparente de aproximadamente 46 kDa, teniendo cada subunidad un peso molecular aparente de aproximadamente 23 kDa.

El VEGF tiene algunas similitudes estructurales con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), que es un mitógeno para las células del tejido conectivo, pero no es mitogénico para las células endoteliales vasculares de los vasos grandes.

Se mostró que el receptor de tirosina cinasa unido a la membrana, conocido como FLT, era un receptor del VEGF [DeVries, C. y col., (1992), Science, 255, págs. 989-991]. El receptor FLT une específicamente el VEGF, que induce la mitogenia. Otra forma del receptor del VEGF, denominada KDR, también se sabe que une el VEGF e induce la mitogenia. También se conoce la secuencia parcial del ADNc y casi la totalidad de la secuencia de proteínas del KDR [Terman, B. I. y col., (1991) Oncogene 6, págs. 1677-1683; Terman, B. I. y col., (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, págs. 1579-1586].

La angiogénesis persistente puede causar o exacerbar ciertas enfermedades, tales como psoriasis, artritis reumatoide, hemangiomas, angiofibromas, retinopatía diabética y glaucoma neovascular. Un inhibidor de la actividad del VEGF sería útil como tratamiento en dichas enfermedades y otras angiogénesis patológicas y estados de permeabilidad vascular inducidas por el VEGF, tales como la vascularización tumoral.

Resumen de la descripción

Se identificó y clonó un ARN mensajero (ARNm) natural del FLT a partir de células endoteliales vasculares. Se muestra que este ARNm codifica para la mayoría de la porción extracelular, o soluble, del receptor del VEGF, el FLT. Las moléculas del receptor solubles, incluyendo las formas que contienen una región transmembrana C terminal, también son diseñadas recombinantemente para este y otros receptores del VEGF. Estos receptores solubles, que comprenden formas truncadas y modificadas, son expresados en células hospedadoras recombinantes y tienen propiedades de unión al VEGF. Las proteínas del receptor solubles son útiles como inhibidores de la actividad del VEGF, dado que unirán el VEGF disponible evitando que active sus receptores funcionales en las células endoteliales vasculares, y podrían formar heterodímeros no funcionales con receptores de membrana del VEGF completos anclados.

Específicamente, la invención, en sus varios aspectos, proporciona una molécula de ácido nucleico purificado que codifica para una proteína soluble inhibidora del VEGF, comprendiendo dicha proteína la secuencia de aminoácidos según se establece en la ID SEC Nº 6;

un vector de expresión para expresar una proteína soluble inhibidora del VEGF en una célula hospedadora recombinante en el que dicho vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína soluble inhibidora del VEGF, comprendiendo dicha proteína la secuencia de aminoácidos según se establece en la ID SEC Nº 6;

una célula hospedadora que expresa una proteína recombinante soluble inhibidora del VEGF, en la que dicha célula hospedadora contiene el vector de expresión según se definió anteriormente;

un procedimiento para la expresión de una proteína soluble inhibidora del VEGF, que comprende:

(a)

transfectar el vector de expresión definido anteriormente en una célula hospedadora adecuada, y

(b)

cultivar las células hospedadoras en unas condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína soluble inhibidora del VEGF a partir de dicho vector de expresión; y

una proteína soluble inhibidora del VEGF en una forma sustancialmente pura que comprende la secuencia de aminoácidos según se establece en la ID SEC nº 6.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 - un diagrama esquemático de los receptores completos del VEGF (FLT y KDR); los receptores solubles del VEGF (sVEGF-RI y sVEGF-RII) y los receptores solubles que contienen la región transmembrana C terminal (sVEGF-RTMI y sVEGF-RTMII) se muestran con los dominios proteicos de cada uno.

Figura 2 - se muestra la secuencia de ADN del receptor del VEGF/inhibidor del VEGF del sVEGF-RI soluble.

Figura 3 - se muestra la secuencia de aminoácidos del receptor del VEGF/inhibidor del VEGF del sVEGF-RI soluble.

Figura 4 - se muestra la demostración de que las células hospedadoras recombinantes expresan el sVEGF-RI mediante la formación de complejos de alto peso molecular del sVEGF-RI y [^{125}I]VEGF, y separados mediante cromatografía de exclusión por tamaños.

Figura 5 - se muestra un gel electroforético de poliacrilamida al 12,5% que demuestra el alto grado de pureza obtenido para el sVEGF-RI.

Figura 6 - se muestran los productos entrecruzados del sVEGF-RI y [^{125}I]VEGF, a aproximadamente 145 kDa y a aproximadamente 245 kDa.

Figuras 7A y 7B - análisis de la unión del VEGF al sVEGF-RI (A) y la correspondiente representación de Scatchard (B).

Figura 8 - se demuestra la inhibición de la unión de [^{125}I]VEGF a HUVEC por parte del sVEGF-RI.

Figura 9 - se muestra la inhibición de la mitogenia mediada por el VEGF en HUVEC usando sVEGF-RI.

Figura 10 - se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica para el sVEGF-RII.

Figura 11 - se muestra la secuencia de aminoácidos del sVEGF-RII.

Figura 12 - se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica para el sVEGF-RTMII.

Figura 13 - se muestra la secuencia de aminoácidos del sVEGF-RTMII.

Figura 14 - se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica para el sVEGF-RTMI.

Figura 15 - se muestra la secuencia de aminoácidos del sVEGF-RTMI.

Figura 16 - se muestra un diagrama del pmFLT.

Figura 17 - se muestra un diagrama del pKDRA.

Descripción detallada de la descripción

La presente invención trata de un ADNc que codifica para una proteína soluble del receptor del VEGF (sVEGF-R) que se aísla a partir de células productoras del receptor del VEGF o se diseña recombinantemente a partir del ADN que codifica para el receptor del VEGF. El sVEGF-R, según se usa en esta invención, se refiere a una proteína que puede unirse específicamente al factor de crecimiento celular endotelial vascular sin estimular la mitogenia de las células endoteliales vasculares.

La secuencia de aminoácidos del FLT es conocida, [Shibuya, M. y col., (1990), Oncogene, 5, págs. 519-524] y corresponde al receptor tirosina cinasa completo del VEGF asociado a células. Se sabe que existen otros receptores del VEGF. Otros receptores del VEGF conocidos incluyen, pero no se limitan a, KDR [Terman (1991), supra., y Terman (1992), supra.]. Algunas células de mamífero capaces de producir FLT, KDR y otros receptores del VEGF incluyen, pero no se limitan a, células endoteliales vasculares. Las líneas celulares de mamífero que producen FLT o KDR y otros receptores del VEGF incluyen, pero no se limitan a, las células endoteliales humanas. Las células preferibles para la presente invención incluyen células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC).

También pueden ser adecuadas para su uso para aislar ADNc de sVEGF-R otras células y líneas celulares. La selección de las células adecuadas puede realizarse mediante un cribado en busca de una actividad de unión del sVEGF-R en las superficies celulares, en extractos celulares o en medio condicionado, o mediante el cribado en busca de la expresión del gen mediante PCR o hibridación. Los procedimientos para detectar la actividad del receptor soluble son bien conocidos en la materia [Duan, D-S. R. y col., (1991) J. Biol. Chem., 266, págs. 413-418] y medir la unión del VEGF marcado. Las células que poseen actividad de unión al VEGF en este ensayo pueden ser adecuadas para el aislamiento del ADNc del sVEGF-R.

Las células que producen FLT completo, tales como las células HUVEC humanas (American Type Culture Collection, ATCC CRL 1730) [Hoshi, H. y McKeenan, W. L., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., (1984) 81, págs. 6413-6417] se hacen crecer según las condiciones de cultivo recomendadas de la ATCC. En la Figura 1 se muestran receptores FLT y KDR del VEGF completos, así como la región extracelular (sVEGF-RI y sVEGF-RII) y las formas de la región extracelular más la región transmembrana (sVEGF-RTMI y sVEGF-RTMII). El receptor completo tiene una región extracelular de unión al ligando compuestas por aproximadamente siete dominios de tipo inmunoglobulina, una secuencia que se extiende por la membrana (dominio transmembrana) y dominios de tirosina cinasa intracelulares. Las formas inhibidoras de este receptor, que son el sujeto de la presente invención, también se muestran en la Figura 1, y carecen de los dominios cinasa intracelulares, y para algunos inhibidores, la secuencia transmembrana y el dominio extracelular del C terminal más del tipo Ig.

Puede usarse cualquiera de una variedad de procedimientos para clonar molecularmente el ADNc del sVEGF-R. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, la expresión directa funcional del gen del sVEGF-R después de la construcción de una genoteca de ADNc que contiene el sVEGF-R en un sistema vector de expresión adecuado.

Otro procedimiento es cribar una genoteca de ADNc que contiene el sVEGF-R construida en un vector lanzadera bacteriófago o plásmido con una sonda oligonucleotídica marcada diseñada a partir de la secuencia de aminoácidos predicha del sVEGF-R. El procedimiento preferible consiste en cribar un genoteca de ADNc que contiene el sVEGF-R construida en un vector lanzadera bacteriófago o plásmido, con un ADNc parcial que codifique para al menos parte de la proteína del FLT completa. Este ADNc parcial se obtiene mediante la amplificación especifica por PCR de fragmentos de ADN del sVEGF-R a través del diseño de cebadores oligonucleotídicos a partir de la secuencia conocida del ADN completo que codifica para el FLT.

Es fácilmente apreciable por los expertos en la materia que otros tipos de genotecas, así como las genotecas construidas a partir de otras células o tipos celulares, pueden ser útiles para aislar el ADN que codifica para el sVEGF-R. Otros tipos de genotecas incluyen, pero no se limitan a, genotecas de ADNc derivadas de otras células o líneas celulares distintas a las HUVEC, y genotecas de ADN genómico.

Es fácilmente apreciable por los expertos en la materia que las genotecas de ADNc adecuadas pueden prepararse a partir de células o líneas celulares que tienen actividad sVEGF-R. La selección de las células o líneas celulares para su uso en la preparación de una genoteca de ADNc para aislar un ADNc del sVEGF-R puede realizarse en primer lugar midiendo la actividad del sVEGF-R secretado, usando el ensayo de unión al VEGF descrito en su totalidad en esta invención.

La preparación de genotecas de ADNc puede realizarse mediante técnicas estándar conocidas en la materia. Algunas técnicas conocidas de construcción de genotecas de ADNc pueden encontrarse, por ejemplo, en Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1982).

También es fácilmente apreciable por los expertos en la materia que el ADN que codifica para el sVEGF-R también puede aislarse a partir de una genoteca de ADN genómico adecuada. La construcción de genotecas de ADN genómico puede realizarse mediante técnicas estándar conocidas en la materia. Algunas técnicas conocidas de construcción de genotecas de ADN genómico pueden encontrarse en Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1982).

Otro medio de obtener moléculas de sVEGF-R es diseñarlas recombinantemente a partir del ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos parcial o completa de un receptor del VEGF. Algunos ejemplos de otros receptores del VEGF incluyen, pero no se limitan a, KDR. Usando técnicas de ADN recombinante, se construyen moléculas de ADN que codifican para al menos una porción del receptor del VEGF capaz de unir el VEGF sin estimular la mitogenia. Se usan técnicas de ADN recombinante estándar, tales como las encontradas en Maniatis, y col., supra.

Usando uno de los procedimientos preferibles de la presente invención, los clones de ADNc que codifican para el sVEGF-R se aíslan en una metodología de dos etapas empleando una tecnología basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el cribado de una genoteca de ADNc. En la primera etapa, los oligonucleótidos de ADN derivados de la secuencia de información del dominio extracelular a partir de FLT, el KDR u otro receptor completo conocido del VEGF se usan para diseñar cebadores oligonucleotídicos degenerados para la amplificación de los fragmentos de ADN específicos del sVEGF-R. En la segunda etapa, estos fragmentos se clonan para servir como sondas para el aislamiento del ADNc completo del sVEGF-R a partir de una genoteca de ADNc lambda gt10 disponible comercialmente (Clontech) derivada de células HUVEC (ATCC CRL 1730).

Estos productos derivados de la PCR se usaron como sondas de hibridación para cribar una genoteca de ADNc lambda gt10 derivada de HUVEC (Clontech). La preparación y el cultivo en placas de Petri y la réplica de las placas de la genoteca se realizaron mediante procedimientos estándar (T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1982). Las sondas se cebaron y marcaron aleatoriamente con ^{32}P-dCTP para una alta actividad específica, y se realizó un cribado separado de la genoteca (1 x 10^{6} placas por cribado) para cada sonda. Las sondas se añadieron a tampón de hibridación (50% de formamida, 5 x Denhardt, 6 x SSC (1 x SSC = NaCl 0,15 M, Na_{3}citrato\cdot2 H_{2}O 0,015 M, pH 7,0), 0,1% de SDS, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón) a 1 x 10^{6} cpm/ml.

Se detectaron cuatro fagos que hibridaban positivamente usando la sonda específica para flt. Se observó que estos fagos que hibridaban positivamente eran menores que el flt completo.

Dos clones de ADNc de flt de aproximadamente 2,0 kb y 2,7 kb de longitud se subclonaron en vectores pGEM (Promega) y se secuenciaron bidireccionalmente en su totalidad mediante el método de terminación de la cadena (Sanger y col., (1977) P.N.A.S. EE.UU., 74, págs. 5463-5467) y mostraron contener un único marco abierto de lectura de aproximadamente 569 aminoácidos. El análisis de la secuencia demostró que una porción de la región codificante 5' del flt estaba ausente en estos clones. El remanente del extremo 5' se clonó usando una PCR y se combinó con el ADN de los clones que carecían del extremo 5', para rendir un único marco abierto de lectura que codificaba para aproximadamente 687 aminoácidos.

La secuencia del ADNc que codifica para el sVEGF-RI derivado del flt se muestra en la Tabla 1, y fue identificada en los clones 7 y 11. La secuencia de aminoácidos deducida del sVEGF-RI a partir del ADNc clonado se muestra en la Tabla 2. La inspección de la secuencia de aminoácidos deducida revela la presencia de un único y extenso marco abierto de lectura de 687 aminoácidos. Por comparación con la secuencia de aminoácidos del receptor completo FLT del VEGF, hay 31 aminoácidos codificados en el extremo C terminal del ADNc que son diferentes de los del FLT.

Usando otro de los procedimientos preferibles de la presente invención, el ADN que codifica para el sVEGF-R se construye a partir de una secuencia de ADN que codifica para un receptor del VEGF. A modo de ilustración, se utilizó el ADN que codifica para el receptor del VEGF conocido como KDR. Usando la secuencia de ADN del receptor, se construye una molécula de ADN que codifica para el dominio extracelular del receptor, o sólo para el dominio de unión al VEGF, y se denomina sVEGF-RII. Los sitios de escisión de la endonucleasa de restricción son identificados dentro del ADN del receptor y pueden ser utilizados directamente para escindir la porción codificante extracelular. Además, pueden utilizarse las técnicas por PCR según se describió anteriormente para producir la porción deseada de ADN. Es fácilmente apreciable por los expertos en la materia que pueden utilizarse otras técnicas, que son estándares en la materia, para producir moléculas de sVEGF-R de una forma análoga a las descritas anteriormente. Dichas técnicas se encuentran en, por ejemplo, Maniatis y col., supra.

Se construyen formas truncada adicionales del receptor del VEGF que contienen la región transmembrana. La retención de la transmembrana puede facilitar la orientación de la molécula inhibidora en la superficie de la célula diana. Algunos ejemplos de regiones transmembrana que contienen moléculas inhibidoras incluyen, pero no se limitan a, los mostrados en la Figura 1. Según se muestra en la Figura 1, el sVEGF-RTMI y el sVEGF-RTMII están relacionados respectivamente con FLT y KDR, regiones transmembrana que contienen inhibidores del receptor. La construcción de moléculas que contienen regiones transmembrana, tales como sVEGF-RTMI y sVEGF-RTMII, se realiza mediante técnicas estándar conocidas en la materia, incluyendo, pero no limitándose a, la conveniente utilización de sitios de escisión de endonucleasas de restricción o las técnicas por PCR según se describe en esta invención. Los expertos en la materia comprenden fácilmente que pueden construirse varias formas de los inhibidores de un receptor del VEGF, según se describe en esta invención, que contienen únicamente la región extracelular o que contienen, además, la región transmembrana, que tengan sustancialmente la misma actividad.

El ADNc clonado del sVEGF-R obtenido a través de los procedimientos descritos anteriormente puede expresarse recombinantemente mediante la clonación molecular en un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción adecuados, y transferirse a células hospedadoras procariotas o eucariotas para producir sVEGF-R recombinante. Las técnicas para dichas manipulaciones se describen en su totalidad en Maniatis, T., y col., supra, y son conocidas en la materia.

Los vectores de expresión se definen en esta invención como secuencias de ADN que son requeridas para la transcripción de copias clonadas de genes y la traducción de sus ARNm en un hospedador adecuado. Dichos vectores pueden usarse para expresar genes eucariotas en una variedad de hospedadores tales como bacterias, algas verdeazuladas, células fúngicas, células de levadura, células vegetales, células de insectos y células animales.

Los vectores diseñados específicamente permiten el intercambio de ADN entre hospedadores tales como bacteria-levadura o bacteria-animal o bacteria-células de insecto. Un vector de expresión construido adecuadamente debería contener: un origen de replicación para la replicación autónoma en células hospedadoras, marcadores seleccionables, un número limitado de sitios de enzimas de restricción útiles, un potencial para un elevado número de copias y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige la ARN polimerasa para que se una al ADN e inicie la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es aquel que causa que los ARNm se inicien a una elevada frecuencia. Los vectores de expresión pueden incluir, pero no se limitan a, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos o virus diseñados específicamente.

Puede usarse una variedad de vectores de expresión de mamíferos para expresar el sVEGF-R recombinante en células de mamífero. Algunos vectores de expresión de mamíferos disponibles comercialmente que pueden ser adecuados para la expresión del sVEGF-R recombinante incluyen, pero no se limitan a, pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pd-BPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) y gZD35 (ATCC 37565).

El ADN que codifica para el sVEGF-R también puede clonarse en un vector de expresión para su expresión en una célula hospedadora recombinante. Las células hospedadoras recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, incluyendo, pero no limitándose a, bacterias, levaduras o células de mamíferos, incluyendo, pero no limitándose a, líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, de mono o de roedor, y células de insectos, incluyendo, pero no limitándose a, líneas celulares derivadas de Drosophila, polilla, mosquito y gusano de la polilla. Las líneas celulares derivadas de especies de mamíferos que pueden ser adecuadas y que están disponibles comercialmente incluyen, pero no se limitan a, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CCL 171). Las líneas celulares de insectos que pueden ser adecuadas y que están disponibles comercialmente incluyen, pero no se limitan a, 3M-S (ATCC CRL 8851), polilla (ATCC CCL 80), mosquito (ATCC CCL 194 y 195; ATCC CRL 1660 y 1591) y gusano de la polilla (Sf9, ATCC CRL 1711).

El vector de expresión puede ser introducido en las células hospedadoras mediante cualquiera de varias técnicas incluyendo, pero no limitándose a, trasformación, trasnfección, fusión de liposomas o protoplastos y electroporación. Las células que contienen el vector de expresión se propagan clonadamente y se analizan individualmente para determinar si producen la proteína del sVEGF-R. La identificación de los clones de células hospedadoras que expresan el sVEGF-R puede realizarse mediante numerosos medios, incluyendo, pero no limitándose a, reactividad inmunológica con anticuerpos anti-sVEGF-R, unión a VEGF radiomarcado y la presencia de actividad de sVEGF-R secretado por la célula hospedadora.

La expresión del ADN del sVEGF-R también puede realizarse usando ARNm sintético producido in vitro. El ARNm sintético puede ser traducido eficazmente en varios sistemas libres de células, incluyendo, pero no limitándose a, extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos, así como traducirse eficazmente en sistemas basados en células, incluyendo, pero no limitándose a, microinyección en ovocitos de rana, siendo preferible la microinyección en ovocitos de rana.

Los niveles de proteína del sVEGF-R producida por las células hospedadoras pueden cuantificarse mediante inmunoafinidad y/o técnicas de afinidad de ligandos. Se usan perlas de afinidad específicas para el sVEGF-R o anticuerpos específicos para el sVEGF-R para aislar la proteína del sVEGF-R marcada o ^{35}S-metionina o no marcada. La proteína del sVEGF-R marcada se analiza mediante SDS-PAGE. La proteína del sVEGF-R no marcada se detecta mediante inmunotransferencia Western, ensayos ELISA o RIA que emplean anticuerpos específicos para el sVEGF-R o mediante inmunotransferencia de ligandos con VEGF marcado.

Después de la expresión del sVEGF-R en una célula hospedadora recombinante, la proteína del sVEGF-R puede recubrirse para proporcionar un sVEGF-R en su forma activa, capaz de unirse al VEGF sin estimular la mitogenia. Hay disponibles y adecuados para su uso numerosos procedimientos de purificación del sVEGF-R. El sVEGF-R puede purificarse a partir de lisados y extractos de células, o a partir de medio de cultivo condicionado, mediante diversas combinaciones, o la aplicación individual, de fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de adsorción sobre hidroxilapatito, cromatografía en fase inversa, cromatografía de sefarosa heparina, cromatografía de afinidad del ligando del VEGF y cromatografía de interacciones hidrófobas.

Además, el sVEGF-R recombinante puede separarse de las otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad hecha con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para el sVEGF-R completo o fragmentos de polipéptidos del sVEGF-R.

Identificación del sVEGF-RI - en un intento de clonar el ADNc del receptor del VEGF (flt), se cribó una genoteca de ADNc de HUVEC \lambdagt10 con una sonda de ADN derivada del dominio extracelular de la forma unida a la membrana o completa de este receptor, según se muestra en la Figura 1. Se aislaron cuatro clones incompletos, todos carentes de varios tramos de la secuencia codificante 5', a partir de un cribado de un total de 1 x 10^{6} placas. Dos de estos aislados representan clones parciales que eran idénticos al flt completo, uno de los cuales contenía la región codificante 3' completa de la forma descrita por Shibuya y col., supra. Los otros dos clones eran idénticos al flt completo hasta el par de bases número 2219 (Tabla 1 y Figura 2), donde divergieron entonces a partir de un flt completo. Estos clones (clon 7 y clon 11) codificaban para 31 aminoácidos únicos adicionales antes que el marco abierto de lectura sea terminado por el codón TAA (Tabla 2 y Figura 3).

Los clones 7 y 11 codificaban para una proteína con un peso molecular predicho de aproximadamente 75 kDa que contenía 12 sitios de glucosilación opcionales unidos a N. Esta versión del receptor carecía de los dominios transmembrana y de cinasa intracelular, y codificaba por tanto para una forma natural soluble del receptor del VEGF (sVEGF-RI). Además, la molécula proteica predicha por el sVEGF-RI tiene únicamente los primeros seis dominios de tipo Ig, careciendo del más cercano a la secuencia transmembrana (Figura 1). Los 31 aminoácidos en el extremo C terminal del sVEGF-RI contienen dos residuos de cisteína, pero no se parecen al dominio Ig.

Expresión del sVEGF-RI en células Sf9 - para analizar la unión y las propiedades biológicas de esta forma del receptor, la proteína se expresó usando un sistema de expresión de un baculovirus. El clon 7 carecía de aproximadamente 350 pares de bases de la secuencia codificante en el extremo 5'. Esta región se clonó mediante PCR usando los cebadores descritos anteriormente y en el Ejemplo 1. Se construyó un clon que contenía la región codificante completa del sVEGF-RI combinando el fragmento de PCR 5' con el clon 7 del sVEGF-RI, que se superponía en el sitio SacI. El sitio EcoRI 5' se cambió entonces a un sitio BamHI, y el sVEGF-RI completo se clonó en pBluebac III (Invitrogen) como un fragmento BamHI/BamHI. Entonces se preparó, según se describe en esta invención, una reserva de baculovirus P-3 recombinante que contenía el gen del sVEGF-R en 3' en relación con el promotor de la polihedrina.

Los medios de cultivo de infecciones a pequeña escala se ensayaron para comprobar la capacidad de formar complejos de elevado peso molecular con [^{125}I]VEGF. El ligando marcado y el medio de cultivo de células infectadas por el baculovirus se combinaron y se incubaron. Entonces se analizaron las reacciones mediante cromatografía de exclusión por tamaños. Cuando el medio de cultivo natural infectado se mezcló con el ligando radioactivo (Figura 4) se observó un único pico radioactivo. Sin embargo, cuando se usó el medio de cultivo del sVEGF-R infectado, se formó un complejo de elevado peso molecular, como se evidencia mediante la aparición de un segundo pico en esta reacción, eluyendo cerca del volumen vacío de la columna. Este experimento mostró que la forma natural soluble del receptor FLT del VEGF, sVEGF-RI, forma una complejo de elevado peso molecular con el VEGF.

El sVEGF-R producido recombinantemente se purifica a partir de los extractos de células hospedadoras recombinantes o fluidos de cultivos celulares usando una cromatografía en columna de heparina-sefarosa, que se une específicamente a la proteína del sVEGF-R. La columna con la heparina-sefarosa unida al sVEGF-R se lava usando un tampón adecuado que contiene NaCl entre 0,1 M y 0,6 M, que elimina las proteínas contaminantes sin una pérdida significativa del sVEGF-R. El sVEGF-R se eluye desde la columna de heparina-sefarosa usando un tampón adecuado que contiene NaCl aproximadamente 1 M, rindiendo un sVEGF-R sustancialmente purificado.

Unión del sVEGF-RI al VEGF - la unión del VEGF marcado con ^{125}I al sVEGF-RI se caracterizó mediante entrecruzamiento y mediante la formación de un complejo con el sVEGF-RI adsorbido en una placa de 96 pocillos.

Los productos de entrecruzamiento se muestran en la Figura 6. El sVEGF-RI se entrecruzó con [^{125}I]VEGF (carril 1); en presencia de VEGF no marcado (carril 2) y bFGF no marcado (carril 3). Se formaron dos bandas de elevado peso molecular (aproximadamente 145 kDa y 245 kDa) en la reacción que contenía sVEGF-RI y [^{125}I]VEGF, y en la reacción que contenía sVEGF-RI y [^{125}I]VEGF más un exceso de reacción de bFGF no marcado. Las dos bandas de elevado peso molecular no estaban presentes cuando el sVEGF-RI se incubó con [^{125}I]VEGF más un exceso de VEGF no marcado, demostrando la especificidad del sVEGF-RI por el VEGF y la capacidad del sVEGF-RI de formar un dímero. La banda de 145 kDa es, presumiblemente, un complejo entrecruzado que contiene una molécula del receptor (aproximadamente 100 kDa) y un dímero de VEGF (aproximadamente 46 kDa). Según se muestra en la Figura 6, también se observaron complejos que contenían dos moléculas de receptor (aproximadamente 245 kDa). Esto sugiere que cada dímero de VEGF puede unirse a una o dos moléculas de receptor, y que la forma soluble del receptor del VEGF puede sufrir una dimerización inducida por ligando.

La afinidad del sVEGF-RI por el VEGF se evaluó adsorbiendo el sVEGF-RI a la superficie de una placa de 96 pocillos, seguido del bloqueo de los sitios no específicos con un 0,5% de gelatina. Se añadieron cantidades variables de ligando marcado a cada pocillo. Estos resultados demuestran que el sVEGF-RI se une al VEGF con una elevada afinidad, con una K_{d} aparente de aproximadamente 20 pM (Figura 7). Dado que la forma soluble del receptor carece del dominio Ig próximo a la región que abarca la transmembrana, este dominio no es requerido para la unión del ligando.

Se demuestra que el sVEGF-RI inhibe la unión del VEGF a las HUVEC incubando HUVEC cultivadas con [^{125}I]VEGF y varias cantidades de sVEGF-RI. Después de la incubación, las células se lavan para eliminar el [^{125}I]VEGF no unido. Entonces las células se solubilizan y se determina la cantidad de ^{125}I asociado a las células mediante un contador gamma, que muestra la cantidad de [^{125}I]VEGF que fue capaz de unirse al receptor del VEGF celular en presencia de sVEGF-RI. Usando este procedimiento, se muestra que el sVEGF-RI fue capaz de inhibir la unión del [^{125}I]VEGF al receptor del VEGF de las HUVEC (véase la Figura 8).

Dado que el sVEGF-RI fue capaz de inhibir la unión del VEGF a los receptores celulares, se determinó entonces que el sVEGF-RI podría inhibir la mitogenia inducida por el VEGF. Las células se preincuban con sVEGF-RI y después se incuban con VEGF en presencia de [^{3}H]timidina. Después de la incubación, se mide la cantidad de [^{3}H]timidina incorporada al ADN celular, lo que indica si el VEGF ha inducido mitogenia y causado que la [^{3}H]timidina sea incorporada al ADN celular. La presencia del sVEGF-RI inhibe la capacidad del VEGF de estimular la mitogenia, según se muestra en la Figura 9.

El inhibidor de la presente invención puede usarse para la inhibición de la actividad del VEGF. El inhibidor puede usarse tópicamente o intravascularmente. Para las aplicaciones tópicas, la formulación se aplicaría directamente a una tasa de aproximadamente 10 ng hasta aproximadamente 1 mg/cm^{2}/día. Para aplicaciones intravenosas, el inhibidor se usa a una tasa de aproximadamente 1 \mug hasta aproximadamente 10 mg/kg/día de peso corporal. Para su uso interno, la formulación puede ser liberada directamente en la región a tratar, bien desde un material polimérico de liberación lenta implantado o bien desde bombas de liberación lenta o inyecciones repetidas. La tasa de liberación en cualquier caso es de aproximadamente 100 ng hasta aproximadamente 100 \mug/día/cm^{3}.

Para su aplicación no tópica, el inhibidor del VEGF se administra en combinación con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, tales como tampón de fosfato, disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y similares, en una composición farmacéutica, según la práctica farmacéutica estándar. Para su aplicación tópica, son útiles varias formulaciones farmacéuticas para la administración del compuesto activo de esta invención. Dichas formulaciones incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: ungüentos, tales como vaselina hidrófila o ungüentos de polietilenglicol; pastas, que pueden contener gomas, tales como goma xántica; disoluciones, tales como disoluciones alcohólicas o acuosas; geles, tales como geles de hidróxido de aluminio o de alginato sódico; albúminas, tales como albúminas humanas o animales; colágenos, tales como colágenos humanos o animales; celulosas, tales como alquil celulosas, hidroxialquil celulosas y alquilhidroxialquil celulosas, por ejemplo, metil celulosa, hidroxietil celulosa, carboximetil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa e hidroxipropil celulosa; polaxámeros, tales como polioles de Pluronic®, ejemplificado por Pluronic® F-127; tetrónicos, tales como tetrónico 1508; y alginatos, tales como alginato sódico.

Los siguientes ejemplos se proporcionan como ilustrativos de la presente invención, sin limitarse, sin embargo, la misma a los mismos.

Ejemplo 1

Clonación del sVEGF-RI relacionado con el flt - se obtuvo una sonda de ADN de 580 pares de bases para el flt mediante PCR de la genoteca del fago de HUVEC usando los cebadores 5' GCACCTTGGTTGTGGCTGAC 3' (ID SEC Nº 1) y 5' TGGAATTCGTGCTGCTTCCTGGTCC 3' (ID SEC Nº 2). El fragmento de ADN resultante se clonó en pGEM3Z como un fragmento XbaI/EcoRI. La sonda se preparó mediante el método del cebado aleatorio [Feinberg, A. P. y Vogelstein, B., (1983) Anal. Biochem., 132, págs. 6-13] usando el kit de megacebado (Amersham) a una actividad específica de 1 x 10^{7} cpm/ng. La genoteca de ADNc de las HUVEC se preparó en placas de Petri a una densidad de 5 x 10^{4} placas/150 cm de placa, y después se cribaron aproximadamente 1 x 10^{6} placas mediante hibridación, según se describió anteriormente [Maniatis, T. y col., supra]. En resumen, después de una prehibridación a 42ºC durante 2 horas en 50% de formamida, 5 x SSC, 5 x disolución de Denhart, 0,1% de SDS, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón (tampón de hibridación), los filtros se hibridaron con la sonda durante 16 horas a 42ºC en tampón de hibridación. Los filtros se lavaron una vez durante 15 min a temperatura ambiente con 2 x SSC y después tres veces a 55ºC con 0,1 x SSC. Se identificaron cuatro placas positivas, y se recribaron dos veces adicionales para obtener aislados homogéneos. Los insertos se clonaron en pGEM3Z para el análisis de la secuencia de ADN. Se identificaron dos de estos clones, que contenían menos que la región codificante flt completa. El análisis de la secuencia del ADN mostró que estos clones carecían de la región codificante 5' del flt. La secuencia de ADN se muestra en la Tabla 1 y la Figura 2, y la secuencia de aminoácidos deducida se muestra en la Tabla 2 y la Figura 3. El extremo 5' del flt se clonó mediante PCR usando los cebadores 5' GGAATTCCGCGCTCACCATGGTCAGC 3' (ID SEC Nº 3) y 5' TTTGAATTCACCCGGCAGGGAATGACG 3' (ID SEC Nº 4). El fragmento de PCR generado con este conjunto de cebadores se clonó en el clon 7 de flt como un fragmento EcoRI/SacI.

TABLA 1

1

2

3

4

5

TABLA 2

6

7

8

9

Ejemplo 2

Expresión del sVEGF-RI en células de insecto Sf9 - se clonó la secuencia codificante completa del sVEGF-RI como un fragmento EcoRI/BamHI en pGEM3Z. El sitio EcoRI se modificó entonces a un sitio BamHI y se clonó en pBlueBac III 3' del promotor de la polihedrina (psFLTblue). Este plásmido se transfectó en células Sf9 del gusano de la polilla usando liposomas. Después de 48 horas, el medio de las células transfectadas, que contiene las partículas de virus de polihedrina recombinante, se recogió. Se prepararon diluciones del virus (10^{3}-10^{4} veces) y se purificaron en placas con agar blando que contenía 150 \mug/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido. Las placas recombinantes se identificaron mediante el color azul y se usaron para infectar células Sf9 (5 x 10^{5} células/pocillo) en placas de 12 pocillos. Se usó medio de polihedrina infecciones menos (100 \mul) para preparar reservas víricas P-2 infectando 2,5 x 10^{6} células en un matraz T-25. Entonces se prepararon reservas víricas P-3 de título alto a gran escala infectando células Sf9 (500 ml a 2 x 10^{6} células/ml) con 5 ml de la reserva P-2, y después se incubó a 27ºC durante 5-6 días, y el medio se recogió mediante centrifugación. La expresión proteica se consiguió infectando células a una densidad de 2-2,5 x 10^{6} células/ml con una multiplicidad de infección de 5-10. Veinticuatro horas después de la infección, las células se cambiaron a medio libre de suero (SF900II, Gibco BRL), se incubaron durante 48 horas adicionales y el medio se recogió. Este medio condicionado contiene la proteína del sVEGF-RI expresada recombinantemente.

Ejemplo 3

Yodación del VEGF - se preparó VEGF recombinante humano marcado con ^{125}I mediante el método de la cloramina T (Hunter, W. M. y Greenwood, F. C., (1962) Nature (Londres), 194, págs. 495-496). En resumen, 1 \mug de VEGF en 30% de acetonitrilo/0,1% de ácido trifluoroacético se ajustó a pH 7,1 mediante la adición de 1/3 de volumen de tampón de fosfato sódico 0,4 M, pH 7,1. Se añadió cloramina T disuelta recientemente (4 \mul de una reserva de 2 mg/ml en tampón de fosfato sódico 0,1 M, pH 7,1) a la disolución de VEGF, y se hizo reaccionar durante 45 segundos a temperatura ambiente (volumen total de 150 \mul). Esta reacción se detuvo mediante la adición de 50 \mul de KI 10 mM y 50 \mul de metabisulfito de 2 mg/ml. El ligando marcado se separó del ^{125}I libre mediante filtración en gel en una columna de Sephadex G-25 de 0,7 x 15 cm equilibrada con PBS con 1 mg/ml de gelatina. Las fracciones se contaron con un contador Packard \gamma, se alicuotaron y se almacenaron a -70ºC. El VEGF se marcó a una actividad específica de 5 x 10^{5} a 1 x 10^{6} cpm/ng.

Cromatografía de filtración en gel - se formó un complejo receptor-ligando incubando 10 \mul de VEGF marcado con ^{125}I (10^{5} cpm) con 100 \mul de medio de cultivo de células Sf9 naturales o infectadas con baculovirus que contienen sVEGF-RI hasta el día siguiente a temperatura ambiente. Los productos de reacción se separaron en una columna de filtración en gel Sephacryl S200 (0,7 x 25 cm) equilibrada con PBS, 1 mg/ml de gelatina, a una tasa de flujo de 15 ml/h. Las fracciones (0,75 ml) se recogieron y se analizaron con un contador \gamma. Los complejos receptor-ligando pasaron rápidamente a través de la columna, mientras que el VEGF libre marcado la atraviesa más lentamente. Los resultados de este experimento, mostrados en la Figura 4, muestran la formación de un complejo de elevado peso molecular entre el VEGF marcado y la proteína del sVEGF-RI. Esto demuestra que el sVEGF-RI une el VEGF.

Entrecruzamiento - se añadió sVEGF-RI purificado (1-10 ng) a 25 \mul de tampón de unión (medio de Eagle modificado con Dulbecco (DME), HEPES 25 mM, pH 7,5, 0,3% de gelatina), y se añadieron 1 x 10^{5} cpm de [^{125}I]-VEGF (Figura 6, carril 1) con 200 ng de VEGF no marcado (carril 2) o con bFGF (carril 3), y después se incubó de 2 a 16 horas a temperatura ambiente. Se añadió el entrecruzante suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (Pierce) a una concentración final de 1 mM. La reacción se detuvo después de 15 min mediante la adición de tampón de muestra SDS PAGE hirviendo. Los productos entrecruzados se separaron mediante SDS PAGE en un gel de acrilamida al 7,5%, y se analizaron mediante una autorradiografía o con un fosforimager. Los resultados se muestran en la Figura 6, y muestran que el sVEGF-RI une VEGF marcado mediante la aparición de dos bandas de aproximadamente 145 kDa y 245 kDa. La banda de 145 kDa está formada por una molécula de sVEGF-RI y una molécula de VEGF (Monomer, M.). La banda de 245 kDa aparentemente está formada por dos moléculas de sVEGF-RI y un dímero de VEGF (D). Los dímeros de ligando VEGF libre (L) migraron a aproximadamente 45 kDa.

Ensayo de unión - se analizó la unión del sVEGF-RI al VEGF usando un ensayo en una placa de 96 pocillos, según describen Duan, D-S. R. y col., supra. En resumen, se diluyeron de 50 a 200 \mul de sVEGF-RI parcialmente purificado mediante cromatografía Mono Q (Pharmacia) hasta 10 ml en TRIS 25 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM y NH_{4}HCO_{3} 20 mM. Se absorbieron alícuotas (100 \mul) en la superficie de una placa de 96 pocillos durante 18 horas a 4ºC, y entonces las placas se lavaron dos veces con tampón de bloqueo (DME, HEPES 25 mM, pH 7,5, 0,5% de gelatina) y los sitios no específicos se bloquearon con el mismo tampón durante 6 horas a 4ºC. Entonces la placa se lavó dos veces con tampón de unión. Se añadieron varias cantidades de [^{125}I]VEGF a los pocillos en un volumen final de 100 \mul/pocillo, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con 100 \mul de tampón de unión, la proteína unida se solubilizó con 100 \mul de 1% de SDS, 0,5% de ASB y se contó con un contador \gamma. Los resultados, mostrados en la Figura 7, se analizaron por el método de Scatchard [Scatchard, G., (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci., 51, págs. 660-672]. El análisis muestra que el sVEGF-RI conserva una elevada afinidad de unión por el VEGF, con un valor de K_{d} de aproximadamente 20 pM. Esto muestra claramente que el sVEGF-RI, carente de la región transmembrana y adyacente al dominio de tipo Ig, une el VEGF con una elevada afinidad, y que estas regiones no son requeridas para la unión del VEGF.

Ejemplo 4

Inhibición de la unión del VEGF por parte del sVEGF-RI - se ensayó la capacidad del sVEGF-RI de inhibir la unión del VEGF a HUVEC. Se colocaron las HUVEC en placas de Petri a 50.000 células/pocillo en placas de 24 pocillos precubiertas con gelatina y se dejaron crecer hasta confluir. Se mezcló una cantidad constante de [^{125}I]VEGF (100.000 cpm) con varias cantidades de sVEGF-RI parcialmente purificado en tampón de unión, en un volumen total de 200 \mul, y se preincubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las muestras se añadieron a las células y se incubaron durante 4 horas a 4ºC con agitación. Entonces el medio se aspiró y las células se lavaron tres veces con tampón de unión. La radioactividad unida se solubilizó con TRIS-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, NP4O al 1%, ASB al 1% y se contó con un contador \gamma.

Los resultados se muestran en la Figura 8. A la mayor concentración de sVEGF-RI, la unión del VEGF a las HUVEC se redujo en un 70%. Sin embargo, puede ser difícil inhibir completamente la unión al receptor de unión de la membrana celular, dado que una molécula de sVEGF-RI unida a un dímero de VEGF puede ser capaz de unirse al receptor asociado a la célula para formar un complejo (sVEGF-RI)-VEGF-(receptor del VEGF que abarca la membrana) inactivo.

Ejemplo 5 Inhibición de la mitogenia mediada por el VEGF por parte del sVEGF-RI

Inhibición de la mitogenia - dado que el sVEGF-RI era capaz de inhibir la unión del VEGF a las células endoteliales, se determinó entonces que el receptor soluble podría inhibir la mitogenia inducida por el VEGF en las HUVEC. Las HUVEC se colocaron en placas de Petri de 96 pocillos recubiertos con gelatina a una densidad de 4.000 células/pocillo, en 100 \mul de DME complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% más antibióticos (penicilina G, 100 unidades/ml; sulfato de estreptomicina, 100 \mug/ml). Después de 16 horas el medio se cambió y se añadieron las muestras de prueba, las células se preincubaron con una cantidad variable de sVEGF-RI purificado durante 15 minutos a 37ºC antes de añadir el factor de crecimiento (10 ng/ml). Las células se incubaron durante 24 horas, y entonces se añadió [metil-^{3}H]timidina (0,8 \muCi/pocillo; 20 Ci/mmol: 1 Ci = 37 GBq, actividad específica final de 0,8 \muCi/nmol), seguido de una incubación durante 72 horas adicionales a 37ºC bajo CO_{2} al 5%. Las células se lavaron entonces dos veces con disolución salina equilibrada de Hank ajustada a un pH de 7,5 con HEPES 25 mM y ASB al 0,1%. Entonces las células se lisaron, el ADN se solubilizó con Na_{2}CO_{3} 0,2 M y NaOH 0,1 M, y se cuantificó la incorporación de [^{3}H]timidina mediante recuento de centelleo. Los resultados se muestran en la Figura 9. El sVEGF-RI fue capaz de inhibir completamente la incorporación de la [^{3}H]timidina inducida por el VEGF en las HUVEC.

Ejemplo 6

Purificación del sVEGF-RI expresado en baculovirus a partir de células Sf9 - se cromatografió medio de cultivo de células Sf9 infectadas con un constructo de baculovirus diseñado para expresar el sVEGF-RI (Ejemplo 2) a través de una columna (0,7 x 4 cm) de heparina Sepharosa CL-6B (Pharmacia). La columna se lavó con 5 volúmenes de tampón de fosfato de Na 10 mM, pH 6,2 y NaCl 0,1 M, seguido de 6 ml de tampón de fosfato de Na 10 mM, pH 6,2 y NaCl 0,6 M. El sVEGF-RI se eluyó con tampón de fosfato de Na 10 mM, pH 6,2 y NaCl 1,0 M. Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida que mostró una pureza de más del 90% (valorada según una tinción con azul de Coomassie) del sVEGF-R producido recombinantemente (Figura 5). La identidad de la proteína se confirmó mediante un análisis de la secuencia proteica N terminal. El N terminal real (Ser Lys Leu ...) de la proteína recombinante difiere en dos aminoácidos del predicho por Shibuya y col., supra. (Ser-Ser-Ser...). El sitio de escisión de la peptidasa en el sVEGF-RI producido en las células Sf9 estaba entre los residuos gly-26 y ser-27.

Ejemplo 7

Construcción del sVEGF-R relacionado con el KDR - las formas solubles del KDR (un receptor del VEGF conocido) [Terman, B. I. y col., (1991) Oncogene 6, págs. 1677-1683; Terman, B. I. y col., (1992) Biochem. Biophys. Res Comm. 187, págs. 1579-1586] puede que exista de forma natural, pero todavía no ha sido identificado. Se construye recombinantemente una forma soluble del KDR modificando su secuencia codificante mediante PCR usando los cebadores 1) 5' TTTTGGATCCCTGCAGACAGATCTACGTTTGAGAACC 3' (ID SEC Nº 7) y 2) 5' TTTTGGATCCTTAACGCTCTAGGACTGTGAGC 3' (ID SEC Nº 8), y pKDRA (el fragmento XhoI/EcoRI que codifica para el dominio extracelular y transmembrana del KDR clonado en el sitio EcoRI de pGEM 7Z, obtenido de Promega) como molde (Figura 17). Esto generó un codón de detención de la traducción después del residuo de aminoácidos número 663 del KDR, que corresponde al dominio extracelular del KDR completo. Este fragmento modificado se usa entonces para remplazar el fragmento PstI/BamHI del pKDRA, generando una forma truncada del gen del KDR (Figura 10) que codifica para un receptor soluble denominado sVEGF-RII (Figura 11). Entonces se cambia el sitio XhoI en el par de bases número 257 por un sitio BamHI mediante técnicas de clonación estándar. Se crea otra forma truncada del receptor KDR con el cebador 1 mostrado anteriormente, y el cebador 3) 5' TTTTGGATCCAACGGTCCCTAGGATGATGATGAC 3' (ID SEC Nº 9) (Figura 12). Esta forma del KDR, denominada sVEGF-RTMII, está truncada en el lado C terminal del dominio transmembrana, y conserva por tanto la región transmembrana (Figura 13). Se genera una forma similar del receptor FLT mediante PCR usando los cebadores 4) 5' AGCACCTTGGTTGTGGCTGACTC 3' (ID SEC Nº 10) y 5) 5' TTTTGGATCCTTAGATAAGGAGGGTTAATAGG 3' (ID SEC Nº 11) y el plásmido pmFLT (flt completo clonado en el sitio EcoRI de pGEM3Z, obtenido de Promega) como molde (Figura 16). Entonces, el fragmento de PCR de 780 pares de bases puede clonarse junto con el fragmento EcoRI/XbaI del pmFLT para producir un fragmento EcoRI/BAMHI (Figura 14) que codifica para una forma truncada del FLT (denominada sVEGF-RTMI) que conserva el dominio transmembrana pero carece del dominio citoplásmico (Figura 15). Entonces se modifica el sitio EcoRI del extremo 5' del gen a un sitio BamHI. Las formas truncadas resultantes del KDR y del FLT se clonan entonces en pBluebacIII (Stratagene) para su expresión en células de insecto Sf9. La caracterización de estas formas truncadas construidas de los receptores del VEGF se consigue mediante las técnicas usadas para caracterizar el sVEGF-RI, como en los Ejemplos 2, 3, 4, 5 y 6.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTES: Thomas, Kenneth A.

\hskip4,1cm

Kendall, Richard L.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INHIBIDOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO CELULAR ENDOTELIAL VASCULAR

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Merck & Co., Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: P.O. Box 2000, 126 E. Lincoln Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rahway

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: NJ

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 07065-0907

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disco floppy

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1.0 Versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

NOTARIO / AGENTE DE INFORMACIÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Wallen, John W. III

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 35.403

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: 18888

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (908) 594-3905

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (908) 594-4720

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCACCTTGGT TGTGGCTGAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAATTCGT GCTGCTTCCT GGTCC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAATTCCGC GCTCACCATG GTCAGC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGAATTCA CCCGGCAGGG AATGACG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2313 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5

11

12

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 687 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTGGATCC CTGCAGACAG ATCTACGTTT GAGAAC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTGGATCC TTAACGCTCT AGGACTGTGA GC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTGGATCC AACGGTCCCT AGGATGATGA C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCACCTTGG TTGTGGCTGA CTC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTGGATCC TTAGATAAGG AGGGTTAATA GG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 661 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12

18

19

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 668 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

25

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 780 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

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(Secuencia pasa a página siguiente)

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29

30

31

32

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 788 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

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(Secuencia pasa a página siguiente)

33

34

35

36

37

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2264 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16

38

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2352 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2383 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

47

Claims (14)

1. Una molécula de ácido nucleico purificada que codifica para una proteína soluble inhibidora del VEGF, comprendiendo dicha proteína la secuencia de aminoácidos según se establece en la ID SEC Nº 6.

2. La molécula de ácido nucleico purificada de la reivindicación 1, que está formada por la secuencia de nucleótidos según se establece en la ID SEC Nº 5.

3. Un vector de expresión para expresar una proteína soluble inhibidora del VEGF en una célula hospedadora recombinante, en el que dicho vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína soluble inhibidora del VEGF, comprendiendo dicha proteína la secuencia de aminoácidos según se establece en la ID SEC Nº 6.

4. El vector de expresión de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de nucleótidos según se establece en la ID SEC Nº 5.

5. Una célula hospedadora que expresa una proteína soluble recombinante inhibidora del VEGF, en la que dicha célula hospedadora contiene el vector de expresión de la reivindicación 3.

6. La célula hospedadora de la reivindicación 5, que contiene un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos según se establece en la ID SEC Nº 5.

7. Un procedimiento para la expresión de una proteína soluble inhibidora del VEGF, que comprende:

(a)

transfectar el vector de expresión de la reivindicación 3 en una célula hospedadora adecuada, y

(b)

cultivar las células hospedadoras en unas condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína soluble inhibidora del VEGF a partir de dicho vector de expresión.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho vector de expresión comprende la secuencia de nucleótidos según se establece en la ID SEC Nº 5.

9. Una proteína soluble inhibidora del VEGF en una forma sustancialmente pura, que comprende la secuencia de aminoácidos según se establece en la ID SEC Nº 6.

10. La proteína soluble inhibidora del VEGF de la reivindicación 9, que está formada por la secuencia de aminoácidos según se establece en la ID SEC Nº 6.

11. Una composición farmacéutica que comprende la proteína soluble inhibidora del VEGF de la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. La proteína soluble inhibidora del VEGF de la reivindicación 9 o la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento del cuerpo humano.

13. La proteína soluble inhibidora del VEGF de la reivindicación 12, en la que dicho tratamiento implica la inhibición de la función receptora del VEGF.

14. El uso de la proteína soluble inhibidora del VEGF de la reivindicación 9 o la reivindicación 10 para la fabricación de un medicamento para inhibir la angiogénesis.