DE69629684T2 - Funktioneller bioassay für an g-protein gekoppelte rezeptoragonisten und antagonisten - Google Patents

Funktioneller bioassay für an g-protein gekoppelte rezeptoragonisten und antagonisten Download PDF

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Description

  • Zelluläre Antworten auf externe Reize sind vorwiegend mit Hilfe auf Rezeptoren basierende Systeme vermittelt. Eine der am weitesten verbreiteten und größten Transmembranrezeptorfamilien mit einem Organismenspektrum, das sich von Bakterien über Hefe bis zum Menschen erstreckt, ist die Familie der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Rezeptoren dieser Familie sind mit einem Membrangebundenen Protein assoziiert, das sich aus α, β und γ-Untereinheiten zusammensetzt. Nach Binden eines Agonisten an den Rezeptor erfährt das G-Protein eine Konformationsänderung, welche die α-Untereineinheit veranlasst, ein gebundenes GDP-Molekül gegen ein GTP-Molekül auszutauschen und von den βγ-Untereinheiten abzudissoziieren. Die GTP-gebundene Form der α-Untereinheit dient typischerweise als ein Effektor-modulierender Teil, der zur Produktion eines zweiten Messengers wie beispielsweise cyclisches AMP (z. B. durch Aktivierung von Adenylatcyclase), Diacylglycerol oder Inositolphosphaten führt. Mehr als 20 verschiedene α-Untereinheiten-Typen sind im Menschen bekannt, die mit einem kleineren Pool an β und γ-Untereinheiten assoziieren. Folglich können verschiedene G-Protein gekoppelte Rezeptoren mit G-Protein mit verschiedenen α, β und/oder γ-Untereinheiten assoziiert sein. Einen Überblick über Signaltransduktion durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren geben Gilman, A. G. (1987) Annu. Rev. Biochem. 56 : 615–649; Stryer, L. und Bourne, H. R. (1986) Annu. Rev. Cell. Biol. 2 : 391–419; und Birnbaumer, L. (1990) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 30 : 675–705.
  • Die meisten GPCRs sind Mitglieder der sieben Transmembransegment-(7 TMS)-Rezeptor-Familie. Diese Familie besteht aus mindestens einigen hundert unterschiedlichen Rezeptoren und umfasst Rezeptoren, die auf Signale aus dem Bereich der Umweltreize antworten, wie beispielweise Photonen, Geruchsmoleküle und süßschmeckende Zucker, und an der intrazellulären Kommunikation beteiligte Moleküle, wie beispielsweise Biogene Amine, Lipide, Peptide und Glycoproteine, einschließlich Neurotransmitter, Neuromodulatoren und Hormone. Strukturell sind die Rezeptoren der 7 TMS Familie zusammengesetzt aus einer extrazellulären Amino-terminale Domäne, sieben hydrophoben Regionen, die sich über die Zellmembran erstrecken, sechs „Schleifen"-Domänen, die die Transmembransegmente (3 intrazelluläre und 3 extrazelluläre) verbinden, und bei vielen aber nicht allen Mitgliedern einer intrazellulären Carboxy-terminalen Domäne. Die Transmembransegmente der 7 TMS Familie zeigen eine beträchtliche Homologie, während die verbindenden Schleifen weniger konserviert sind und nur eine große Homologie mit anderen eng verwandten Rezeptor-Subtypen zeigen. Zwei der am ausgiebigsten untersuchten 7 TMS Rezeptoren sind Rhodopsin, das in retinalen Stäbchenzellen exprimiert ist und Lichtenergie in ein neurochemisches Signal umwandelt (siehe z. B. Nathans, J. (1987) Annu. Rev. Neurosci. 10 : 163–194) und der β2-adrenerge Rezeptor, der in den meisten Säugergeweben exprimiert ist und Adenylatcyclase zur Produktion von cAMP aktiviert (siehe z. B. Dixon, R. A. F. et al. (1986) Nature 321 : 75–79). Zusätzlich hat die konservierte Struktur unter den 7 TMS-Rezeptoren die Klonierung vieler neuer Gene erlaubt, die 7 TMS-Rezeptoren codieren, deren natürlicher Ligand und Funktion jetzt geklärt werden sollen. Diese Rezeptoren sind als „verwaiste" Rezeptoren bezeichnet worden (siehe z. B. Mills, A. und Duggan, M. J. (1993) Trends in Pharmacological Sciences 14 : 394–396). Zum Überblick über 7 TMS-Rezeptoren siehe z. B. Dohlman, H. G. et al., (1991) Annu. Rev. Biochem. 60 : 653–688; und Lefkowitz, R. J. et al. (1993) Trends in Pharm. Sciences 14 : 303–307.
  • Auf Grund der Beteiligung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren bei der Regulation vieler sehr entscheidender biologischer Funktionen können Krankheitszustände durch Aktivierung oder Blockade eines G-Protein gekoppelten Rezeptors beeinflusst oder bestimmt sein. Für Humanerkrankungen verantwortliche Rezeptor-Mutationen werden immer mehr aufgeklärt und können entweder Funktionsverlustmutationen oder Aktivierungsmutationen sein. Beispiele umfassen Mutation des Thyreotropinrezeptor-Gens, die zur Hyperthyreose führen (siehe z. B. Parma, J. et al. (1993) Nature 365 : 649–651), Mutation des Rhodopsin-Gens, die zur Retinitis pigmentosa führt (siehe z. B. Keen, T. J. et al. (1991) Genomics 11 : 199–205; und Robinson, P. R. et al. (1992) Neuron 9 : 719–725), Mutation des luteinisierenden Hormonrezptor-Gens, die zu Pubertas praecox führt (siehe z. B. Shenker, A. et al (1993) Nature 365 : 652–654) und Mutationen des Adrenocorticotropinrezeptor-Gens, die zu familiärem Glucocorticoid-Mangel führt (siehe z. B. Clark, A. J. L. (1993) Lancet 341 : 461–462). Für einen Überblick über die Rolle von GPCRs bei Krankheiten siehe Coughlin, S. R. (1994) Curr. Op. Cell. Biol. 6 : 191–197.
  • Zahlreiche bedeutende Medikamente zur Behandlung verschiedener Krankheitszustände wirken über die Beeinflussung der Aktivität von G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Beispiele umfassen Agonist-Analoga des Gonadotropin abgebenden Hormons, wie beispielsweise Leuprolid, Gonadorelin und Nafarelin, die zur Behandlung von Prostata- und Brustkarzinomen, uterine Leiomyoma, Endometriose, Pubertas praecox und nicht tumorartiges ovarialhyperandrogenes Syndrom eingesetzt worden sind (siehe z. B. Pace, J. N. et al. (1992) Am. Fam. Physician 44 : 1777–1782), den cardialen β-adrenergen Rezeptor-Antagonisten Propranolol, der zur Behandlung von Bluthochdruck, Angina pectoris und psychiatrischen Krankheiten (siehe z. B. Nace, G. S. und Wood, A. J. (1987) Clin. Pharmacokinet. 13 : 51–64; Ananth, J. und Lin, K. M. (1986) Neuropsychobiology 15 : 20–27), den pulmonären β2-adrenergen Rezeptor-Agonisten Metaproterenol, der als Bronchodilatator eingesetzt worden ist (siehe z. B. Hurst, A. (1973) Ann. Allergy 31 : 460–466) und den Histamin 2 Rezeptor-Antagonisten Cimetidin, der zur Behandlung von Ulzera und idiopathischer Urticaria eingesetzt worden ist ( siehe z. B. Sontag, S. et al. (1984) N. Engl. J. Med. 311 : 689–693; Choy, M. und Middleton, R. K. (1991) DICP 25 : 609–612).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In Anbetracht der bedeutenden Rolle von GPCRs sowohl bei gewöhnlichen zellulären Antworten als auch bei anormalen Krankheitsprozessen sind Tests, die die Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten von GPCRs erlauben, sehr . erwünscht. Diese Erfindung stellt funktionelle Bioassays zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten von sehr unterschiedlichen GPCRs bereit. Die Bioassays sind einfach, schnell und erlauben einen hohen Durchsatz. Darüber hinaus ermöglichen diese Durchmusterungsverfahren ein Testen von Säuger-GPCRs und insbesondere von menschlichen GPCRs in einer Säugerzellumgebung. Verbindungen können in diesen Assays einzeln oder bevorzugter in Verbindungsbibliotheken getestet werden. Folglich erlauben die Assays eine schnelle Durchmusterung großer Testreihen an Verbindungen. Außerdem können die Assays der Erfindung sowohl bei bekannten GPCRs als auch bei „verwaisten" GPCRs, deren natürlicher Ligand nicht bekannt ist, angewandt werden. Folglich sind die Verfahren der Erfindung zur Identifizierung therapeutisch zweckdienlicher Agonisten oder Antagonisten bekannter GPCRs wie auch zur Erforschung der Funktion verwaister GPCRs anwendbar.
  • In den Verfahren der Erfindung ist eine Population an Indikatorzellen (z. B. Säugerzellen) mit einer Test-Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die eine oder mehrere Test-Verbindungen enthält, und es wird mindestens ein Parameter des Zellstoffwechsels der Indikatorzellen gemessen und die Test-Verbindung(en) wird(werden) als Rezeptor-Agonist oder Antagonist identifiziert. Die Indikatorzellen exprimieren den GPCR von Interesse, vorzugsweise durch Einführung eines den GPCR codierenden Nucleinsäure-Moleküls in die Zellen. Die Test-Zusammensetzung kann ein oder mehrere (z. B. eine Bibliothek) Test-Verbindungen umfassen. Zusätzlich können die Test-Zusammensetzungen einen oder mehrere bekannte Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten umfassen. Zum Beispiel kann eine Test-Verbindung als ein Rezeptor-Antagonist beruhend auf ihrer Fähigkeit identifiziert werden, die Wirkungen eines bekannten Rezeptor-Agonisten auf die Indikatorzellen zu verändern, wenn die Indikatorzellen sowohl mit der Test-Verbindung als auch dem bekannten Rezeptor-Agonisten in Kontakt gebracht sind. Außerdem kann die Test-Verbindung ein oder mehrere Mittel enthalten, die den Metabolismus eines zweiten Messengers in den Indikatorzellen verändern:
  • Bevorzugte GPCRs für Verwendung in den Assays der Erfindung umfassen luteinisierendes Hormon abgebenden Hormonrezeptor (LHRH-R; auch als Gonadotropin abgebender Hormonrezeptor (GnRH) bezeichnet), M1 Muscarin-Rezeptor und β2-adrenerger Rezeptor (β2-AR). In einer anderen Anwendungsform koppelt der GPCR an ein Gq/11 G-Protein (z. B. LHRH-R, Acetylcholin, Adenosin 1, α-adrenergen, Angiotensin, Bombesin, Bradykinin, C5a, Cholycystokinin, Endothelin, Glutamat, 5HT, Histamin (H1-Subtyp), Neurotensin, Neurokinin, Oxytocin, Thyreotropin abgebendes Hormon, Thyreoidea stimulierendes Hormon, Thromoboxan A2 und Vasopressin). In einer anderen Anwendungsform-koppelt der GPCR an ein GS G-Protein (z. B. β2-AR, cardialen β-adrenergen, Histamin (H2-Subtyp), Thyreotropin, Wachstumshormon freisetzender Faktor und adrenocorticotropes Hormon). In einer noch anderen Anwendungsform ist GPCR ein chimärer Rezeptor, der aus mindestens einer Ligand-bindenden Domäne eines ersten sieben Transmembransegment-Rezeptors und wenigstens einer Signaltransduktionsdomäne eines zweiten sieben Transmembransegment-Rezeptors zusammengesetzt ist, so dass der chimäre Rezeptor an ein Gq/G11 G-Protein in den Indikatorzellen koppelt. In einer noch weiteren Anwendungsform ist GPCR ein verwaister Rezeptor (d. h. der natürliche Ligand für den G-Protein gekoppelten Rezeptor ist unbekannt).
  • In einer Anwendungsform des Durchmusterungsassays der Erfindung ist der in den Indikatorzellen gemessene Parameter des Zellmetabolismus die Lebensfähigkeit oder die Proliferation. Zum Beispiel kann eine Test-Verbindung als ein Rezeptor-Agonist identifiziert werden, beruhend auf ihrer Fähigkeit, die Lebensfähigkeit und/oder Proliferation der Indikatorzellen zu mindern, wenn sie mit den Indikatorzellen in Kontakt gebracht ist. Alternativ kann eine Test-Verbindung als ein Rezeptor-Antagonist identifiziert werden, beruhend auf ihrer Fähigkeit, die Lebensfähigkeit und/oder Proliferation der Indikatorzellen zu erhöhen, wenn sie mit den Indikatorzellen und einem bekannten Rezeptor-Agonisten in Kontakt gebracht ist. In dieser Anwendungsform koppelt der GPCR vorzugsweise an ein Gq/11 G-Protein (z. B. LHRH-R) oder ist ein chimärer GPCR, der aus einer Signaltransduktionsdomäne(n) zusammengesetzt ist, das dem chimären GPCR das Koppeln an Gq/11 G-Protein erlaubt.
  • In einer anderen Anwendungsform des Durchmusterungsassays der Erfindung ist der in den Indikatorzellen gemessene Parameter des Zellmetabolismus die Zellmorphologie. Zum Beispiel kann eine Test-Verbindung als ein Rezeptor-Agonist beruhend auf ihrer Fähigkeit identifiziert werden, die Morphologie der Indikatorzellen zu verändern, wenn sie mit den Indikatorzellen in Kontakt gebracht ist. Alternativ kann eine Test-Verbindung als ein Rezeptor-Antagonist identifiziert werden, beruhend auf ihrer Fähigkeit, den Indikatorzellen ihre ursprüngliche Morphologie wieder zu verleihen, wenn sie mit den Indikatorzellen und dem bekannten Rezeptor-Agonisten in Kontakt gebracht ist.
  • Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Herstellung einer Zelle, die einen rekombinanten G-Protein gekoppelten Rezeptor auf einer Membran der Zelle exprimiert, zur Verwendung als eine Indikatorzelle in den Durchmusterungsassays bereit. In diesem Verfahren wird ein Nucleinsäure-Molekül, das den Rezeptor codiert, in die Zelle unter Bedingungen eingeführt, unter denen eine Stimulierung des Rezeptors durch Rezeptor-Agonisten gehemmt ist. Ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegt eine stabile Population an Zellen, die einen rekombinanten G-Protein gekoppelten Rezeptor in einem Kulturmedium unter Kulturbedingungen exprimieren, unter denen eine Stimulierung des Rezeptors durch Rezeptor-Agonisten gehemmt ist.
  • Nucleinsäure-Moleküle, die chimäre GPCRs codieren, und Wirtszellen, die GPCRs exprimieren, sind ebenfalls von der Erfindung bereitgestellt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A-B sind graphische Darstellungen der Reduktion von MTT durch CHO-Zellen, die entweder nichttransfiziert (Bild A) oder transfiziert sind, um luteinisiertes Hormon abgebenden Hormon-Rezeptor (LHRH-R) zu exprimieren (Bild B), bei Vorliegen steigender Konzentrationen ausschließlich eines LHRH-R Agonisten, bei Vorliegen steigender Konzentrationen ausschließlich eines LHRH-R Antagonisten (Antide), oder für die transfizierten Zellen (Bild B), steigenden Konzentrationen eines LHRH-R Agonisten zusammen mit 1 nM, 10 nM oder 100 nM Antagonist.
  • 2A–B sind graphische Darstellungen der Reduktion von MTT durch CHO-Zellen, die entweder nichttransfiziert (Bild A) oder transfiziert sind, um M1 Muscarin-Rezeptor zu exprimieren (Bild B), bei Vorliegen steigender Konzentrationen ausschließlich eines M1 Muscarin-Rezeptor Agonisten (Carbachol), bei Vorliegen steigender Konzentrationen ausschließlich eines M1 Muscarin-Rezeptor. Antagonisten (Pirenzepin) oder steigenden Konzentration von Agonist zusammen mit 1 μM (nur Bild B), 10 μM oder 100 μM Antagonist.
  • 3 ist eine graphische Darstellung der Reduktion von MTT durch CHO-, Zellen, transfiziert mit dem LHRH-Rezeptor in einem Assay, in dem eine kombinatorische Peptid-Bibliothek mit den CHO-Zellen entweder in Anwesenheit (schwarze Balken) oder Abwesenheit (weiße Balken) des LHRH Agonisten D-His6-LHRH (mit 1 nM) inkubiert wurde. Zwei Proben wurden mit einem bekannten LHRH-Agonisten oder Antagonisten „versetzt", um zu zeigen, dass sowohl Agonisten als auch Antagonisten unter Anwendung dieses Assays identifiziert werden können.
  • 4 ist ein Photographie von CHO-Zellen, die die Wirkung des β2-adrenergen Rezeptor-Agonisten Salbutamol auf die Morphologie und Anordnung von CHO-Zellen zeigt, die den humanen β2-adrenergen Rezeptor exprimieren.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Diese Erfindung stellt Verfahren zur Identifizierung G-Protein gekoppelter Rezeptor-(GPCR)-Agonisten oder Antagonisten bereit, d. h. Durchmusterungsassays auf Mittel, die die Aktivität eines GPCR stimulieren oder inhibieren. Die Verfahren der Erfindung sind funktionelle Bioassays. Die Verfahren beruhen wenigstens zum Teil auf der Entdeckung von nachweisbaren Änderungen im Zellmetabolismus, die in den GPCR exprimierenden Indikatorzellen erfolgen, wenn die Indikatorzellen mit einem Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten in Kontakt gebracht sind. In verschiedenen Anwendungsformen umfassen diese nachweisbaren Änderungen im Zellmetabolismus Änderungen der Zelllebensfähigkeit, Zellprolifaration oder Zellmorphologie. Zum Beispiel beruht eine Anwendungsform des Verfahrens der Erfindung wenigstens zum Teil auf der Entdeckung, dass eine Indikatorzelle, die einen GPCR exprimiert, eine verminderte Zelllebensfähigkeit und/oder Zell-proliferation in Anwesenheit eines Rezeptor-Agonisten zeigt. Darüber hinaus kann die Zelllebensfähigkeit und/oder Zellproliferation in Anwesenheit eines Rezeptor-Agonisten durch zusätzliche Anwesenheit eines Rezeptor-Antagonisten wiederhergestellt werden. Eine weitere Anwendungsform des Verfahrens der Erfindung beruht wenigstens zum Teil auf der Entdeckung, dass eine Indikatorzelle, die einen GPCR exprimiert, nachweisbare Veränderungen der Zellmorphologie in Anwesenheit eines Rezeptor-Agonisten zeigt und dass diese morphologischen Veränderungen in Anwesenheit eines Rezeptor-Antagonisten zurückgebildet werden.
  • Die Verfahren der Erfindung sind einfach, schnell und sind Assays mit hohem Durchsatz, die eine effiziente, Durchmusterung entweder einzelner Verbindungen oder Verbindungsbibliotheken erlauben. Außerdem sind diese Verfahren auf unterschiedliche GPCRs breit anwendbar und können sogar für eine Identifizierung von „verwaisten" Rezeptoren unbekannter Funktion angewandt sein. Demgemäß können die Verfahren der Erfindung sowohl zur Erforschung der GPCR-Funktion als auch zur Identifizierung von Verbindungen angewandt sein, die zur Manipulation oder Änderung der GPCR-Aktivität, z. B. für therapeutische Zwecke, zweckdienlich sind. In einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung sind Säugerzellen als Indikatorzellen in den Durchmusterungsassays eingesetzt, wobei dadurch die Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten von Säugerzellen im Kontext der Säugerzellumgebung ermöglicht wird.
  • Weitere Aspekte der Erfindung betreffen Verfahren zur Herstellung von Indikatorzellen, die für Durchmusterungsassays der Erfindung zweckdienlich sind, und Zusammensetzungen, z. B. Zellen und Vektoren, die in den Assays verwendet werden. Die verschiedenen Aspekte der Erfindung sind unten noch genauer beschrieben.
  • In einer Anwendungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Agonisten oder Antagonisten eines G-Protein gekoppelten Rezeptors bereit, umfassend:
    • a) Inkontaktbringen einer Population an Indikatorzellen mit einer Test-Zusammensetzung, die wenigstens eine Test-Verbindung enthält,
    • b) Messen wenigstens eines Parameters des Zellmetabolismus der Indikatorzellen; und
    • c) Identifizieren der wenigstens einen Test-Verbindung der Test-Zusammensetzung als ein Agonist oder ein Antagonist des G-Protein gekoppelten-Rezeptors.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „G-Protein gekoppelter Rezeptor" (oder „GPCR") auf einen Rezeptor, der, wenn er von einer Zelle exprimiert ist, sich mit einem G-Protein (z. B. ein Protein, das aus α, β und γ-Untereinheiten zusammengesetzt ist und GTP hydrolysiert) verbindet. Vorzugsweise ist der GPCR ein „sieben Transmembransegment-Rezeptor" (oder 7 TMS-Rezeptor"), der sich auf ein Protein bezieht, dessen Struktur sich durch sieben hydrophobe transmembranerstreckende Bereiche auszeichnet.
  • Beispiele für GPCRs, die für eine Verwendung in den Verfahren der Erfindung geeignet sind, umfassen luteinisierendes Hormonabgebenden Hormonrezeptor (LHRH) (auch als Gonadotropin abgebender Hormonrezeptor (GnRH) bezeichnet), M1 Muscarin-Rezeptor und den β2-adrenergen Rezeptor. Weitere bevorzugte Rezeptoren umfassen Opioid-Rezeptoren, Endothelin-Rezeptoren, Angiotensin-Rezeptoren, Neuropeptid Y Rezeptoren und Serotonin K Rezeptoren.
  • Zusätzliche Gruppen von GPCRs sind entsprechend des G-Proteins klassifiziert worden, an das sie intrazellulär koppeln (d. h. sich verbinden mit). Demgemäß koppelt (verbindet sich mit) in einer Anwendungsform der in dem Durchmusterungsassay eingesetzte GPCR an ein Gq/11 G-Protein. Beispiele für GPCRs, die an Gq/11 G-Protein koppeln, umfassen die folgenden Rezeptoren: LHRH (=GnRH), Acetylcholin (Subtypenml, 3 und 5), M1 Muscarin, Adenosin 1, α-adrenerger (Subtypen a1A, a1B und a1C), Angiotensin (Subtyp AT1A), Bombesin (Subtypen BB1 und BB2), Bradykinin (Subtyp B2), C5a, Cholycystokinin (Subtypen CCKa und CCKb), Endothelin (Subtypen Eta und Etb), Glutamat (Subtypen mGlu1, 5), 5HT (Subtypen 2A, B und C), Histamin (H1-Subtyp), Neurotensin, Neurokinin (Subtypen NK2, 3), Oxytocin, Thyreotropin abgebendes Hormon (TRH), Thyreoidea stimulierendes Hormon (TSH), Thromoboxan A2 und Vasopressin (Subtypen V1a).
  • In einer anderen Anwendungsform koppelt (d. h. verbindet sich mit) der in den Durchmusterungsassays eingesetzte GPCR an ein GS G-Protein. Beispiele für GPCRs, die an ein GS G-Protein koppeln, umfassen die folgenden Rezeptoren: β2-adrenerger, cardialer β-adrenerger, Histamin (H2-Subtyp), Thyreotropin, Wachstumshormon freisetzender Faktor und adrenocorticotropes Hormon(ACTH), 5HT4, Follikel stimulierendes Hormom (FSH), Thyreoidea stimulierendes Hormon (TSH), GLP-1, Glucagon, Domamin5 (D5), Dopamin1 (D1), Calcitonin, Adenosin2β (A2β), Vasopressin2, vasoaktives Intestinalpolypeptid und Parathormon.
  • In anderen Anwendungsform koppelt (d. h. verbindet sich mit) der in dem Durchmusterungsassay eingesetzte GPCR an ein G; G-Protein. Beispiele für GPCRs, die an ein G; G-Protein koppeln, umfassen die folgenden Rezeptoren: 5HT (Subtypen 1A, 1B, 1D und 1F), mGlutaminR (Subtypen 2, 3), Dopamin4 (D4), Dopamin-2 (D2) Cannabinoid, Adenosin3 (A3), Somatostatin (Subtypen 3, 4), μ-Opiod, δ-Opiod, k-Opiod, Neuropeptid Y (Subtypen 1, 2).
  • In einer noch weiteren Anwendungsform ist der GPCR ein in der Technik als „verwaister" Rezeptor bezeichneter Rezeptor. Bin verwaister Rezeptor ist ein GPCR, der in seiner Struktur ähnlich zu anderen GPCRs ist, für den aber ein natürlicher Ligand vor Einsatz des verwaisten Rezeptors in dem Durchmusterungsassay der Erfindung unbekannt ist. In letzterer Anwendungsform kann der Durchmusterungsassay folglich zur Identifizierung von Test-Verbindungen als Liganden für den verwaisten Rezeptor eingesetzt sein. Zum Beispiel können natürlich vorkommende Substanzen in dem Test durchmustert werden, um zu erforschen, ob sie natürliche Liganden für den verwaisten Rezeptor sind. Demgemäß können die Bioassays der Erfindung zusätzlich zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten für bekannte GPCRs ebenfalls zur Erforschung der Funktion von verwaisten GPCRs durch Identifizierung von Liganden für diese Rezeptoren zweckdienlich sein.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich ein Rezeptor „Antagonist" auf ein Mittel, das die Aktivität eines GPCR hemmt, wohingegen ein Rezeptor „Agonist" sich auf ein Mittel bezieht, das die Aktivität eines GPCR stimuliert. Inhibition oder Stimulierung der Rezeptoraktivität durch einen Antagonisten beziehungsweise Agonisten kann partiell oder komplett erfolgen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Population an Indikatorzellen" auf eine Menge an Zellen, die wenigstens einen GPCR. von Interesse exprimieren (d. h. der GPCR, für den ein Rezeptor-Agonist oder Antagonist identifiziert werden soll). Eine Indikatorzelle „exprimiert" einen GPCR, wenn der GPCR auf einer Membran der Indikatorzellen vorhanden ist. Die Indikatorzellen können natürlicherweise den GPCR von Interesse exprimieren (auch als „endogene" Expression bezeichnet) oder bevorzugter die Indikatorzellen exprimieren den GPCR von Interesse, weil ein Nucleinsäure-Molekül, das den Rezeptor codiert, in die Indikatorzellen eingeführt worden ist und dadurch eine Expression des Rezeptors auf der Membran der Zellen ermöglicht ist (auch als „exogene" Expression bezeichnet).
  • Zellen, die einen GPCR endogen exprimieren, sind in der Technik gut bekannt und können in den Durchmusterungsassays der Erfindung verwendet sein. Es ist allerdings bevorzugter, dass eine Indikatorzelle für Verwendung in dem Assay durch Einführen einer das Gen von Interesse codierenden Nucleinsäure (z. B. DNS) in die Zelle hergestellt wird, so dass der GPCR auf einer Membran der Zelle exprimiert ist. Vorzugsweise exprimiert die Indikatorzelle den GPCR von Interesse nicht vor Einführung der GPCR-codierenden Nucleinsäure in die Zelle. Die in die Zelle eingeführte GPCR-codierende Nucleinsäure ist in einer für die Expression des Rezeptors auf einer Membran geeigneten Form, was bedeutet, dass die Nucleinsäure sämtliche codierenden und regulatorischen Sequenzen enthält, die für Transkription und Translation der Nucleinsäure, die den GPCR codiert, notwendig sind und Promotoren, Enhancer und Polyadenylierungssignale und Sequenzen umfassen kann, die für Transport des Rezeptors an die Zelloberfläche notwendig sind, einschließlich N-terminaler Leader-Sequenzen. In einer bevorzugten Anwendungsform ist die in die Zellen eingeführte Nucleinsäure ein rekombinanter Expressionsvektor, der eine den GPCR codierende cDNS trägt. In rekombinanten Expressionsvektoren sind die für die Transkription und/oder Translation verantwortlichen regulatorischen Funktionen oftmals von viralen Sequenzen bereitgestellt. Beispiele normalerweise verwendeter viraler Promotoren und/oder Enhancer umfasser diejenigen, die von Polyoma-Virus, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian-Virus 40 und retroviralen LTRs abstammen. Geeignete Expressionsvektoren für Expression eines GPCR in einer Indikatorzelle sind in der Technik bekannt und viele sind im Handel erhältlich. Der rekombinante Expressionsvektor kann zum Beispiel ein Plasmid-Vektor oder ein virales Vektor (z. B. ein retroviraler Vektor, ein adenoviraler Vektor oder ein Adenoassoziierter viraler Vektor) sein. Expression des GPCR auf der Oberfläche der Indikatorzelle kann erreicht werden zum Beispiel durch Aufnahme der nativen Sequenz des GPCR in die cDNS, die in dem rekombinanten Expressionsvektor enthalten ist, und vorzugsweise durch Addition einer heterologen Signalsequenz (d. h. von einem anderen Protein) für die native GPCR-Sequenz, um den intrazellulären Verarbeitungspfad des GPCR zu verändern. Es ist in der Technik bekannt, dass die Verwendung einer heterologen Leader-Sequenz die Expressionseffizienz eines Proteins in einem Wirt verbessern kann. Zum Beispiel kann die Leader-Sequenz vom Gewebe-Plasminogen-Faktor (tPA) zu der nativen Sequenz eines GPCR zugefügt sein.
  • Zusätzlich zur Einführung eines Nucleinsäure-Moleküls, das GPCR codiert, können weitere Nucleinsäure-Moleküle, die andere Genprodukte codieren, ebenfalls in die Wirtszelle eingeführt sein, falls dies erwünscht ist, um die Ansprechempfindlichkeit der Wirtszellen (z. B. ihre Empfindlichkeit für Agonisten oder Antagonisten zu erhöhen oder zu vermindern) zu modulieren. Zum Beispiel kann ein Nucleinsäure-Molekül, das ein G-Protein von Interesse (z. B. Gq/11, GS, Gi etc.) ass das G-Protein in der codiert, in die Wirtszelle cotransfiziert werden, so der Wirtszelle exprimiert ist (z. B. entweder um die Menge an exprimierten G-Protein in einer Wirtszelle zu erhöhen, die dasselbe G-Protein endogen exprimiert, oder alternativ die Expression eines bestimmten G-Proteins in einer Wirtszelle zu ermöglichen, die dieses bestimmte G-Protein nicht endogen exprimiert.
  • Eine einen GPCR codierende Nucleinsäure (z B. einen rekombinanten Expressionsvektor) kann in Zellen mit verschiedenen bekannten zweckdienlichen Transfektionstechniken eingeführt sein, einschließlich Elektroporation, Calcium-Phosphat-Präzipitation, DEAE-Dextran-Behandlung, Lipofektion, Mikroinjektion und Injektion mit viralen Vektoren. Geeignete Verfahren zur Einführung von Nucleinsäure in Zellen können Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) und weiteren Laborhandbüchern entnommen werden und Kits für die Transfektion von Zellen sind im Handel erhältlich. Zellen können vorübergehend transfiziert sein oder bevorzugter die Zellen sind mit der GPCR-codierenden Nucleinsäure stabil transfiziert. Eine stabile Transfektion kann durch die Verwendung eines autonom replizierenden Expressionsvektors (z. B. eines episomalen Vektors) oder durch Selektion derjenigen Zellen, die die GPCR-codierende Nucleinsäure in ihre Genome integriert haben, erhalten werden. Da typischerweise nur ein kleiner Prozentsatz der transfizierten Zellen die eingeführte Nucleinsäure in ihr Genom integrieren, ist es von Vorteil, eine Nucleinsäure, die einen selektierbaren Marker codiert, zusammen mit der GPCRcodierenden Nucleinsäure in die Indikatorzellen zu transfizieren. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen Marker, die eine Arzneimittelresistenz verleihen, wie beispielsweise G418, Hygromycin und Methotrexat. Selektierbare Marker können mit dem selben Nucleinsäure-Molekül (z. B. Plasmid), das den GPCR codiert, oder können mit einem separaten Nucleinsäure-Molekül (z. B. Plasmid) eingeführt sein.
  • In einer bevorzugten Anwendungsform sind Säugerzellen die in, den Verfahren der Erfindung eingesetzten Indikatorzellen. Die Eignung des Durchmusterungsassays der Erfindung für Säugerzellen kann besonders von Vorteil sein, wenn der GPCR von Interesse von Menschen oder von anderen Säugern ist (z. B. GPCRs mit therapeutischer Bedeutung), da die Test-Verbindungen) gegen den Rezeptor innerhalb. des Kontextes einer Säugerzellumgebung getestet wird werden). Dies steht im Gegensatz zu Assay-Systemen, bei denen Hefe (z. B. PCT Anmeldung Nr. WO 94/23025; und Jeansonne, M. E. et al. (1994) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 206 : 35–44) oder Pigmentzellen von Amphibien oder Reptilien (z. B. PCT Anmeldung Nr. WO 92/01810; und Lerner; M. R. (1994) Trends in Neuroscience 17 : 142–146) eingesetzt sind. Nicht einschränkende Beispiele geeigneter Säugerzelllinien, die zur Herstellung der Indikatorzellen verwendet sein können, zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung umfassen Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), COS-Zellen, 3T3-Zellen, HeLa-Zellen und 293 Zellen. Die bevorzugtesten Zellen für Verwendung in den Verfahren der Erfindung sind CHO-Zellen. Weitere ähnlich geeignete Zellen sind dem Fachmann bekannt. Säugerzelllinien, aus denen Indikatorzellen präpariert werden können, sind von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, erhältlich.
  • Wie hier verwendet, umfasst der Ausdruck „Test-Zusammensetzung" beabsichtigterweise ein Material, das wenigstens eine „Test-Verbindung" umfasst, die . eine zu testende Verbindung bezeichnet, um zu bestimmen, ob sie ein Rezeptor-Agonist oder Antagonist ist. Eine Test-Zusammensetzung kann eine einzige Test-Verbindung oder mehrere Test-Verbindungen enthalten. Zum Beispiel können die Test-Verbindungen eine Bibliothek an Test-Verbindungen, z. B. eine kombinatorische Bibliothek aus Peptiden, umfassen. Eine Bibliothek von Test-Verbindungen kann in Pools durchmustert werden, und die Pools, die positiv auf den Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten testen, können unterteilt und erneut durchmustert werden: Dieser Vorgang kann dann sooft wie notwendig wiederholt werden, bis eine einzige positive Test-Verbindung aus der Bibliothek identifiziert ist.
  • Gegebenenfalls kann die Test-Zusammensetzung zusätzliche Substanzen umfassen. Zusätzliche Substanzen, die in der Test-Zusammensetzung enthalten sein können, umfassen bekannte Rezeptor-Agonisten und bekannte Rezeptor-Antagonisten. Zum Beispiel kann ein bekannter Rezeptor-Agonist in der Test-Zusammensetzung enthalten sein, um eine Stoffwechselantwort von den Indikatorzellen auszulösen, und eine Test-Verbindung kann als ein Rezeptor-Antagonist beruhend auf ihrer Fähigkeit identifiziert werden, eine von dem Rezeptor-Agonisten ausgelöste Stoffwechselantwort zu revertieren oder zu inhibieren. In ähnlicher Weise kann ein bekannter Rezeptor-Antagonist in der Test-Zusammensetzung enthalten sein, um eine Stoffwechselantwort von den Indikatorzellen auszulösen, und eine Test-Verbindung kann als ein Rezeptor-Agonist beruhend auf ihrer Fähigkeit identifiziert werden, eine von dem Rezeptor-Antagonisten ausgelöste Stoffwechselantwort zu revertieren oder zu inhibieren. Weitere Substanzen, die in der Test-Zusammensetzungenthalten sein können, umfassen Mittel, die den Metabolismus eines zweiten Messengers in der Indikatorzelle verändern. Beispiele für derartige Mittel umfassen Phorbolester (z. B. Phorbolmyristatacetat) Calcium-Ionophoren (z. B. A23181), Phosphodiesterase-Hemmer (z. B. Isobutylmethylxanthin) und Staurosporin. Derartige Mittel können in der Test-Zusammensetzung enthalten sein, um die Empfindlichkeit der Indikatorzellen auf die Test-Verbindungen) und/oder einen bekannten Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten zu verändern (z. B. erhöhen oder vermindern).
  • Wie hier verwendet, umfasst der Ausdruck „Parameter des Zellmetabolismus" beabsichtigterweise detektierbare Indikatoren von Zellantworten, die wenigstens zum Teil von einem GPCR, der von der Indikatorzelle exprimiert ist, reguliert sind. Beispiele für Parameter des Zellmetabolismus, die in den Assays der Erfindung, gemessen oder bestimmt werden können, umfassen Zelllebensfähigkeit, Zellproliferation und Zellmorphologie (unten detaillierter erklärt). Eine Test-Verbindung wird als Rezeptor-Agonist oder Antagonist identifiziert, wenn sie eine Änderung von wenigstens einem Parameter des Zellmetabolismus der Indikatorzellen verursacht, wenn die Test-Verbindung mit den Indikatorzellen in Kontakt gebracht ist, im Vergleich zudem Zellmetabolismus der Indikatorzellen in Abwesenheit der Test-Verbindung.
  • In einer Anwendungsform der Erfindung wird ein Agonist oder Antagonist eines GPCR beruhend auf seiner Fähigkeit identifiziert, die Lebensfähigkeit und/oder, Proliferation einer Population an Indikatorzellen zu verändern. Demgemäß stellt eine Anwendungsform der Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Agonisten oder eines Antagonisten eines G-Protein gekoppelten Rezeptors bereit, umfassend:
    • a) Inkontaktbringen einer Population an Indikatorzellen mit einer Test-Zusammensetzung, die wenigstens eine Test-Verbindung enthält;
    • b) Messen der Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen; und
    • c) Identifizieren der wenigstens einen Test-Verbindung als ein Agonist oder ein Antagonist des G-Protein gekoppelten Rezeptors.
  • Wie es noch detaillierter in Beispiel 2 und 3 beschrieben wird, zeigen GPCRexprimierende Indikatorzellen der Erfindung eine verminderte Lebensfähigkeit und/oder Proliferation, wenn sie mit einem Rezeptor-Agonisten in Kontakt gebracht sind. Überdies kann dieser verminderten Lebensfähigkeit und/oder Proliferation der Indikatorzellen entgegengewirkt oder revertiert werden durch weiteren Kontakt der Indikatorzellen mit einem Rezeptor-Antagonisten. Deshalb kann eine Test-Verbindung als ein Agonist eines GPCR beruhend auf ihrer Fähigkeit identifiziert werden, die Lebensfähigkeit und/oder Proliferation einer Population an Indikatorzellen zu vermindern, wenn sie mit den Zellen in Kontakt gebracht ist im Vergleich zu der Lebensfähigkeit und/oder Proliferation der lndikatorzellen in Abwesenheit der , Test-Verbindung.
  • In einer anderen Anwendungsform umfasst die Test-Zusammensetzung eine Test-Verbindungen) und wenigstens einen bekannten Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten. Zum Beispiel kann eine Test-Verbindung als ein Antagonist eines GPCR beruhend auf ihrer Fähigkeit identifiziert werden, die Lebensfähigkeit und/oder Proliferationeiner Population an Indikatorzellen zu erhöhen, wenn sie mit den Zellen in Anwesenheit eines Rezeptor-Agonisten in Kontakt gebracht ist im Vergleich zur Lebensfähigkeit und/oder Proliferation der Indikatorzellen in Anwesenheit ausschließlich des Rezeptor-Agonisten. Entsprechend stellt die Erfindung in einer anderen Anwendungsform ein Verfahren zur Identifizierung eines Antagonisten eines G-Protein gekoppelten Rezeptors bereit, umfassend:
    • a) Inkontaktbringen einer Population an Indikatorzellen mit einer Test-Zusammensetzung, die wenigstens einen bekannten Rezeptor-Agonisten enthält;
    • b) Messen der Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen; und
    • c) Identifizieren der wenigstens einen Test-Verbindung als ein Antagonist des G-Protein gekoppelten Rezeptors.
  • Da in diesem System der identifizierte Antagonist einen positiven Effekt auf die Indikatorzellen ausübt (d. h. der Antagonist stellt die Lebensfähigkeit und/oder Proliferationsantwort der Zellen wieder her) ist es unwahrscheinlich, dass falsch Positive mit dem Assay identifiziert werden. Dies steht im Gegensatz zu einem Assay-System, worin eine Stimulation des Antagonisten zum Zelltod führt, in diesem Fall werden Verbindungen, die für die Zellen unspezifisch toxisch sind, zusätzlich zu Verbindungen, die spezifisch als Rezeptor-Antagonisten wirken, selektiert werden.
  • Die Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen kann mit Hilfe eines von mehreren geeigneten Verfahren gemessen werden, die in der Technik bekannt sind. Zum Beispiel kann die Zelllebensfähigkeit durch Zählungen (z. B. mit einem Hämocytometer) der Zellen bestimmt werden, die vorzugsweise mit einem Farbstoff wie beispielsweise Trypanblau (das von lebenden Zellen nicht aufgenommen wird) oder durch Messen einer mit der Zelhebensfähigkeit korrelierenden Enzymaktivität in den Indikatorzellen, wie beispielsweise Reduktion eines Tetrazoliumsalzes.(z. B. 3,(4,4-Dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazoliumbromid [MTT]),das spektralphotometrisch (siehe Beispiele 2 und 3) detektiert werden kann. Zusätzlich kann die Zelllebensfähigkeit unter Verwendung von Indikatorfarbstoffen wie Propidiumiodid, Acridinorange und Hoechst 33342 bestimmt werden: Zellproliferation kann ebenfalls zum Beispiel mittels Aufnahme von Tritium markiertem Thymidin bestimmt werden. Bei Sängerzellen erfolgt die Messung der Zelllebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen typischerweise etwa 2 bis 7 Tage nach Kontakt mit der Test-Zusammensetzung.
  • Ein bevorzugter GPCR zur Verwendung in diesem Assay-System ist LHRH-R. Wie in Beispiel 2 gezeigt, wird die Reduktion von MTT durch die Zellen (als ein Indikator der Zelllebensfähigkeit) vermindert, wenn eine LHRH-R exprimierende Eierstockzelle des Chinesischen Hamsters (CHO) mit einem bekannten LHRH-R Agonisten in Kontakt gebracht ist. Überdies wird, wenn die LHRH-R exprimierenden CHO-Zellen sowohl mit einem Rezeptor-Agonisten als auch einem bekannten Rezeptor-Antagonisten in Kontakt gebracht sind, die von dem Agonisten induzierte verminderte Lebensfähigkeit der Zellen revertiert. Eine Test-Verbindungen) kann ähnlich gegen solche Zellen durchmustert werden und es wird die Lebensfähigkeit und/oder Proliferation der Zellen gemessen, um die Test-Verbindungen) als Rezeptor-Agonist oder Antagonist zu identifizieren. Bekannte LHRH-R Agonisten oder Antagonisten, die in der Test-Zusammensetzung enthalten sein können (z. B, ein bekannter Agonist kann in der Test-Zusammensetzung enthalten sein, um Test-Verbindungen als Rezeptor-Antagonisten zu identifizieren), sind im Handel erhältlich (z. B. von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Bevorzugte LHRH-R Agonisten umfassen LHRH-Analoga wie beispielsweise [D-His6]-LHRH, wohingegen ein bevorzugter LHRH-R Antagonist Antide ist.
  • Ein weiterer bevorzugter GPCR zur Verwendung in diesem Assay-System ist der M1 Muscarin-Rezeptor. Wie in Beispiel 3 gezeigt ist, wird die Reduktion von MTT durch die Zellen (als ein Indikator der Zelllebensfähigkeit) vermindert, wenn eine M1 Muscarin-Rezeptor-exprimierende CHO-Zelle mit einem bekannten M1 Muscarin-Rezeptor Agonisten in Kontakt gebracht ist. Überdies wird, wenn die M1 Muscarin-Rezeptor-exprimierenden CHO-Zellen sowohl mit einem Rezeptor , Agonisten als auch einem bekannten Rezeptor-Antagonisten in Kontakt gebracht sind, die vom Agonisten induzierte verminderte Lebensfähigkeit der Zellen revertiert. Eine Test-Verbindung(en) kann ähnlich gegen Zellen durchmustert werden und es wird die Lebensfähigkeit und/oder Proliferation der Zellen gemessen, um die Test-Verbindungen) als Rezeptor-Agonist oder Antagonist zu identifizieren. Bekannte M1 Muscarin-Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten, die in der Test-Zusammensetzung enthalten sein können (z. B, ein bekannter Agonist kann in der Test-Zusammen-setzung enthalten sein, um Test-Verbindungen als Rezeptor-Antagonisten zu identifizieren), sind im Handel erhältlich (z. B. von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Ein bevorzugter M1 Muscarin-Rezeptor-Agonist ist Carbachol, wohingegen ein bevorzugter M1 Muscarin-Rezeptor-Antagonist Pirenzepin ist.
  • In einer bevorzugten Anwendungsformen, wo die Lebensfähigkeit oder die Proliferation der Indikatorzellen als der Metabolismusparameter verwendet ist, beruhend darauf, welche Test-Verbindung als ein Rezeptor-Agonist oder Antagonist identifiziert ist, koppelt der von den Indikatorzellen exprimierte GPCR an ein Gg/11 G-Protein. Zusätzlich zum oben beschriebenen LHRH-Rezeptor umfassen weitere Beispiele für GPCRs, die an Gq/11 G-Protein koppeln, die folgenden Rezeptoren: M1 Muscarin, Acetylcholin (Subtypen ml, 3 und 5), Adenosin 1, α-adrenerger (Subtypen a1A, a1B und a1C), Angiotensin (Subtyp AT1A), Bombesin (Subtypen BB1 und BB2), Bradykinin (Subtyp B2), C5a, Cholycystokinin (Subtypen CCKa und CCKb), Endothelin (Subtypen Eta und Etb), Glutamat (Subtypen mGlu1, 5), 5HT (Subtypen 2A, B und C), Histamin (H1-Subtyp), Neurotensin, Neurokinin (Subtypen NK2, 3), Oxytocin, Thyreotropin abgebendes Hormon (TRH), TSH, Thromoboxan A2 und Vasopressin (Subtypen V1a).
  • In einer noch weiteren Anwendungsform ist der in diesem funktionellen Bioassay eingesetzte GPCR ein chimärer GPCR. Der chimäre GPCR umfasst wenigstens eine Ligand-bindende Domäne eines ersten sieben Transmembran-segment-(7 TMS)-Rezeptors und wenigstens eine Signaltransduktionsdomäne eines zweiten sieben Transmembransegment-(7 TMS)-Rezeptors. In einer bevorzugten Anwendungsform ist die Signaltransduktionsdomäne des zweiten sieben Transmembransegment (7 TMS) Rezeptors so ausgewählt, dass der chimäre Rezeptor an ein Gq/11 G-Protein in den Indikatorzellen koppelt. In einer anderen Anwendungsform ist die Signaltransduktionsdomäne des zweiten sieben Transmembransegment(7 TMS)-Rezeptors so ausgewählt, dass der chimäre Rezeptor an einen anderen Typ , des G-Proteins z. B. Gs oder Gi in den Indikatorzellen koppelt.
  • Mit Bezug auf die Struktur der 7 TMS-Rezeptoren werden die Transmembransegmente hier als TMS I-VII (vom N-Terminus zum C-Terminus) bezeichnet, die drei intrazellulären Schleifen werden als IC 1 (verknüpft TMS I und TMS In, IC 2 (verknüpft TMS II und TMS IV), IC 3 (verknüpft TMS V und TMS VI bezeichnet und die drei extrazellulären Schleifen werden als EC 1 (verknüpft TMS II und TMS III), EC 2 (verknüpft TMS N und TMS V), EC 3 (verknüpft TMS VI und TMS VII bezeichnet. Die „Ligand-bindende Domäne" eines 7 TMS-Rezeptors bezieht sich auf den/die Teile) des Rezeptors, der für eine Erkennung eines Liganden durch den Rezeptor erforderlich ist, wohingegen die „Signaltransduktionsdomäne" eines 7-TMS-Rezeptors sich auf den/die Teil(e) des Rezeptors bezieht, der für eine Signaltransduktion durch dem Rezeptor und insbesondere zum Koppeln des Rezeptors an ein spezifisches G-Protein (z. B. Gq/11) erforderlich ist.
  • Die Konstruktion und Expression von bestimmten chimären 7 TMS-Rezeptoren, die aus Teilen eines 7 TMS-Rezeptors zusammengesetzt sind, der an Teile eines zweiten 7 TMS-Rezeptors fusioniert ist, sind in der Technik beschrieben worden.
  • Zum Beispiel sind Chimären aus α2- und β2-adrenergen Rezeptoren (siehe z. B.
  • Kobilika, B. K. et al. (1988) Science 240 : 1310–1316); aus α1- und β2-adrenergen Rezeptoren (siehe z. B. Cotecchia, S. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2896–2900); aus M1 und M2 Muscarin-Rezeptoren (siehe z. B. Kubo, T. et al. (1988) FEBS Letters 241 : 119–125) konstruiert worden. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass verschiedene Strukturdeterminanten eines 7 TMS-Rezeptors zu den Ligand-bindenden Eigenschaften des Rezeptors oder zu den G-Protein koppelnden, Eigenschaften des Rezeptors beitragen. Insbesondere sind bei der G-Protein-Erkennung beteiligte Determinanten in der intrazellulären Schleife 3 (IC 3) kartiert worden, die TMS V und TMS VI verbindet. Demgemäß umfasst in einer Anwendungsform die „wenigstens eine Signaltransdaktionsdomäne eines zweiten 7 TMS-Rezeptors" des Chimären Rezeptors wenigstens die intrazelluläre Schleife 3 (IC 3) eines 7 TMS-Rezeptors, der an ein G-Protein von Interesse, z. B. ein Gq/11, Gs oder G; G-Protein, koppelt.
  • Vorzugsweise ist IC 3 von einem LHRH-Rezeptor (der an Gq/11 koppelt) verwendet. Bevorzugter ist IC 3 von einem humanen LHRH-Rezeptor verwendet. Die Nucleotid- und Aminosäure-Sequenzen von marinem und humanem LHRH-R sind in der PCT Veröffentlichung Nr. WO 94/00590 von S. C. Selfon offengelegt. Gemäß der Aminosäure-Sequenz von hier offengelegtem humanem LHRH-R entspricht IC 3 etwa Aminosäure-Resten 234 bis 268. Deshalb wird zur Konstruktion eines Chimären GPCR, der IC 3 von humanem LHRH R umfasst, eine Nucleotid-Sequenz, die die Reste 234 bis 268 von humanem LHRH-R codiert, gegen die Nucleinsäure-Sequenz, die IC 3 eines anderen 7 TMS-Rezeptors codiert, unter Verwendung von rekombinanten DNS-Standardverfahren (wie beispielsweise Polymerase-Kettenreaktion, Restriktionsendonuclease-Verdau, DNS-Ligation und ähnliches) ausgetauscht. Zum Beispiel ist zur Konstruktion eines chimären β2-adrenergen Rezeptors β2-AR)/LHRH-R Rezeptors die Region der IC 3 codierenden β2-AR cDNS deletiert und durch eine IC 3 codierende Nucleotid-Sequenz von LHRH-R ersetzt. Diese chimäre cDNS kann in einen rekombinanten Expressionsvektor kloniert und in Wirtszellen mit Hilfe von Standardtechniken eingeführt werden, wie es oben beschrieben ist, um Indikatorzellen zu bilden, die den chimären Rezeptor zur Verwendung in Bioassays der Erfindung exprimieren.
  • Zusätzlich zu IC 3 kann der chimäre Rezeptor weitere Teile des bei der Signaltransduktion beteiligten zweiten 7 TMS-Rezeptors enthalten, wie beispielsweise IC 1 und/oder IC 2. Zum Beispiel, wenn der zweite 7 TMS-Rezeptor des chimären Rezeptors humaner LHRH-R ist, können die Aminosäure-Reste 62–76 (entsprechen IC 1) und/oder 140–156 (entsprechen IC 2) vom humanen LHRH-R gegen die äquivalenten Domänen IC 1 und/oder IC 2 des ersten7 TMS-Rezeptors der Chimäre ausgetauscht sein. Überdies kann eine Carboxy-terminale Region deletiert oder der Chimäre zugefügt sein. Zum Beispiel, wenn der erste 7 TMS-Rezeptor der Chimäre (die die Ligand-bindende(n) Domäne(n) beisteuert) normalerweise eine Carboxy-terminale Region umfasst und der zweite 7 TMS-Rezeptor der Chimäre (die die Signaltransduktionsdomäne(n) beisteuern) LHRH-R ist, kann die Carboxyterminale des ersten 7 TMS-Rezeptors von der Chimäre deletiert oder weggelassen sein, da dem LHRH-Rezeptor normalerweise die Carboxy-terminale Region fehlt.
  • In einer anderen Anwendungsform der Erfindung ist ein Agonist oder Antagonist eines GPCR beruhend auf seiner Fähigkeit identifiziert, die Zellmorphologie einer Population an Indikatorzellen zu verändern. Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Agonisten oder eines Antagonisten eines G-Protein gekoppelten Rezeptors bereit, umfassend:
    • a) Inkontaktbringen einer Population an Indikatorzellen mit einer Test-Zusammensetzung, die wenigstens eine Test-Verbindung enthält;
    • b) Bestimmen der Morphologie der Indikatorzellen; und
    • c) Identifizieren der wenigstens einen Test-Verbindung als ein Agonist oder ein Antagonist des G-Protein gekoppelten Rezeptors.
  • Es ist beobachtet worden, dass GPCR-exprimierende Indikatorzellen der Erfindung Veränderungen in der Zellmorphologie zeigen, wenn sie mit einem Rezeptor-Agonisten in Kontakt gebracht sind. Zum Beispiel werden Indikatorzellen , wie beispielsweise CHO-Zellen, die an ein Gq/11 G-Protein koppelnde GPCRs (z. B. LIRH-R) exprimieren, etwas rundlicher und lösen sich von der Kulturschale ab, wenn sie mit einem Rezeptor-Agonisten in Kontakt gebracht sind. Zusätzlich werden Indikatorzellen, die an ein Gs G-Protein koppelnde GPCRs (z. B. einen β2-adrenergen Rezeptor) exprimieren, spindelförmiger und länglicher, wenn sie mit einem Rezeptor-Agonisten in Kontakt gebracht sind. Darüber hinaus kann diesen Veränderungen der Zellmorphologie durch weiteren Kontakt der Indikatorzellen mit einem Rezeptor-Antagonisten entgegengewirkt oder diese revertiert werden. Deshalb kann eine Test-Verbindung als ein Agonist eines GPCR beruhend auf ihrer Fähigkeit identifiziert werden, die Zellmorphologie von Indikatorzellen zu verändern, im Vergleich zur Zellmorphologie in Abwesenheit der Test-Verbindung, wenn die Zellen mit der Test-Verbindung in Kontakt gebracht sind.
  • In einer weiteren Anwendungsform dieses Bioassays umfasst die Test-Zusammensetzun eine Test-Verbindun(en) und wenigstens einen bekannten Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten. Zum Beispiel kann eine Test-Verbindung eines GPCR beruhend auf ihrer Fähigkeit als ein Antagonist identifiziert werden, in Anwesenheit eines Rezeptor-Agonisten den Indikatorzellen ihre ursprüngliche Morphologie wieder zu verleihen, wenn sie in Abwesenheit des Rezeptor-Agonisten kultiviert werden. Demgemäß stellt die Erfindung in einer anderen Anwendungsform ein Verfahren zur Identifizierung eines G-Protein gekoppelten Rezeptors bereit, umfassend:
    • a) Inkontaktbringen einer Population an Indikatorzellen mit einer Test-Zusammensetzung, die wenigstens eine Test-Verbindung und wenigstens einen bekannten Rezeptor-Agonisten enthält;
    • b) Bestimmen der Zellmorphologie der Indikatorzellen; und
    • c) Identifizieren der wenigstens einen Test-Verbindung als ein Antagonist
  • des G-Protein gekoppelten Rezeptors.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Zellmorphologie" im Allgemeinen auf die Gesamtform einer Zelle. Die Zellmorphologie der Indikatorzellen kann mittels Lichtmikroskopie bestimmt werden. Darüber hinaus können digitale Aufnahmen der Zellen gemacht werden, um Parameter der Zellmorphologie wie beispielsweise Zelloberfläche zu quantifizieren. Bei Säugerzelten erfolgt die Bestimmung der Morphologie typischerweise 24 bis 72 Stunden nach Kontakt mit der Test-Zusammensetzung.
  • GPCRs, wie sie zuvor hier beschrieben sind, können in diesem Bioassay eingesetzt sein, worin Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten basierend auf ihre Effekte auf die Morphologie der Indikatorzellen identifiziert werden. Zum Beispiel kann in verschiedenen Anwendungsförmen der GPCR an ein Gq/11 G-Protein oder an ein GS Protein koppeln, und der GPCR kann ein chimärer Rezeptor oder der GPCR kann ein „verwaister" Rezeptor sein.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Zellen, die rekombinante GPCRs exprimieren. Diese Zellen sind zur Verwendung als Indikatorzellen in den Bioassays der Erfindung geeignet. Die Verfahren der Erfindung zur Herstellung von Zellen beruhen wenigstens zum Teil auf der Entdeckung, dass eine Stimulierung eines rekombinanten GPCR, der auf einer Wirtszelle exprimiert ist, mit einem Rezeptor-Agonisten zu einer verminderten Zelllebensfähigkeit und/oder verminderten Zellproliferation führen kann. Demgemäß ist für eine verbesserte Erzeugung GPCR-exprimierender Zellen, eine Stimulierung des GPCR durch Rezeptor-Agonisten gehemmt oder vermieden. Folglich stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Zelle bereit, die einen rekombinanten G-Protein gekoppelten Rezeptor auf einer Membran der Zelle. exprimiert, umfassend Einführen eines Nucleinsäure-Moleküls in die Zelle, das den Rezeptor codiert, so dass der Rezeptor auf einer Membran der Zelle exprimiert ist, unter Kulturbedingungen, in denen eine Stimulierung des Rezeptors durch Rezeptor-Agonisten gehemmt ist.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „rekombinanter G-Protein gekoppelter Rezeptor" auf einen GPCR, der von einem exogenen in eine Wirtszelle eingeführten Nucleinsäure-Molekül codiert ist (z. B. der GPCR ist von einem rekombinanten Expressionsvektor codiert, der in die Wirtszelle transfiziert ist).
  • Bevorzugt exprimiert die Wirtszelle den GPCR nicht endogen. Der rekombinante GPCR kann von der selben Species wie die Wirtszelle oder einer anderen Species wie die Wirtszelle abstammen (z. B. ein humaner rekombinanter GPCR kann auf einer nichthumanen Wirtszelle wie beispielsweise CHO, COS oder 3T3 etc. exprimiert sein).
  • In einer Anwendungsform des Verfahrens zur Erzeugung einer Zelle, die einen rekombinanten GPCR exprimiert, umfassen die „Kulturbedingungen, bei denen der Rezeptor von Rezeptor-Agonisten gehemmt ist" Kultivieren der Zelle in einem Medium, das einen Rezeptor-Antagonisten enthält. Bekannte Rezeptor-Antagonisten für viele verschiedene GPCRs sind im Handel erhältlich. Zum Beispiel kann für LHRH-R der bekannte Rezeptor-Antagonist Antide im Medium enthalten sein oder für M1 Muscarin-Rezeptor kann der bekannte Rezeptor-Antagonist Pirenzepin im Medium enthalten sein.
  • In einer anderen Anwendungsform des Verfahrens zur Erzeugung einer Zelle, die einen rekombinanten GPCR exprimiert, umfassen die „Kulturbedingungen, bei denen eine Stimulierung des Rezeptors von Rezeptor-Agonisten gehemmt ist" die Kultivierung der Zelle in einem Medium, dem Rezeptor-Agonisten fehlen. Medien, denen Rezeptor-Agonisten fehlen, können zum, Beispiel unter Verwendung von Serum hergestellt sein, auf dem Rezeptor-Agonisten, z. B. mittels Dialyse, entfernt worden sind. Zum Beispiel kann dialysiertes fötales Kälberserum als Quelle für Wachstumsfaktoren für die Zellen verwendet sein.
  • In dem Verfahren der Erfindung zur Herstellung einer GPCR-exprimierenden Zelle kann die Zelle unter Kulturbedingungen gehalten sein, bei denen eine Stimulation des Rezeptors von Rezeptor-Agonisten gehemmt ist, bis eine stabile Expression des Rezeptors auf einer Membran der Zelle erreicht ist. Demgemäß stellt die Erfindung außerdem Verfahren zur Herstellung stabiler Populationen an Zellen bereit, die rekombinante GPRCs exprimieren. Wie hier verwendet, bezieht sich eine „stabile" Zellpopulation auf Zellen, deren Expression von rekombinantem GPCR über die Kultivierungszeit im Wesentlichen unverändert bleibt (z. B. auf Grund der Integration der GPCR-codierenden Nucleinsäure in das Genom der Zelle). Vorzugsweise ist die Expression von GPCR von der Zelle wenigstens für einen Monat stabil, bevorzugter sechs Monate und noch bevorzugter ein Jahr und am bevorzugtesten unbegrenzt stabil.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft deshalb stabile Populationen an Zellen, die rekombinante GPCRs exprimieren. Die Erfindung stellt verbesserte Zellpopulationen bereit, die zum Beispiel als Indikatorzellen in Bioassays der Erfindung verwendet sein können. In einen Anwendungsform umfassen diese Zellen eine stabile Population an Zellen, die einen rekombinanten G-Protein gekoppelten Rezeptor in einem Kulturmedium unter Kulturbedingungen exprimieren, bei denen eine Stimulation des Rezeptors von Rezeptor-Agonisten gehemmt ist. Die „Kulturbedingungen; bei denen eine Stimulation des Rezeptors von Rezeptor Agonisten gehemmt ist" können zum Beispiel ein Kulturmedium, das einen Rezeptor-Antagonisten enthält oder ein Kulturmedium umfassen, dem Rezeptor-Agonisten fehlen (zum Beispiel ein Kulturmedium, in dem das Serum dialysiert worden ist), wie es oben beschrieben ist.
  • Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung betrifft chimäre GPCRs codierende Nucleinsäure-Zusammensetzungen und chimäre GPCRs exprimierende Wirtszellen. Zum Beispiel stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäure-Molekül bereit, das einen chimären G-Protein gekoppelten Rezeptor (GPCR) codiert. Der Chimäre GPCR umfasst wenigstens eine Ligand-bindende Domäne eines ersten sieben Transmembransegment-Rezeptors und wenigstens eine Signaltransduktionsdomäne eines zweiten sieben Transmembransegment-Rezeptors, so dass der Chimäre GPCR an ein Gq/11 G-Protein koppelt, wenn der chimäre GPCR in einer Wirtszelle exprimiert ist. Vorzugsweise ist der zweite 7 TMS-Rezeptor ein LHRH-Rezeptor. Bevorzugter ist der zweite 7 TMS-Rezeptor ein humaner LHRH-Rezeptor. Der erste 7 TMS-Rezeptor der Chimäre ist vorzugsweise ein GPCR, der normalerweise nicht an Gq/11 G-Protein koppelt. Zum Beispiel kann der erste 7 TMS-Rezeptor β2-adrenerger Rezeptor sein (der an Gs koppelt). Chimäre Rezeptoren codierende Nucleinsäuren können unter Anwendung von molekularbiologischen Standardverfahren mittels Austausch von Nucleotid-Sequenzen, die einen Teile) des zweiten 7 TMS-Rezeptors codieren, gegen Nucleotid-Sequenzen, die entsprechende Teile) des ersten 7 TMS-Rezeptors codieren, hergestellt sein (wie oben beschrieben). Zum Beispiel werden in einer bevorzugten Anwendungsform Teile einer cDNS, die den ersten 7 TMS-Rezeptor codieren, durch Teile einer LHRH-DNS ersetzt, die die Signaltransduktionsdomäne(n) von LHRH-R umfassen. Folglich codiert in einer Anwendungsform die Nucleinsäure der Erfindung einen chimären Rezeptor, der die intrazelluläre Schleife 3 eines GPCR, der an Gq/11 koppelt, vorzugsweise IC 3 von LHRH-R umfasst. In einer anderen Anwendungsform codiert die Nucleinsäure der Erfindung einen Chimären Rezeptor, der die intrazellulären Schleifen 1, 2 und 3 eines GPCR, der an Gq/11 koppelt, (z. B. vorzugsweise IC 1, 2 und 3 von LHRH-R) umfasst. In einer noch weiteren Anwendungsform codiert die Nucleinsäure der Erfindung einen chimären Rezeptor, der die intrazellulären Schleifen 1, 2 und 3 eines GPCR, der an Gq/11 koppelt (z. B. vorzugsweise LHRH-R) umfasst, und außerdem ist die Carboxy terminale Domäne des chimären Rezeptors deletiert. Rekombinante Expressionsvektoren, die ein chimären GPCR codierendes Nucleinsäure-Molekül umfassen, und Wirtszellen, in denen ein derartiger Expressionsvektor eingeführt worden ist, sind ebenfalls von der Erfindung umfasst. Derartige Wirtszellen, die einen Chimären GPCR exprimieren, können als Indikatorzellen in den Bioassays der Erfindung eingesetzt sein.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Eierstockzelle des Chinesischen Hamsters (CHO-Zelle), die einen rekombinanten humanen luteinisierendes Hormon abgebenden Hormon-Rezeptor exprimiert. Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Eierstockzelle des Chinesischen Hamsters, die einen rekombinanten chimären G-Protein gekoppelten Rezeptor exprimiert. Der chimäre Rezeptor umfasst wenigstens eine Ligand-bindende Domäne eines ersten sieben Transmembransegment-Rezeptors und wenigstens eine Signaltransduktionsdomäne eines zweiten sieben Transmembransegment-Rezeptors, worin der Chimäre Rezeptor an ein Gq/11 G-Protein in der Zelle koppelt. Vorzugsweise ist der zweite 7 TMS-Rezeptor der Chimäre ein LHRH-Rezeptor. Bevorzugter ist der zweite 7 TMS-Rezeptor ein humaner LHRH-Rezeptor. Die CHO-Zellen der Erfindung könen ebenfalls als Indikatorzellen in dem Bioassay der Erfindung verwendet sein.
  • Die Verfahren der Erfindung zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten von GPCRs sind zur Identifizierung von Verbindungen zweckdienlich, die für die Behandlung von Krankheitszuständen, bei denen eine anormale GPCR-Aktivität involviert ist, therapeutisch zweckdienlich sein können. Viele Humanerkrankungen konnten auf eine Mutation in einem GPCR zurückgeführt werden (einen Überblick gibt Coughlin, S. R. (1994) Curr. Op. Cell. Biol. 6 : 191–197). Überdies werden gegenwärtig viele Humanerkrankungen mit bekannten GPCR-Agonisten oder Antagonisten behandelt. Beispiele umfassen LHRH-Agonisten, wie beispielsweise Leuprolid, Gonadorelin und Nafarelin, die zur Behandlung von Prostata- und Brustkarzinomen, uterine Leiomyoma, Endometriose, Pubertas praecox und nicht tumorartiges ovarialhyperandrogenes Syndrom eingesetzt worden sind, den cardialen β-adrenergen Rezeptor-Antagonisten Propranolol, der zur Behandlung von Bluthochdruck, Angina pectoris und psychiatrischen Störungen eingesetzt worden ist, den pulmonären β2-adrenergen Rezeptor-Agonisten Metaproterenol, der als Bronchodilatator eingesetzt worden ist, und den Histamin 2 Rezeptor-Antagonisten Cimetidin, der zur Behandlung von Ulzera und idiopathischer Urticaria eingesetzt worden ist. Weitere Beispiele für GPCRs und ihre potentiellen klinischen Indikationen sind folgende: Acetylcholin (Kinetose), Adenosin 1 (Nierenerkrankung, Schlafapnoe, kognitive Störungen), α-adrenergen (Bluthochdruck, gutartige Prostatavergrößerung, Impotenz), Angiotensin (Nierenerkrankung), Bombesin (kleinzelliger Lungenkrebs, Kontraktion des glatten Muskels), Bradykinin (Entzündung), C5a (Entzündung), Cholycystokinin (Panikattacken, Analgesia), Endothelin (Bluthochdruck, Myocardinfarkt, Ulzera, Asthma, Nierenversagen) und Glutamat (Gedächtnis und Lernen). Zusätzliche und verbesserte Rezeptor-Agonisten und Antagonisten können unter Anwendung des Durchmusterungsassays der Erfindung identifiziert werden. Überdies können Liganden von verwaisten GPCRs unbekannter Funktion identifiziert werden und dadurch ein besseres Verständnis für die physiologische Rolle dieser verwaisten GPCRs und vielleicht die Verwendung von Agonisten oder Antagonisten hierfür als therapeutische Ziele gestatten.
  • Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, die die Erfindung nicht beschränken. Die Inhalte sämtlicher in dieser Anmeldung zitierten Quellenangaben, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen sind hiermit durch Quellenangabe eingefügt.
  • BEISPIEL 1: Konstruktion einer Indilcatorzelle, die ein luteinisierendes Hormon abgebenden Hormon-Rezeptor ezprimiert
  • Um eine Indikatorzelle zu erzeugen, die ein luteinisierendes Hormon abgebenden Hormon-Rezeptor (LHRH-R) exprimiert und für eine Verwendung in den Durchmusterungsassays der Erfindung geeignet ist, wurde eine cDNS, die einen humanen LHRH-R codiert, in einen rekombinanten Expressionsvektor kloniert, der Vektor in Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) transfiziert und stabil transfizierte Klone wurden folgendermaßen selektiert.
  • Eine cDNS, die humanes LHRH-R Protein mit der Aminosäure-Sequenz (die Nucleotid- und Aminosäure-Sequenzen davon sind in der PCT Publikation Nr. WO 94/00590 von S. C. Sealfon offengelegt) codiert, wurde in einen rekombinanten Expressionsvektor unter Anwendung von molekularbiologischen Standardtechniken kloniert. In dem Vektor war die Expression von LHRH-R von dem SV-40 Enhancer und dem Adenovirus späten Hauptpromotor gesteuert. Zusätzlich enthielt der Vektor ein Dihydrofolat-Reduktase-(DHFR)-Gen als einen selektierbaren Marker.
  • Dihydrofolat-Reduktase-Mangel CHO-Zellen (DUKX B1 Zellen; von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, Katalog-Nr. ATCC CRL 9010, erhältlich) wurden mit dem oben beschriebenen LHRH-R Expressionsvektor mittels Lipofektions-Standardverfahren transfiziert (z: B. unter Verwendung von LipofectinTM Reagenz, von Gibco/BRL, Gaithersburg, MD, zu beziehen). Um stabil transfizierte Klone zu selektieren, wurden die transfizierten Zellen in Alpha MEM Medium/10% dialysiertes fötales Kälberserum, das steigende Mengen an Methotrexat enthielt, gehalten. Stabile Klone wurden auf Basis ihrer erworbenen Methotrexat-Resistenz selektiert.
  • BEISPIEL 2: Assays auf LHRH-R-Antagonisten und Agonisten
  • Ein LHRH-R-exprimierender CHO-Zellklon, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in einem Bioassay zur Identifizierung von LHRH-R-Antagonisten oder Agonisten folgendermaßen verwendet. Die Zellen wurden in Vertiefungen einer 96er Mikrotiterplatte (2500 Zellen/Nertiefung) ausplattiert und in Anwesenheit ausschließlich eines bekannten LHRH-R-Agonisten ([D-His6]-LHRH) (von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, im Handel erhältlich), mit Konzentrationen zwischen 1 pikomolar und 10 nanomolar, oder in Anwesenheit ausschließlich eines bekannten LHRH-R-Antagonisten (Antide) (von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, im Handel erhältlich) mit Konzentrationen zwischen 1 pikomolar und 100 nanomolar, oder in Anwesenheit sowohl des Agonisten als auch des Antagonisten mit verschiedenen Konzentrationskombinationen kultiviert. Als Kontrolle wurden LHRH-R-exprimierende CHO-Zellen ohne jegliche zugegebenen Substanzen kultiviert. Als weitere Kontrolle wurden nichttransfizierte CHO DUKX B1 Zellen mit verschiedenen Konzentrationen ausschließlich Agonist ([D-His6]-LHRH) oder ausschließlich Antagonist (Antide) kultiviert.
  • Nach 5 Kultivierungstagen wurde die Zelllebensfähigkeit unter Verwendung des Lebensfähigkeitsindikators 3,(4,4-Dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) bewertet. (Siehe Shearman, M. S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 1470–1474; Hansen, M. B. et al. (1989) J. Immun. Methods 119 : 203–210). MTT (von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, im Handel erhältlich) ist ein chromogenes Substrat, das in lebenden Zellen von einer gelben zu einer blauen Farbe reduziert wird, die spektralphotometrisch detektiert werden kann. Um die Zelllebensfähigkeit in Anwesenheit des Agonisten und/oder Antagonisten zu messen, wurde MTT (mit einer Endkonzentration von 1 mg/ml) in den letzten 2,75 Stunden der Kultivierung bei 37°C zugegeben. Nach Inkubation mit MTT wurde das Medium entfernt und die Zellen in Isopropanol/0,4 N HCl unter Rühren lysiert. Die Absorption einer jeden Vertiefung wurde bei 570 nm gemessen, um die lebensfähigen Zellen zu quantifizieren. Alternativ wurde MTT durch Zugabe von 50% N,N-Dimethylformamid/20% Natriumdodecylsulfat gelöst, dann direkt zu den Medien in den Vertiefungen gegeben und lebensfähige Zellen wurden in ähnlicher Weise durch Messen der Absorption bei 570 nm quantifiziert.
  • Die Ergebnisse eines repräsentativen Beispiels für einen Bioassay unter Verwendung LHRH-R-exprimierender CHO-Zellen sind in 1B graphisch gezeigt, während die Ergebnisse mit den nichttransfizierten CHO-Kontrollzellen in 1A graphisch gezeigt sind. Die in 1B dargestellten Daten zeigen, dass die Lebensfähigkeit der LHRH-R-exprimierenden CHO-Zellen durch die Anwesenheit von ansteigenden Mengen an ausschließlich Rezeptor-Antagonisten nicht beeinflusst war, während die Zelllebensfähigkeit durch die Anwesenheit von ansteigenden Mengen an ausschließlich Rezeptor-Agonisten merklich vermindert war (durch verringerte Absorption bei 570 nm gezeigt). Es ist anzumerken, dass diese verminderte Zelllebensfähigkeit bei Anwesenheit des Rezeptor-Agonisten revertiert war, wenn der Rezeptor-Antagonist zusammen mit dem Rezeptor-Agonisten vorlag.
  • Dieser Effekt war Dosis abhängig, wobei die höheren Konzenrationen an Rezeptor-Antagonisten zu einer größeren Zelllebensfähigkeit führte. Im Gegensatz dazu besaß weder der Agonist noch der Antagonist irgendeinen Effekt auf die Lebensfähigkeit nichttransfizierter CHO-Zellen (1A), was zeigt, dass dieses Phänomen von der Expression von LHRH-R auf den CHO-Zellen abhängig ist.
  • Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die erhöhte Lebensfähigkeit der LHRH-R-exprimierenden CHO-Zellen in Anwesenheit eines Rezeptor-Agonisten und einer zweiten Verbindung im Vergleich zur Lebensfähigkeit der Zellen bei Anwesenheit ausschließlich des Agonisten darauf hinweist, dass die zweite Verbindung ein Rezeptor-Antagonist ist. Außerdem zeigen die Ergebnisse, dass eine verminderte Lebensfähigkeit der LHRH-R-exprimierenden CHO-Zellen in Anwesenheit eines Rezeptor-Antagonisten und einer zweiten Verbindung oder in Anwesenheit ausschließlich der zweiten Verbindung im Vergleich zur Lebensfähigkeit der Zellen in Anwesenheit ausschließlich des Antagonisten oder bei Abwesenheit einer beliebigen Verbindung darauf hinweist, dass die zweite Verbindung ein Rezeptor-Agonist ist.
  • BEISPIEL 3: Assays auf M1 Muscarin-Rezeptor-Antagonisten und Agonisten
  • CHO-Zellen, die zur Expression eines M1 Muscarin-Rezeptors transfiziert waren (z. B. M1 WT3 Zellen, von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, Katalog-Nr: CRL 1985, erhältlich) wurden in einem Bioassay zur Identifizierung von Antagonisten oder Agonisten des M1 Muscarin-Rezeptors verwendet, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Kurz, die Zellen wurden in die Vertiefungen einer 96er Platte (2500 Zellen/Vertiefung) plattiert und in Anwesenheit ausschließlich eines bekannten M1 Muscarin-Rezeptor-Agonisten (Carbachol) (auch als Carbamylcholinchlorid bekannt und von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhältlich) mit Konzentrationen zwischen 100 nanomolar und 10 millimolar oder in Anwesenheit ausschließlich eines bekannten M1 Muscarin-Rezeptor-Antagonisten (Pirenzepin) (von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhältlich) mit Konzentrationen zwischen 100 nanomolar und 1 millimolar oder in Anwesenheit sowohl des Agonisten als auch des Antagonisten mit verschiedenen Konzentrationskombinationen kultiviert. Als Kontrolle wurden M1 Muscarin-Rezeptor-exprimierende CHO-Zellen in Abwesenheit beliebiger zusätzlicher Substanzen kultiviert. Als weitere Kontrolle wurden nichttransfizierte CHO DLTKX B1 Zellen mit verschiedenen Konzentrationen ausschließlich des Agonisten (Carbachol) oder ausschließlich des Antagonisten (Pirenzepin) kultiviert.
  • Nach fünf Kultivierungstagen wurde die Zelllebensfähigkeit unter Verwendung des Lebensfähigkeitsindikators MTT gemessen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die Ergebnisse eines repräsentativen Beispiels eines Bioassays unter Verwendung M1 Muscarin-Rezeptor-exprimierender CHO-Zellen sind in 2B graphisch , dargestellt, während die Ergebnisse der nichttransfizierten CHO-Kontrollzellen in 2A graphisch dargestellt sind. Ähnlich wie die mit den LHRH-Rexprimierenden Zellen beobachteten Ergebnisse, die in Beispiel 2 beschrieben sind, zeigen die in 2B dargestellten Daten, dass die Lebensfähigkeit der M1 Muscarin-Rezeptor-exprimierenden CHO-Zellen nicht durch die Anwesenheit steigender Mengen ausschließlich des Rezeptor-Antagonisten (Pirenzepin) beeinträchtigt war; während die Zelllebensfähigkeit in Anwesenheit steigender Mengen ausschließlich des Rezeptor-Agonisten (Carbachol) (der verminderten Absorption bei 570 nm zu entnehmen) bemerkenswert vermindert war. Es ist anzumerken, dass diese verminderte Zelllebensfähigkeit in Anwesenheit des Rezeptor-Agonisten zurückgebildet wurde, wenn der Rezeptor-Antagonist zusammen mit dem Rezeptor-Agonisten vorlag. Dieser Effekt war Dosis abhängig, wobei die höheren Konzentrationen an Rezeptor-Antagonist zu einer größeren Zelllebensfähigkeit führte. Im Gegensatz dazu hatte weder der Agonist noch der Antagonist einen geringen Effekt auf die Lebensfähigkeit nichttransfizierter CHO-Zellen ( 2A), was zeigt, dass dieses Phänomen von der Expression von M1 Muscarin-Rezeptor auf den CHO-Zellen abhängig ist.
  • Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die erhöhte Lebensfähigkeit der M 1 Muscarin-Rezeptor-exprimierenden CHO-Zellen bei Anwesenheit eines Rezeptor-Agonisten und einer zweiten Verbindung im Vergleich zur Lebensfähigkeit der Zellen bei Anwesenheit ausschließlich des Agonisten darauf hinweist, dass die zweite Verbindung ein Rezeptor-Antagonist ist. Außerdem zeigen die Ergebnisse, dass eine verminderte Lebensfähigkeit der M1 Muscarin-Rezeptor-exprimierenden CHO-Zellen bei Anwesenheit eines Rezeptor-Antagonisten und einer zweiten . Verbindung oder bei Anwesenheit ausschließlich der zweiten Verbindung im Vergleich zur Lebensfähigkeit der Zellen bei Anwesenheit ausschließlich des Antagonisten oder bei Abwesenheit einer beliebigen Verbindung darauf hinweist, dass die zweite Verbindung ein Rezeptor-Agonist ist.
  • BEISPIEL 4: Durchmusterung einer Bibliothek von Test-Verbindungen
  • Eine LHRH-1-R-exprimierende Zelllinie, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde mit einer Bibliothek von Verbindungen inkubiert, um Agonisten oder Antagonisten des Rezeptors zu identifizieren. Die Bibliothek bestand aus wenigstens 100 verschiedenen Peptid-Verbindungen, die unter Anwendung kombinatorischer Verfahren hergestellt und in 10 Proben-Pools von wenigstens jeweils 10 Ver-bindungen aufgeteilt wurden. Die Peptid-Endkonzentration betrug 1,5 μM in jeder Vertiefung der 96er Mikrotiterplatte. Zwei Proben wurden entweder mit dem LHRH R-Antagonisten Antide (in Probe 6 mit 1,5 μM) oder mit dem LHRH-R Agonisten D-His6-LHRH (in Probe 4 mit 1,5 μM) versetzt.
  • Zellen wurden im „antagonistischen Modus" (d. h. Bedingungen, die eine Identifizierung von Rezeptor-Antagonisten erlauben) mittels gemeinsamer Inkubation von Test-Verbindungen in Anwesenheit von 1 nM D-His6-LHRH oder im „agonistischen Modus" (d h. Bedingungen, die eine Identifizierung von Rezeptor-Agonisten erlauben) durch Inkubation von ausschließlich Test-Verbindungen ohne weitere Zugaben zur Zellkultur getestet. Nach 5 Kultivierungstagen wurde die Zelllebensfähigkeit, wie in Beispiel 2 beschrieben, bewertet. Die in 3 graphisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das Assay-System im „agonistischen Modus" die mit dem bekannten LHRH-Agonisten versetzte Probe (Probe 4 mit D-His6-LHRH) ohne weiteres identifizierte, während das Assay-System im „antagonistischen Modus" die mit dem bekannten LHRH-Antagonisten versetzte Probe (Probe 6 mit Antide) ohne weiteres identifizierte. Außerdem interferierte die Anwesenheit des Pools kombinatorisch hergestellter Peptide nicht mit dem Assay, was darauf hindeutet, dass komplexe Mischungen aus Verbindungen unter Anwendung des Systems der Erfindung durchmustert werden können.
  • BEISPIEL 5: Beschreibung der zellmorphologischen Veränderungen
  • Es wurde eine humanen β2-adrenergen Rezeptor-exprimierende Zelllinie, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt war, entweder mit 1) 1 nM Salbutamol(ein bekannter β2-adrenerger Rezeptor-Agonist) oder mit 2) 10 nM Butoxamin (ein bekannter β2-adrenerger Rezeptor-Antagonist) zusammen mit Salbutamol in komplettem Wachstumsmedium inkubiert. Einige Tage später wurden die Zellen photomikroskopisch analysiert, um die Wirkung der Behandlung auf die Zellmorphologie zu bestimmen. Eine repräsentative Photographie der Ergebnisse mit den ausschließlich Salbutamol behandelten Zellen ist in 4 gezeigt. Salbutamol induzierte sowohl eine Änderung der Zellform (d. h. machte die Zellen länger) als auch eine Änderung der Anordnung der Zellen untereinander. Folglich war die Gesamtfläche der von den Zellen eingenommenen Kulturoberfläche durch die Salbutamol-Exposition der Zellen stark vermindert. Zellen, die sowohl Salbutamol als auch Butoxamin exponiert waren, waren nicht von Kontrollzellen zu unterscheiden, was den antagonistischen Effekt dieses Rezeptor-Antagonisten demonstriert. Eine Bewertung der agonistischen oder antagonistischen Eigenschaften der einzelnen Verbindungen oder Bibliotheken von Verbindungen können zum Beispiel mittels mikroskopischer Beobachtung der Zellen oder alternativ mittels Videodigitalisierungstechniken erhalten werden, um die Veränderungen der Zellformen und/oder Veränderungen der Anordnung zu quantifizieren. Ausschließlich Butoxamin löste keine nachweisbare Änderung der Zellform oder Anordnung aus, auch Salbutamol wirkte auf nichttransfizierte CHO-Zellen nicht, die keinen rekombinanten β2-adrenergen Rezeptor exprimierten.
  • ENTSPRECHUNGEN
  • Der Fachmann erkennt oder ist unter Anwendung ausschließlich von Routineexperimenten in der Lage, viele Entsprechungen zu den spezifischen Anwendungsformen der hier beschriebenen Erfindung zu erkennen. Derartige Entsprechungen sind beabsichtigterweise von den nachfolgenden Ansprüchen umfasst.

Claims (19)

  1. Ein Verfahren zur Identifizierung eines Agonisten oder eines Antagonisten eines G-Protein gekoppelten Rezeptors, umfassend: a) Inkontaktbringen einer Population an Indikatorzellen, z. B. die Säugerzellen sind, mit einer Test-Zusammensetzung, die wenigstens eine Test-Verbindung enthält, worin die Indikatorzellen keine CHO-Zellen sind; b) Messen der Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen; und c) Identifizieren der wenigstens einen Test-Verbindung als ein Agonist oder ein Antagonist des G-Protein gekoppelten Rezeptors.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin ein Nucleinsäure-Molekül, das den Rezeptor codiert, in die Indikatorzellen so eingeführt worden ist, dass der Rezeptor auf einer Membran der Zellen exprimiert ist.
  3. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin der G-Protein gekoppelte Rezeptor ein chimärer Rezeptor ist, umfassend wenigstens eine Ligand-bindende Domäne eines ersten Sieben-Transmembran-Segment Rezeptors und wenigstens eine Signaltransduktionsdomäne eines zweiten Sieben-Transmembran-Segment Rezeptors, so dass der chimäre Rezeptor an ein Gq/1 i G-Protein in den Indikatorzellen koppelt:
  4. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die wenigstens eine Test-Verbindung als ein Agonist des G-Protein gekoppelten Rezeptors identifiziert wird, beruhend auf der Fähigkeit der wenigstens einen Test-Verbindung, die Lebens- fähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen zu vermindern, wenn sie mit den Indikatorzellen in Kontakt gebracht ist, im Vergleich mit der Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen in Abwesenheit der wenigstens einen Test-Verbindung.
  5. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die wenigstens eine Test-Verbindung als ein Antagonist des G-Protein gekoppelten Rezeptors identifiziert wird, beruhend auf der Fähigkeit der wenigstens einen Test-Verbindung; die Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen zu erhöhen, wenn sie mit den Indikatorzellen in Anwesenheit eines Rezeptor-Agonisten in Kontakt gebracht ist, im Vergleich mit der Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen in Anwesenheit nur des Rezeptor-Agonisten.
  6. Ein Verfahren zur Identifizierung eines Agonisten oder eines Antagonisten eines G-Protein gekoppelten Rezeptors, umfassend: a) Inkontaktbringen einer Population an Indikatorzellen, z. B. die Säugerzellen sind, mit einer Test-Zusammensetzung, die wenigstens eine Test-Verbindung enthält; b) Bestimmen der Morphologie der Indikatorzellen; und c) Identifizieren der wenigstens einen Test-Verbindung als ein Agonist oder ein Antagonist des G-Protein gekoppelten Rezeptors.
  7. Das Verfahren nach Anspruch 6, worin ein Nucleinsäure-Molekül, das den Rezeptor codiert, in die Indikatorzellen so eingeführt worden ist, dass der Rezeptor auf einer Membran der Zellen exprimiert ist.
  8. Ein Verfahren zur Identifizierung eines Agonisten oder eines Antagonisten eines G-Protein gekoppelten Rezeptors, umfassend: a) Inkontaktbringen einer Population an Indikatorzellen, z. B. die Säugerzellen sind, mit einer Test-Zusammensetzung, die wenigstens eine Test-Verbindung enthält; b) Messen der Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen; und c) Identifizieren der wenigstens einen Test-Verbindung als ein Agonist oder ein Antagonist des G-Protein gekoppelten Rezeptors, worin der G-Protein gekoppelte Rezeptor kein LHRH-Rezeptor ist.
  9. Das Verfahren nach Anspruch 8, worin ein Nucleinsäure-Molekül, das den Rezeptor codiert, in die Indikatorzellen so eingeführt worden ist, dass der Rezeptor auf einer Membran der Zellen exprimiert ist.
  10. Das Verfahren nach Anspruch 9, worin der G-Protein gekoppelte Rezeptor ein chimärer Rezeptor ist, umfassend wenigstens eine Ligand-bindende Domäne eines ersten Sieben-Transmembran-Segment Rezeptors und wenigstens eine Signaltransduktionsdomäne eines zweiten Sieben-Transmembran-Segment Rezeptors, so dass der Chimäre Rezeptor an ein Gq/11 G-Protein in den Indikatorzellen koppelt.
  11. Das Verfahren nach Anspruch 8, worin die wenigstens eine Test-Verbindung als ein Agonist des G-Protein gekoppelten Rezeptors identifiziert wird, beruhend auf der Fähigkeit der wenigstens einen Test-Verbindung, die Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen zu vermindern, wenn sie mit den Indikatorzellen in Kontakt gebracht ist, im Vergleich mit der Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen in Abwesenheit der wenigstens einen Test- Verbindung.
  12. Das Verfahren nach Anspruch 8, worin die wenigstens eine Test-Verbindung als ein Antagonist des G-Protein gekoppelten Rezeptors identifiziert wird, beruhend auf der Fähigkeit der wenigstens einen Test-Verbindung, die Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen zu erhöhen, wenn sie mit den Indikatorzellen in Anwesenheit eines Rezeptor-Agonisten in Kontakt gebracht ist, im Vergleich mit der Lebensfähigkeit oder Proliferation der Indikatorzellen in Anwesenheit nur des Rezeptor-Agonisten.
  13. Das Verfahren nach Anspruch 1, Anspruch 6 oder Anspruch 8, worin der G-Protein gekoppelte Rezeptor an ein Gq/11 G-Protein koppelt und zum Beispiel der G-Protein gekoppelte Rezeptor ein luteinisierendes Hormon abgebender Hormon 7 Rezeptor oder ein M1 Muscarin-Rezeptor ist.
  14. Das Verfahren nach Anspruch 1, Anspruch 6 oder Anspruch 8, worin der G-Protein gekoppelte Rezeptor an ein Gs G-Protein oder ein G; G-Protein koppelt und zum Beispiel der G-Protein gekoppelte Rezeptor ein 2β-Adrenorezeptor ist.
  15. Das Verfahren nach Anspruch 1, Anspruch 6 oder Anspruch 8, worin die Test-Zusammensetzung eine Bibliothek an Test-Verbindungen umfasst.
  16. Das Verfahren nach Anspruch 1, Anspruch 6 oder Anspruch 8, worin die Test-Zusammensetzung außerdem wenigstens einen bekannten Rezeptor-Agonisten oder wenigstens einen bekannten Rezeptor-Antagonisten umfasst.
  17. Das Verfahren nach Anspruch 1, Anspruch 6 oder Anspruch 8, worin die Test-Zusammensetzung außerdem wenigstens einen bekannten Rezeptor-Agonisten umfasst, um auf diese Weise einen Rezeptor-Antagonisten zu identifizieren.
  18. Das Verfahren nach Anspruch 1, Anspruch 6 oder Anspruch 8, worin die Test-Zusammensetzung außerdem wenigstens ein Agens umfasst, das den Metabolismus wenigstens eines zweiten Messengers in den Indikatorzellen verändert.
  19. Das Verfahren nach Anspruch 1, Anspruch 6 oder Anspruch 8, worin der natürliche Ligand für den G-Proteingekoppelten Rezeptor nicht bekannt ist.
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