DE60117743T2

DE60117743T2 - Screeningverfahren für Modulatoren von Integrinen

Info

Publication number: DE60117743T2
Application number: DE60117743T
Authority: DE
Inventors: Jacques Hamon; Emmanuel Normant
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 2001-11-05
Filing date: 2001-11-05
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2021-11-06
Also published as: EP1308726A1; ES2257388T3; DE60117743D1; ATE319997T1; EP1308726B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Durchmustern von Verbindungen, die die Aktivität von Integrinen, genauer Integrinen der αβ7-Unterfamilie, modulieren. Die Erfindung basiert stärker bevorzugt auf der SPA-Technologie, die Verbindungen, die Integrine der αβ7-Unterfamilie, spezifischer die Aktivität von α4β7- oder αEβ7-Integrin, modulieren, durchmustert. Die Erfindung schließt außerdem Zusammensetzungen, Produkte und Kits zur Verwendung beim Durchführen der obenstehenden Verfahren, sowie die durch die Verfahren identifizierten Verbindungen und ihre Verwendungen ein.
Hintergrund der Erfindung
Integrine sind eine Familie von Transmembranadhäsionsmolekülen, beteiligt an Zell-Zell- und Zell-extracelluläre Matrix-Kommunikationen. Integrine umfassen verschiedene Familien von heterodimeren Molekülen, die eine α- und eine β-Untereinheit umfassen, die nicht covalent auf der Zelloberfläche exprimiert sind (Wardlaw, Drugs of the Future, 1999, 24(3), 279). Die β7-Integrin-Untereinheit kann zwei α-Ketten, α4 und αE, paaren, und wird hauptsächlich auf Lymphozyten exprimiert. Als ein α4-Heterodimer bindet sie an das mucosale Adressinzelladhäsionsmolekül („mucosal adressin cell adhesion molecule") MADCAM-1 und vermittelt selektive Rekrutierung von Gedächtnis-T- und -B-Zellen an gastrointestinale Mucosa und Darm-assoziiertes Lymphoidgewebe. Als ein αE-Heterodimer bindet sie an E-Cadherin und vermittelt Adhäsion von intraepithelialen T-Lymphozyten an Epithelzellen.
Die Expression von MADCAM-1 scheint an Stellen reguliert zu sein, die mit entzündlicher Darmerkrankung assoziiert sind (Briskin et al., 1997, AJP 151(1), 97). Die Verabreichung des monoclonalen Anti-α4β7-Antikörpers an chronisch kolitische („colotic") Lisztaffen inhibiert die Rekrutierung verschiedener Leukozytenunterklassen an entzündete Colon mucosa (Hesterberg et al., 1996, Gastroenterology 111, 1373). Die Reduktion von Colon-Entzündungaktivität in SCID-Mäusen, rekonstituiert mit CD45Rbhi CD4+-T-Zellen ist nach Verabreichung von Antikörpern gegen β7- und/oder gegen MADCAM-1 beobachtet worden (Picarella et al., J. Immunol. 158, 2099). Walsh et al., 1996, Immunology 89, 112–119, schlagen α₄β₇-abhängiges Binden von Eosinophilen an VCAM-1 und MADCAM-1-Transfektanten vor. Zusammen genommen deuten diese Elemente darauf hin, dass α4β7 ein interessantes Ziel für gewisse inflammatorische Krankheiten, insbesondere entzündliche Darmerkrankungen, darstellt.
Was αEβ7 betrifft, so ist dieses Integrin nach unserem Wissen nie als ein Ziel für das Arzneimittel-Screenen verwendet worden. Jedoch haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung nun experimentelle Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass dieses Molekül eine kritische Rolle bei der 7-Zell-Rekrutierung spielen könnte und außerdem ein interessantes Ziel („target") für verschiedene Krankheiten, wie z.B. insbesondere Asthma, darstellt. In dieser Hinsicht reduziert αE-Defizienz Luftwegs-Hyperempfindlichkeit in Ag-herausgeforderten Mäusen und hat ein Anti-αE-Antikörper (M290) gute Aktivität in einem Mausmodell von Ovalbumin-induzierter Eosinophilie gezeigt (unveröffentlichte Ergebnisse der Erfinder). Ferner kann αEβ7 auch bei empfindlichen Darmerkrankungen beteiligt sein.
Dementsprechend stellen α4β7- und αEβ7-Integrine ein interessantes Ziel („target") für die Entwicklung von Arzneimitteln oder pharmakologisch aktiven Verbindungen dar. Insbesondere Verbindungen, die die Fähigkeit haben, die Aktivität dieser Integrine zu modulieren, würden Verbindungen mit hohem Potential für die Behandlung aller Krankheiten, wo sie beteiligt sind, wie z.B. entzündlichen Krankheiten (z.B. entzündliche Darmerkrankung, Multiple Sklerose, Psoriasis, Epidermodysplasia verruciformis, entzündliche Arthritis), allergischen Krankheiten (z.B. Dermatitis, T-Helfer-1-bezogene Krankheiten, chronische obstruktive Lungenkrankheit, Asthma etc.) und Immunkrankheiten darstellen.
Die Verfügbarkeit von Assays, die geeignet sind, Verbindungen zu durchmustern, die eine solche Eigenschaft aufweisen, würde folglich von großem Interesse sein. In dieser Hinsicht sind die gegenwärtigen Integrinassays Adhäsionsassays, die Liganden-beschichtete Platten verwenden, die mit Zellen, die Integrin exprimieren, und einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden. Jedoch ist dieser Test nicht für ein Format mit hohem Durchsatz geeignet und ihm fehlt Sensitivität und/oder Reproduzierbarkeit. Ein Szintillations-Proximitäts-Assay („scintillation proximity assay") (SPA) ist für die Studie von Inhibitoren von α₄β₁ und VCAM-1-Wechselwirkungen verwendet worden (Doyle et al., 1996, Int. J. Peptide Protein Res. 47, 427–436). Dementsprechend ist unseres Wissens nach im Fachgebiet kein effizienter Assay angezeigt worden, der ein effizientes, verlässliches, sensitives und reproduzierbares Screenen von Verbindungen erlaubt, die die Aktivität von Integrinen mit einer β7-Untereinheit moduliert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart Zusammensetzungen und Verfahren für das Durchmustern von Verbindungen, die Aktivität von α4β7- oder αEβ7-Integrinen modulieren, inhibieren oder aktivieren, mit Verlässlichkeit und Wirksamkeit. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind einfach, verlässlich, sensitiv, praktisch und ökonomisch und sie erlauben das Durchmustern von Verbindungen auf Basis eines hohen Durchsatzes. Insbesondere kann die Erfindung verwendet werden, um, parallel, große Zahlen an Verbindungen, einschließlich kombinatorischer Bibliotheken von Verbindungen, zu durchmustern, um Arzneimittelkandidaten oder -ziele zu identifizieren. Dieser Typ einer Erfindung erlaubt folglich zum ersten Mal, aktive Verbindungen unter Verwendung von α4β7- oder αEβ7-Integrinen als Ziele für Selektion, Verbesserung und/oder Entwicklung therapeutisch aktiver Produkte zu durchmustern.
Eine Aufgabe dieser Erfindung wohnt spezifischer einem Verfahren zum Selektieren oder Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivität von Integrin α4β7 oder αEβ7 moduliert, inne. Das Verfahren umfasst stärker bevorzugt die Identifikation, Selektion, Charakterisierung oder das Screenen von Verbindungen, die die Aktivität von Integrin α4β7 oder αEβ7 inhibieren.
Eine spezielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung wohnt einem Verfahren zum Selektieren oder Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivität eines α4β7- oder αEβ7-Integrins moduliert, inhibiert oder aktiviert, inne, wobei das Verfahren umfasst:

– Kontaktieren (i) einer markierten Membranpräparation, die α4β7- oder αEβ7-Integrin umfasst, und einer Kandidatenverbindung mit (ii) einem Trägermaterial, das α4β7- bzw αEβ7-Integrin über einen Liganden davon bindet und ein Szintillationsmittel enthält, und
– Feststellen der Menge an α4β7- oder αEβ7-Integrin, das an den Träger gebunden ist.

Das Trägermaterial kann aus verschiedenen Elementen, wie z.B. Polymeren, Gelen, Glas, künstlichen oder organischen Elementen, etc. zusammengesetzt sein oder diese umfassen. Der Träger kann weiter funktionalisiert sein und kann in verschiedene Formen, einschließlich Kügelchen, geformt sein. Nachdem das Verfahren vorzugsweise die Szintillations-Proximitäts-Technologie („scintillation proximity technology") (SPA) verwendet, umfasst das Trägermaterial ferner ein Szintillationsmittel, welches beim Binden des markierten Integrins daran, oder wenn das markierte Integrin-Material in Proximität bzw. Nähe davon gebracht wird, angeregt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Trägermaterial ein Szintillationsmittel und ist mit einem Liganden des Integrins beschichtet, d.h. mit einer Verbindung, die in der Lage ist (spezifisch), mit dem Integrin oder einem funktionellen Teil davon zu interagieren.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren umfasst das Bestimmen der an das Trägermaterial gebundenen Menge an Integrin vorzugsweise das Bestimmen des Szintillationssignals des Trägers. Stärker bevorzugt umfasst das Verfahren das Vergleichen der Menge an Integrin, das an den Träger in Anwesenheit und in Abwesenheit der Kandidatenverbindung und/oder in Gegenwart eines blockierenden Antikörpers gebunden ist, und Identifizieren der Verbindung, die die besagte Menge moduliert. Ferner kann die Erfindung verwendet werden, um große Mengen an Kandidatenverbindungen, wie z.B. die gesamte oder Teile von kombinatorische(n) Bibliotheken an Verbindungen parallel zu durchmustern.
Die Erfindung kann zum Selektieren, Identifizieren, Charakterisieren, Verbessern, Vergleichen, etc.... von Verbindungen verwendet werden, die die Aktivität von Integrin α4β7 oder αEβ7 modulieren, inhibieren oder aktivieren. Genauer ist die Erfindung für das Screenen bzw. Durchmustern von Inhibitoren von Integrin α4β7 oder αEβ7 geeignet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Kit zur Verwendung beim Durchmustern von Modulatoren von αEβ7- oder α4β7-Integrin, wobei der Kit eine markierte Membranpräparation, die αEβ7- oder α4β7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon umfasst, und/oder ein Trägermaterial umfasst, wobei das Trägermaterial einen Liganden umfasst, der αEβ7- oder α4β7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon bindet und ein Szintillationsmittel enthält.
Legende zu den Zeichnungen
1: Schematische Darstellung des SPA-basierten Assays
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie angezeigt, stellt diese Erfindung im Allgemeinen verbesserte Verfahren zum Durchmustern nach Modulatoren von Integrinen bereit. Diese Verfahren werden im Allgemeinen SPA-Format und Membranpräparationen verwenden, die das ausgewählte Integrin oder funktionelle Teile davon umfassen (siehe 1). Die Verfahren können verwendet werden, um Aktivatoren sowie Inhibitoren von Integrinen, z.B Verbindungen, die das Binden von Integrinen an Liganden davon steigern oder vermindern, durchzumustern. Vorzugsweise werden Inhibitoren, d.h. Verbindungen, die die Level an der Wechselwirkung typischerweise um wenigstens 20%, vorzugsweise um wenigstens 50%, verringern, selektiert.
Typischerweise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Selektieren oder Identifizieren einer Verbindung bereit, die die Aktivität eines α4β7- oder αEβ7-Integrins moduliert, inhibiert oder aktiviert, wobei das Verfahren umfasst:

– Kontaktieren (i) einer markierten Membranpräparation, die α4β7- oder αEβ7-Integrin umfasst, und einer Kandidatenverbindung mit (ii) einem Trägermaterial, das α4β7- bzw αEβ7-Integrin bindet, und ein Szintillationsmittel enthält, und
– Feststellen der Menge an α4β7- oder αEβ7-Integrin, das an den Träger gebunden ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Menge an Integrin, die in Anwesenheit einer Kandidatenverbindung an den Träger gebunden ist, mit der Menge an Integrin verglichen, die in Abwesenheit einer Kandidatenverbindung und/oder in Gegenwart eines blockierenden Antikörpers an den Träger gebunden ist, wobei Verbindungen, die die Menge modulieren, Verbindungen darstellen, die die Aktivität des Integrins modulieren.
Wie angezeigt, beinhaltet die vorliegende Erfindung vorzugsweise einen Szintillationsassay, wie z.B. Szintillations-Proximitäts-Assay (SPA). Szintillations-Proximitäts-Assay(SPA)-Technologie schließt die Verwendung eines Szintillationsmittel-Trägermaterials (z.B. Kügelchen) ein, das ein organisches Szintillationsmittel, wie z.B. Diphenyloxazol (PPO), enthält. Assays werden für gewöhnlich in wässrigen Puffern unter Verwendung von Radioisotopen, wie z.B. ³H, ¹²⁵I, ¹⁴C, ³⁵S oder ³³P, die Niedrigenergiestrahlung emittieren, deren Energie in einer wässrigen Umgebung leicht dissipiert wird, durchgeführt. Beispielsweise haben die von ³H emittierten Elektronen eine durchschnittliche Energie von nur 6 keV und haben eine sehr kurze Weglänge (–1 ~tm) in Wasser. Wenn ein Molekül, das mit einem dieser Isotope markiert ist, an die Oberfläche des Trägermaterials, entweder direkt oder über Wechselwirkung mit einem anderen Molekül, das zuvor an das Trägermaterial gekoppelt wurde, gebunden ist, wird die emittierte Strahlung das Szintillationsmittel aktivieren und Licht produzieren. Die Menge an produziertem Licht, welche proportional ist zu der Menge an markierten Molekülen, die an das Trägermaterial gebunden sind, kann bequem mit einem Flüssig-Szintillations(LS)-Zähler („liquid scintillation counter") gemessen werden. Wenn das markierte Molekül nicht an das Trägermaterial angelagert wird, wird seine Strahlungsenergie von dem umgebenden wässrigen Lösungsmittel absorbiert, bevor sie das Trägermaterial erreicht, und es wird kein Licht produziert. Folglich ergeben gebundene Liganden ein Szintillationssignal, aber freie Liganden ergeben einen sehr niedrigen Hintergrund, und der Bedarf nach einem zeitaufwändigen Trennungsschritt, der für konventionelle Radioligand-Bindungsassays charakteristisch ist, wird eliminiert. Die in den Assays erforderlichen Manipulationen werden auf ein paar einfache Repetierschritte reduziert, die zu einer besseren Genauigkeit und Reproduzierbarkeit und einem höheren Durchsatz führen.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verwendung von SPA-Kügelchen, beschichtet mit einem Liganden von Integrin, typischerweise einem endogenen Liganden von Integrin. Die Beschichtung wird vorzugsweise durch chemische oder physikalische Wechselwirkung mit den Kügelchen durchgeführt, obwohl andere Bindungsmittel in Erwägung gezogen werden können. Insbesondere kann das Beschichten unter Verwendung von Streptavidin-Kügelchen und biotinylierten Ligandenmolekülen durchgeführt werden.
Diese Erfindung stammt von der Selektion und Validierung von Integrinen als Ziele für die Entwicklung von Arzneimitteln bei entzündlichen, allergischen und Immunkrankheiten, sowie von der Selektion effizienter Assaybedingungen, um solche Arzneimittel zu durchmustern. In dieser Hinsicht zeigt die Erfindung unerwartet, dass bestimmte SPA-Assayformate, die Membranpräparationen verwenden, verwendet werden können, um Verbindungen zu identifizieren, die mit Komplex-Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen Komplexmolekülen, wie z.B. heterodimeren Rezeptoren, insbesondere rekombinanten heterodimeren Rezeptoren, interferieren. Die Erfindung zeigt ferner, dass hoher Durchsatz möglich ist, weil 384-Vertiefungs-Plattenformat mit geringen Volumina verwendet werden kann.
Das Trägermaterial
Die vorliegende Erfindung offenbart nun ein neues Verfahren zum Durchmustern aktiver Verbindungen unter Verwendung von SPA-Assayformat und Trägermaterial. Das Trägermaterial hat die Fähigkeit, den ausgewählten Integrinkomplex in im Wesentlichen nativer Konformation, oder funktionelle Teile davon, zu binden.
In dieser Hinsicht kann der Träger, wenigstens teilweise, aus Silikat, Polyvinyltoluol (PVT), (Poly)acrylamid, Agarose, Sepharose, Polystyrol, etc. zusammengesetzt sein. Spezifische Beispiele von Trägermaterial schließen PVT oder Silikat-Material, optional mit Liganden, wie z.B. WGA, Streptavidin, Polylysin, etc. beschichtet, ein. Stärker bevorzugtes Material umfasst Yttriumsilikat (YtSi) oder PVT, beschichtet oder funktionalisiert, insbesondere beschichtet mit einem Liganden des Integrins.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform enthält der Träger ein Szintillationsmittel (oder ein organisches Szintillationsmittel). Das Szintillationsmittel ist vorzugsweise wasserunlöslich und beim Binden des markierten Integrins an den Träger auf eine höhere Energiestufe anregbar. Das Szintillationsmittel sollte ausreichend Lichtenergie produzieren, damit diese unter Verwendung eines geeigneten Geräts (beispielsweise Szintillationszähler) nachgewiesen werden kann. Ein typisches Beispiel eines Szintillationsmittels ist Diphenyloxazol (PPO). Dieses Szintillationsmittel wird durch Radioisotope, die β-Strahlen emittieren, angeregt.
Geeignetes Trägermaterial zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist im Handel verfügbar, wie beispielsweise Amersham-Produkte WGA-beschichtete PVT-Kügelchen (RPNQ0001), PEI-behandelte WGA-PVT-Kügelchen (RPNQ0003), Streptavidin-beschichtete PVT-Kügelchen (RPNQ0007; RPNQ0007), Polylysin-beschichtete Yttriumsilicat-Kügelchen (RPNQ0010), WGA-beschichtete Yttriumsilicat-Kügelchen (RPNQ0011), Streptavidin-beschichtete Yttriumsilicatkügelchen (RPNQ0012) und RNA-bindende Yttriumsilicat-SPA-Kügelchen (PRNQ0013).
Obwohl das Trägermaterial verschiedene Formen haben kann, ist es typischerweise in der Form von Kügelchen (diesbezüglich siehe „Proximity News", 39 (Dez. 1998), 1). Es sollte verstanden werden, dass die präzise Form und Zusammensetzung des Trägermaterials durch den Fachmann unter Verwendung von üblichem Allgemeinwissen eingestellt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Trägermaterial (z.B. die Kügelchen) an einen (endogenen) Liganden von α4β7- oder αEβ7-Integrin gebunden (oder damit beschichtet). Der Ausdruck Ligand bezeichnet ein beliebiges Molekül, das die Fähigkeit hat, mit dem ausgewählten Integrin zu interagieren. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist der Ligand ein endogener Ligand des Integrins, d.h. eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie physiologisch mit dem ausgewählten Integrin wechselwirkt. Tatsächlich ist es am stärksten bevorzugt, selektive Ligandenmoleküle, d.h. Moleküle, die vorzugsweise mit dem gewünschten Integrin wechselwirken, zu verwenden, und, physiologische Ligandenmoleküle zu verwenden, um die verlässlichsten Ergebnisse zu erzielen.
In dieser Hinsicht verwendet das Verfahren in einer ersten bevorzugten Variante Trägermaterial, das mit MADCAM-1 oder einem funktionellen Teil davon beschichtet ist (oder daran gebunden ist). MADCAM-1 ist ein endogener Ligand von Integrin α4β7. Die Nuclein- und Aminosäuresequenzen von MADCAM-1 liegen in Genbank, Eingangsnummer MN_007164, vor.
In einer zweiten bevorzugten Variante verwendet das Verfahren Trägermaterial, das mit E-Cadherin oder einem funktionellen Teil davon beschichtet ist. E-Cadherin ist ein endogener Ligand von Integrin α4β7. Die Nuclein- und Aminosäuresequenzen von E-Cadherin liegen in Genbank, Eingangsnummer XM_007840 vor.
Der Ausdruck „funktioneller Teil" bezeichnet eine beliebige Variante oder ein beliebiges Fragment des Liganden, die/der die Fähigkeit behält, mit dem ausgewählten Integrin zu interagieren. Insbesondere kann der funktionelle Teil aus einem Fragment des Liganden bestehen, der die Bindungsstelle enthält, und ohne die cytoplasmatische Domäne ist. Der funktionelle Teil kann außerdem eine Variante des Liganden umfassen, die eine oder mehrere Aminosäuremodifikation(en) (z.B. Deletion, Substitution, Mutation und/oder Addition) aufweist, die nach wie vor die Fähigkeit aufweist, an das Integrin zu binden. Solche Varianten schließen außerdem na türlich vorkommende Varianten, wie z.B. Polymorphismen, Spleißformen, Homologe anderer Arten, etc., ein.
Der Ligand kann auf das Trägermaterial durch unterschiedliche Arten, wie z.B. durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen, aufgetragen sein. Vorzugsweise ist der Ligand kovalent, durch einen chemischen Linker oder Abstandhalter, wie z.B. Streptavidin/Biotin, aufgetragen.
Im Allgemeinen werden 0,05 bis 5 mg Trägermaterial (z.B. beschichtete Kügelchen) für jeden Assay verwendet. Es sollte verstanden werden, dass die genaue Menge an Trägermaterial, abhängig von dem Trägermaterial, den Mengen an Reagentien, etc. durch den Fachmann angepasst werden kann.
Die markierte Membranpräparation
Wie oben angezeigt, setzt diese Erfindung eine markierte Membranpräparation ein, die das ausgewählte Integrin umfasst, dessen Aktivität unter den oben beschriebenen Bedingungen detektiert werden soll. Die Erfinder zeigten in der Tat, dass das Screenen viel effizienter und verlässlicher ist, wenn Membranpräparationen anstelle von isoliertem oder gereinigtem Integrin-Polypeptid verwendet werden. Weiterhin haben die Erfinder nun gezeigt, dass Membranpräparationen beim Screenen verwendet werden können, um die Wechselwirkung zwischen einem Komplex-Rezeptormolekül und dem Liganden in einem Format mit hohem Durchsatz zu bewerten.
Die Membranpräparation kann eine gesamte Zelle oder eine Präparation, abgeleitet von einer gesamten Zelle, umfassend eine Membranfraktion davon, sein, wobei die Zelle oder Membranfraktion α4β7- oder αEβ7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon umfassen. Die Membranpräparation kann außerdem eine künstliche Membranpräparation, umfassend das ausgewählte Integrin, z.B. eine Micelle oder ein Liposom, hergestellt durch Zusammenmischen von Lipiden und den Integrin-Polypeptiden unter geeigneten Bedingungen, sein. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Membranpräparation ein Zelllysat, hergestellt von einer Zelle, die das ausgewählte Integrin-Polypeptid oder einen funktionellen Teil davon exprimiert.
In einer speziellen Ausführungsform verwendet das Verfahren eine Membranpräparation, wie z.B. ein Zelllysat oder eine Zellfraktion, umfassend das Integrin, abgeleitet (oder erhalten) aus (rekombinanten) Säuger- oder Bakterienzellen.
Das Integrin kann von unterschiedlichem Ursprung sein, wie z.B. Mensch oder Tier, vorzugsweise Mensch. Das Integrin kann ein natürlich vorkommendes Integrin, z.B. präpariert von einer Kultur von Zellen, die das Molekül natürlich herstellen (Gewebekultur, Zellkultur, etc.), oder ein rekombinantes Molekül, präpariert aus Zellen, die eine rekombinante Nucleinsäure enthalten, die selbiges codiert, sein. In dieser Hinsicht kann das Integrin aus transfizierten Zellen erhalten werden, die eine Nucleinsäure enthalten, die das Molekül codiert. Die Nucleinsäuresequenzen, die ein menschliches Integrin α4β7- und αEβ7-codieren, sind im Fachgebiet cloniert und beschrieben worden. Beispielsweise sind diese Sequenzen bei Genbank, unter Eingangs nummern XM_029724; XP_039011; XP_008508; XM_039011.1; XM_008508.5 verfügbar. Die Sequenz kann in Zellen unter Verwendung verschiedener Plasmide und/oder Vektoren, enthaltend verschiedene Promotoren, transfiziert werden, um das rekombinante Molekül herzustellen. Das Lysat solcher Zellen (oder andere davon abgeleitete Präparationen) kann bei den erfindungsgemäßen Durchmusterungsassays verwendet werden. Die Zellen können von unterschiedlichem Ursprung sein, wie z.B. Säugetierursprung, eukaryotischer Ursprung (z.B. Hefen), prokaryotischer Ursprung (z.B. Bakterien), vegetativer Ursprung, etc. Gewöhnlich sind bevorzugte Zellen von Säugetierursprung, so dass das rekombinante Integrin funktionell ist und gemäß natürlicher Mechanismen prozessiert wird. Jedoch können nicht-menschliche Zellen zur weiteren Steigerung der Selektivität des Verfahrens verwendet werden, d.h., um Zellmembranen zu produzieren, die das ausgewählte menschliche Integrin und kein anderes menschliches Integrin-Polypeptid exprimieren. In dieser Hinsicht sind bevorzugte Säugetier- oder menschliche Zellen Zellen, die im Wesentlichen Integrinmoleküle nicht natürlich exprimieren.
Die Zellen können Primärzellen oder etablierte Zellkulturen sein. Sie können in einem beliebigen geeigneten Medium kultiviert werden, und dann behandelt werden, um die Integrin-enthaltende Membranpräparation (Zellextrakte, Fraktionen und dergleichen) zu präparieren. Typischerweise werden die Zellen physikalischer und/oder chemischer Behandlung unterworfen, um das Integrin-enthaltende Material herzustellen. In einem typischen Experiment werden die Zellen enzymatischer und/oder chemischer und/oder physikalischer Lyse unterworfen, vorzugsweise unter Verwendung von Tau/Gefrier-Zyklus(en), Ultraschall, etc., entweder allein oder in verschiedenen Kombinationen. Die Zellextrakte (oder Fraktionen) werden gesammelt und können weiter konzentriert, in geeigneten Puffern suspendiert, gereinigt, konditioniert, etc. werden.
Typischerweise umfasst die verwendete Integrin-Membranpräparation ein Zelllysat (oder Fraktionen oder anderes von Zellen stammendes Material). Die Integrin-Membranpräparation kann außerdem (transfizierte) Gesamtzellextrakte umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Membranpräparation von einer rekombinanten (Säuger-)Zelle erhalten, die ein α4β7- oder αEβ7-Integrin-Polypeptidmolekül exprimiert, und noch bevorzugter von einer rekombinanten Zelle, die menschliches α4β7- oder αEβ7-Integrin, oder einen funktionellen Teil davon, exprimiert. Um eine solche Membranpräparation herzustellen, können verschiedene Zellen, wie z.B. Zellen, die das ausgewählte Integrin natürlich exprimieren, oder Zellen, die mit einem dasselbe codierenden Nucleinsäuremolekül oder einen funktionellen Teil davon transduziert sind, verwendet werden. Der Ausdruck funktioneller Teil ist wie oben für den Liganden definiert. Tatsächlich ist es nicht notwendig, dass das exprimierte Integrin identisch zu dem natürlich vorkommenden Integrin ist, solange (i) es eine funktionelle Bindungsstelle beibehält und (ii) in der Lage ist, mit dem Liganden, der auf Trägermaterial beschichtet ist, zu interagieren. Entsprechend können dem Integrin cytoplasmatische Domänen oder Aminosäuren fehlen und/oder kann es Aminosäurevariationen im Vergleich zu den Wildtypmolekülen enthalten.
Wie angezeigt, wird die Membranpräparation markiert, um Detektion einer Wechselwirkung mit dem beschichteten Trägermaterial zu erlauben. Die markierte Membranpräparation wird vorzugsweise radiomarkiert. Radiomarkieren kann unter Verwendung verschiedener Radioisotope, einschließlich ³H, ¹²⁵I, ¹⁴C, ³⁵S oder ³³P, oder ³²P durchgeführt werden. Vorzugsweise sollte das Radioisotop Niedrigenergiestrahlung emittieren, deren Energie in einer wässrigen Umgebung leicht dissipiert wird. Tatsächlich ist es erforderlich, dass ungebundene markierte Membranen es im Wesentlichen verfehlen, das in dem Trägermaterial enthaltene Szintillationsmittel zu aktivieren. Die Art des Isotops kann außerdem, abhängig von dem Typ des Szintillationsmittels, ausgewählt werden. Beispielsweise sollte das Isotop, wo PPO als ein Szintillationsmittel verwendet wird, vorzugsweise β-Strahlen emittieren, wie beispielsweise ³H. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Membranpräparationen tritiiert.
Das Markieren kann gemäß verschiedener im Fachgebiet bekannter Techniken, wie z.B. durch Einbauen markierter Elemente in die Zellmembran (z.B. markierte Aminosäuren, Lipide etc.) oder durch Kontaktieren der Membranpräparationen mit einer Markierung (markierter Ligand, etc.), durchgeführt werden. Vorzugsweise werden die Membranen durch Inkorporation bzw. Einbau markierter Elemente während Zellkultur markiert. Noch bevorzugter werden sie durch Einbau markierter Aminosäuren markiert. Demgemäß wird, in einer typischen Ausführungsform, die Membranpräparation durch Kultivieren einer Zelle in Gegenwart einer radiomarkierten Aminosäure vor dem Präparieren der Membranpräparation radiomarkiert. Die markierte Aminosäure kann beispielsweise Methionin, welches in die meisten Polypeptide eingebaut wird, sein, weil sie von dem Start-ATG-Codon codiert wird. Es sollte verstanden werden, dass andere markierte Aminosäuren verwendet werden können.
Die Menge an für den Assay verwendeter markierter Membranpräparation kann durch den Fachmann eingestellt werden. In einem typischen Experiment werden zwischen 1 × 10⁴ bis 5 × 10⁸ cpm/ml radiomarkierter Membranpräparation für jede Assayreaktion verwendet, noch stärker bevorzugt zwischen 1 × 10⁵ bis 5 × 10⁷ cpm/ml. In einem typischen Experiment werden zwischen 1 × 10⁶ bis 5 × 10⁶ cpm/ml verwendet.
Die Assaybedingungen
Der Assay kann in einem beliebigen geeigneten Träger oder Gerät, einschließlich Platte, Röhrchen, Kolben und dergleichen, durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird das Inkontaktbringen in Viel-Vertiefungsplatten durchgeführt, die erlauben, dass mehrere Assays parallel durchgeführt werden. Typische Träger bzw. Haltevorrichtungen schließen Mikrotiterplatten, insbesondere die 96-Vertiefungs- oder 384-Vertiefungs- und Mikrotiterplattenformate mit höherem Durchsatz ein, welche leicht handhabbar und mit gewöhnlicher Anregung leicht zu beleuchten sind. Andere Formate, einschließlich größerer Mikrotiterplatten oder Nanotechnologien, können auch verwendet werden.
Abhängig von dem Träger und der Testverbindung können in dem Assay variierende Mengen an Reagentien verwendet werden. Typischerweise können die folgenden Mengen in einem maximalen Endvolumen von 250 μl pro Vertiefung verteilt werden.

– 0,05–5 mg/ml Ligand-beschichteter Kügelchen und
– 1 × 10⁴ bis 5 × 10⁸ cpm/ml radiomarkierter Membranpräparation.

Die Reaktion kann in irgendeinem geeigneten Assaypuffer, umfassend beispielsweise irgendeine) Puffer, Salzlösung, wässrige Lösung, etc., der/die das Kontaktieren der verschiedenen Reagentien erlaubt und ihre biologische Aktivität nicht verändert, durchgeführt werden.
Es sollte verstanden werden, dass die jeweiligen genauen Mengen (oder Konzentrationen) an Reagentien und Testverbindungen durch den Anwender, abhängig von dem Verbindungstyp, dem Typ an Integrin, der Länge des Inkubationszeitraums, etc. eingestellt werden kann. Ferner können, falls notwendig, die Reagentien in Gegenwart zusätzlicher Mittel vermischt werden, um die Durchführung des Assays zu verbessern.
Das Kontaktieren in Schritt (i) kann bis zu 6 Stunden lang, typischerweise weniger als 4 Stunden lang, andauern. Tatsächlich werden die verschiedenen Reagentien vorzugsweise über einen Zeitraum inkubiert, der ausreichend ist, um das Auftreten einer Wechselwirkung zu erlauben. Abhängig von den Assays dauert dieser Zeitraum für gewöhnlich weniger als etwa 3 Stunden. In einem typischen Experiment wird das Vermischen etwa 1 Stunde lang oder weniger durchgeführt. Der Träger kann etwa 10 Minuten bis einige Stunden lang zugegeben werden. Typischerweise wird das Reaktionsgemisch während der ersten 5–30 Minuten geschüttelt und das Gemisch weitere 15–100 Minuten lang oder länger stehengelassen.
Die Menge oder Quantität von an den Träger gebundenem Integrin kann auf verschiedene Weisen als ein Hinweis auf die Aktivität der Kandidatenverbindung bewertet werden. Im Allgemeinen wird sie durch Szintillationszählen unter Verwendung gewöhnlicher Vorrichtungen bewertet. Insbesondere können die Zählereignisse direkt in dem Reaktionsgemisch, ohne Bedarf an irgendeinem Trennungsschritt, gemessen werden. Alternativ kann das trägergebundene Lipid unter Verwendung anderer konventioneller Techniken, wie z.B. Chromatographie, Immunoassay, etc., detektiert oder quantifiziert werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung schließt ein Verfahren zum Selektieren oder Identifizieren einer Verbindung ein, die die Aktivität von Integrin α4β7 moduliert, das umfasst:

– Kontaktieren, in Anwesenheit oder Abwesenheit einer Kandidatenverbindung, (i) einer markierten Membranpräparation, die α4β7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon umfasst, mit (ii) einem Trägermaterial, beschichtet mit MADCAM-1 oder einem funktionellen Teil davon, das/der selektiv in der Membranfraktion enthaltenes α4β7 bindet, wobei das Trägermaterial ein Szintillationsmittel umfasst, und
– Feststellen des Effekts der Kandidatenverbindung auf die Aktivität von Integrin α4β7 durch Vergleichen des Szintillationssignals in Anwesenheit und Abwesenheit der Kandidatenverbindung und/oder in Gegenwart eines blockierenden Antikörpers, wobei Verbindungen, die das Szintillationssignal modulieren, Verbindungen darstellen, die die Aktivität modulieren.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung liegt in einem Verfahren zum Selektieren oder Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivität von Integrin αEβ7 moduliert, das umfasst:

– Kontaktieren, in Anwesenheit oder Abwesenheit einer Kandidatenverbindung, (i) einer markierten Membranpräparation, die αEβ7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon umfasst, mit (ii) einem Trägermaterial, beschichtet mit E-Cadherin oder einem funktionellen Teil davon, das/der selektiv in der Membranpräparation enthaltenes αEβ7 bindet, wobei das Trägermaterial ein Szintillationsmittel umfasst, und
– Feststellen des Effekts der Kandidatenverbindung auf die Aktivität von Integrin αEβ7 durch Vergleichen des Szintillationssignals in Anwesenheit und Abwesenheit der Kandidatenverbindung und/oder in Gegenwart eines blockierenden Antikörpers, wobei Verbindungen, die das Szintillationssignal modulieren, Verbindungen darstellen, die die Aktivität modulieren.

Die obigen Verfahren sind vorzugsweise auf das Identifizieren oder Screenen bzw. Durchmustern von Integrin-Inhibitoren gerichtet.
Die Test-(oder Kandidaten-)Verbindung(en)
Die Testverbindung kann irgendein Produkt in isolierter Form oder in Mischung mit irgendeinem anderen Material (z.B. (einem) beliebigen anderen Produkt(en)) sein. Die Verbindung kann hinsichtlich Struktur und/oder Zusammensetzung definiert sein, oder sie kann undefiniert sein. Beispielsweise kann die Verbindung ein isoliertes und strukturell definiertes Produkt, ein isoliertes Produkt unbekannter Struktur, eine Mischung verschiedener bekannter und charakterisierter Produkte oder eine undefinierte Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere Produkte, sein. Beispiele solcher undefinierter Zusammensetzungen schließen beispielsweise Gewebeproben, biologische Flüssigkeiten, Zellextrakte, vegetative Präparationen, etc. ein. Die Testverbindung kann ein beliebiges organisches oder anorganisches Produkt, einschließlich eines Polypeptids (oder eines Proteins oder Peptids), einer Nucleinsäure, eines Lipids, eines Polysaccharids, eines chemischen Produkts oder eine beliebige Mischung oder beliebige Derivate davon sein. Die Verbindungen können natürlichen Ursprungs und synthetischen Ursprungs sein und schließen die Bibliotheken an Verbindungen ein.
Wie untenstehend weiter diskutiert werden wird, ist die vorliegende Erfindung insbesondere auf das Screenen bzw. Durchmustern großer Anzahlen an Verbindungen, wie z.B. kombinatorischer Bibliotheken von Verbindungen, adaptiert. Tatsächlich stellt die vorliegende Erfin dung Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die effizientes und einfaches Screenen mehrerer Verbindungen in kurzen Zeiträumen erlauben. Insbesondere können die vorliegenden Verfahren teilweise automatisiert werden, wodurch effizientes und gleichzeitiges Screenen großer Sets an Verbindungen erlaubt wird.
Im Allgemeinen ist die Aktivität der Testverbindungen) unbekannt, und das Verfahren dieser Erfindung wird verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die die ausgewählte Eigenschaft aufweisen (z.B. Integrinmodulatoren). Jedoch kann das Verfahren bei bestimmten Gelegenheiten, wo die Aktivität (oder der Typ an Aktivität) der Testverbindungen) bekannt ist oder erwartet wird, verwendet werden, um diese Aktivität (hinsichtlich Spezifität, Wirksamkeit, etc.) weiter zu charakterisieren und/oder um diese Aktivität durch das Untersuchen von Derivaten dieser Testverbindungen zu optimieren.
Die Erfindung schließt außerdem Kits für Verwendung beim Durchmustern von Modulatoren von α4β7- oder αEβ7-Integrin ein, wobei der Kit eine markierte Membranpräparation, die α4β7- oder αEβ7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon und/oder ein Trägermaterial umfasst, wobei das Trägermaterial α4β7- oder αEβ7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon bindet und ein Szintillationsmittel enthält. Der Kit kann ferner die Reagentien und/oder Protokolle für SPA-Technologie, wie z.B. Puffer etc., einschließen.
BEISPIELE
1. αEβ7-SPA-Assay
1.1. Material:
Transfektanten der menschlichen chronischen myelogenen Leukämie-Zelllinie K562, die αEβ7 exprimieren, und Proteine, wie z.B. E-Cadherin-Fc-Fusionsprotein, waren wie in Brenner et al. offenbart (Molecular basis for Leukocyte Integrin αEβ7 Adhesion to Epithelial (E)-Cadherin, „Structure-Function analysis of integrin β7subunit). Diese können gemäß bekannter Techniken hergestellt werden. Biotinylierung von (E)-Cadherin wurde gemäß klassischer Protokolle durchgeführt (vgl.: Amersham proximiry news: Biotinylation techniques...). Wachstumsmedium einschließlich aller Zusätze wurden von LifeTech (Paris, Frankreich) erworben [³H]Methionin (TRK583, 85 Ci/mmol) und Streptavidin SPA-Kügelchen (RPNQ0007) wurden von Amersham (Paris, Frankreich) erworben.
1.2. Kultur
K562 werden in einem RPMI 1640-Medium mit L-Glutamin (Life Tech #21875-0.34), Fetal Clone I 10%, zusätzlichem L-Glu 2 mM, Pen/Strep 100×, Geniticin 550 mg/l, Hygromycin B 550 mg/l kultiviert. Zellen werden alle 2–3 Tage gesplittet. Wir resuspendieren gewöhnlich bei 0,4 Millionen/ml in COSTAR 150 cm²-Flaschen (standing down).
1.3. Membrantritiierung
Die menschliche Zelllinie K562 (50·10⁶ Zellen/100 ml) werden 18 h lang in einem Methionin-freien RPMI 1640 (LifeTech #11876-026) mit 10% FBS in Gegenwart von 80 μCi [³H]Methionin (Amersham #TRK583, 85 Ci/mmol) kultiviert. Zellen werden zweimal mit 25 ml PBS gewaschen, bei 1500 UpM 10 Minuten lang abzentrifugiert und in 10 ml eines hypotonen Lysepuffers (20 mM Hepes, 20 mM CaCl₂, 20 mM NaCl und 25 μg/ml Aprotinin) für 50·10⁶ Zellen resuspendiert und bei –80°C gehalten.
1.4. Szintillations-Proximitäts-Assay
Streptavidin-SPA-Kügelchen werden mit Biot-E-Cadherin (5 μg/mg Kügelchen) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in Assaypuffer (HBSS (Gibco, 14025-076), 0,5 mM Mn²⁺ (MnCl₂), 25 mM HEPES, pen/strep [1×], Complete^TM EDTA-free (Proteaseinhibitor): eine Tablette/50 ml Assaypuffer (Boehringer Mannheim #1873580), 15% Glycerin) vermischt, 5 Minuten lang bei 3000 UpM abzentrifugiert und in dem Assaypuffer zu 70 μg/100 μl/Vertiefung resuspendiert.
Der Szintillations-Proximitäts-Assay wird bei Raumtemperatur in Assaypuffer durchgeführt. Jeder Assay wird in einem Reaktionsvolumen von 200 μl, enthaltend 0,7 mg/ml beschichtete SPA-Kügelchen und 2,3·10⁶ cpm/ml tritiierte Membranen durchgeführt. Nicht-spezifisches Signal wird in Gegenwart einer hohen Konzentration von blockierendem Antikörper bestimmt. Die Mikrotiterplatten werden 45 Minuten lang auf einem Rundschüttler inkubiert und in einem Wallac Microbeta^TM Szintillationszähler gezählt.
1.5. Ergebnisse
Das Durchmustern verschiedener Bibliotheken ist abgeschlossen. Mehrere chemische Einheiten sind ausgewählt worden und auf ihre Fähigkeit hin, Integrinaktivität zu inhibieren, bestätigt worden.
2. α4β7-SPA-Assay
2.1. Material

Zellen, die α4β7 exprimieren: RPMI18866.
Ligand: MADCAM-Fc-Fusionsprotein

Biotinylierung von MADCAM-Fc-Fusionsprotein wurde gemäß klassischem Protokoll durchgeführt (vgl.: Amersham proximity news: Biotinylation techniques...).
Wachstumsmedium einschließlich aller Zusätze wurde von LifeTech (Paris, Frankreich) erworben. [³H]Methionin (TRK583, 85 Ci/mmol) und Streptavidin-SPA-Kügelchen (RPNQ0007) wurden von Amersham (Paris, Frankreich) erworben.
2.2. Kultur
RPMI 8866 werden in einem RPMI 1640-Medium mit L-Glutamin (LifeTech #21875-0.34), Gentamycin 0,1 mg/ml, FBS 10%, kultiviert. Zellen werden alle 2–3 Tage gesplittet. Wir resuspendieren gewöhnlich bei 0,4 Millionen/ml Konzentration.
2.3. Membrantritiierung
Die menschliche Zelllinie RPMI 8866 (25·10⁶ Zellen/50 ml) wird 18 h lang in einem Methionin-freien RPMI 1640 (LifeTech #11876-026) und 10% FBS, Gentamycin in Gegenwart 80 μCi [³H]Methionin kultiviert. Zellen werden zweimal mit 25 ml PBS gewaschen, bei 1500 UpM 10 Minuten lang abzentrifugiert, in 10 ml eines hypotonen Lysepuffers (20 mM Hepes, 2 mM CaCl₂, 20 mM NaCl und 20 μg/ml Aprotinin) für 50·10⁶ Zellen resuspendiert und bei –80°C gehalten.
2.4. Szintillations-Proximitäts-Assay
Streptavidin-SPA-Kügelchen werden mit biot-MADCAM (12 μg/mg Kügelchen) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in Assaypuffer (HBSS, 0,5 mM Mn²⁺ (MnCl₂), 25 mM HEPES, pen/strep [1×], Complete TM EDTA-free (Proteaseinhibitor): eine Tablette/50 ml Assaypuffer (Boehringer Mannheim #1873580), 15% Glycerin) vermischt, bei 3000 UpM 5 Minuten lang abzentrifugiert und in dem Assaypuffer zu 70 μg/100 μl/Vertiefung resuspendiert.
Der Szintillations-Proximitäts-Assay wird bei Raumtemperatur in Assaypuffer durchgeführt. Jeder Assay wird in einem Reaktionsvolumen von 200 μl, enthaltend 0,7 mg/ml beschichtete SPA-Kügelchen und 1,25 10⁶ cpm/ml tritiierte Membranen durchgeführt. Nicht-spezifisches Signal wird in Gegenwart einer hohen Konzentration an blockierendem Antikörper bestimmt. Die Mikrotiterplatten werden 45 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rundschüttler inkubiert und in einem Wallac Microbeta^TM-Szintillationszähler gezählt.
Als Ergebnis ist gemäß der vorangehenden Beispiele ein α4β7-SPA-Test eingerichtet worden, der tritiiertes α4β7 und MADCAM-1-Kügelchen verwendet. Dieser Test ist sehr robust, sowohl auf 96- und 384-Vertiefungs-Format, und erlaubt uns, Bibliotheken von Verbindungen rasch zu durchmustern, um Inhibitoren der MADCAM-1-Bindungstasche mit ausgezeichneter Sensitivität auszusortieren. Dieser Test erfordert keine gereinigten Integrine, sondern wird stattdessen unter Verwendung von Rohextrakten von (transient transfizierten) Zellen betrieben. Unseres Wissens nach ist dies bisher der erste beschriebene, effiziente Assay für Integrine mit einer β7-Untereinheit, was neue Möglichkeiten für die Entwicklung von aktiven Molekülen eröffnet. So isolierte oder erhaltene aktive Moleküle können als Arzneimittelkandidaten verwendet werden oder in weitere Optimierungsprogramme eingeschaltet werden, um orientierte Bibliotheken zu entwerfen oder weitere chemische Modifikationen einzuführen.

Claims

Verfahren zum Selektieren oder Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivität eines α4β7- oder αEβ7-Integrins moduliert, inhibiert oder aktiviert, umfassend: – Kontaktieren (i) einer markierten Membranpräparation, die α4β7- oder αEβ7-Integrin umfasst, und einer Kandidatenverbindung mit (ii) einem Trägermaterial, das α4β7- bzw. αEβ7-Integrin über einen Liganden davon bindet, und ein Szintillationsmittel enthält, – Feststellen der Menge an α4β7- oder αEβ7-Integrin, das an den Träger gebunden ist, und – Vergleichen der Menge an Integrin, das an den Träger in Anwesenheit und in Abwesenheit der Kandidatenverbindung und/oder in Gegenwart eines blockierenden Antikörpers gebunden ist, und Selektieren oder Identifizieren der Verbindung, die die besagte Menge moduliert.
Verfahren nach Anspruch 1, um einen Inhibitor von α4β7-Integrin zu selektieren oder identifizieren.
Verfahren nach Anspruch 1, um einen Inhibitor von αEβ7-Integrin zu selektieren oder zu identifizieren.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Membranpräparation eine ganze Zelle oder eine Präparation, abgeleitet von einer ganzen Zelle, die eine Membranfraktion davon umfasst, ist, wobei die Zelle oder Membranfraktion α4β7- oder αEβ7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Membranpräparation ein Zelllysat ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Membranpräparation von einer rekombinanten Zelle, die α4β7- oder αEβ7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon exprimiert, erhalten ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die rekombinante Zelle menschliches α4β7- oder αEβ7-Integrin, oder einen funktionellen Teil davon, exprimiert.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Membranpräparation radiomarkiert, stärker bevorzugt tritiiert, ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Membranpräparation durch Kultivieren einer Zelle in Gegenwart einer radiomarkierten Aminosäure vor dem Herstellen der Membranpräparation radiomarkiert wird.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Trägermaterial Yttrium-Silikat, Polyvinyltoluol (PVT), (Poly)acrylamid, Agarose, Sepharose oder Polystyrol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 10, wobei der Träger ein Kügelchen ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Trägermaterial mit einem Liganden von α4β7- oder αEβ7-Integrin beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Träger mit MADCAM-1 oder einem funktionellen Teil davon beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Träger mit E-Cadherin oder einem funktionellen Teil davon beschichtet ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Szintillationsmittel Diphenyloxazol ist.
Verfahren nach Anspruch 1, das das Kontaktieren der Kandidatenverbindung in einem Assay-Puffer mit – 0,05–5 mg/ml Liganden-beschichteten Kügelchen und – 1 × 10⁴–5 × 10⁸ cpm/ml radiomarkierter Membranpräparation umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Bestimmen der Menge des an das Trägermaterial gebundenen Integrins das Bestimmen des Szintillationssignals des Trägers umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei verschiedene Kandidatenverbindungen parallel getestet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Kontaktierens in einer Mikrotiterplatte durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Selektieren oder Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivität von Integrin α4β7 moduliert, umfassend: – Kontaktieren, in Anwesenheit oder Abwesenheit einer Kandidatenverbindung, (i) einer markierten Membranpräparation, die α4β7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon umfasst, mit (ii) einem Trägermaterial, beschichtet mit MADCAM-1 oder einem funktionellen Teil davon, das/der selektiv in der Membranpräparation enthaltenes α4β7 bindet, wobei das Trägermaterial ein Szintillationsmittel umfasst, und – Feststellen des Effekts der Kandidatenverbindung auf die Aktivität von Integrin α4β7 durch Vergleichen des Szintillationssignals in Anwesenheit und Abwesenheit der Kandidatenverbindung und/oder in Gegenwart eines blockierenden Antikör pers, wobei Verbindungen, die das Szintillationssignal modulieren, Verbindungen darstellen, die die Aktivität modulieren.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Selektieren oder Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivität von Integrin αEβ7 moduliert, das umfasst: – Kontaktieren, in Anwesenheit oder Abwesenheit einer Kanndidatenverbindung, (i) einer markierten Membranpräparation, die αEβ7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon umfasst mit (ii) einem Trägermaterial, beschichtet mit E-Cadherin oder einem funktionellen Teil davon, das/der selektiv in der Membranpräparation enthaltenes αEβ7 bindet, wobei das Trägermaterial ein Szintillationsmittel umfasst, und – Feststellen des Effekts der Kandidatenverbindung auf die Aktivität von Integrin αEβ7 durch Vergleichen des Szintillationssignals in Anwesenheit und Abwesenheit der Kandidatenverbindung und/oder in Gegenwart eines blockierenden Antikörpers, wobei Verbindungen, die das Szintillationssignal modulieren, Verbindungen darstellen, die die Aktivität modulieren.
Kit zur Verwendung beim Durchmustern von Modulatoren von αEβ7- oder α4β7-Integrin, wobei der Kit eine markierte Membranpräparation, die αEβ7- oder α4β7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon umfasst, und ein Trägermaterial umfasst, wobei das Trägermaterial einen Liganden umfasst, der αEβ7- oder α4β7-Integrin oder einen funktionellen Teil davon bindet und ein Szintillationsmittel enthält.