JPH11507518A - Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターのアゴニスト及びアンタゴニストの機能的バイオアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｇ蛋白質とカップルしたレセプター（ＧＰＣＲ）のアゴニスト又はアンタゴニストの何れかとして作用する薬剤を同定するための簡単で迅速且つ高スループットの機能的バイオアッセイを開示する。この発明の方法においては、試験組成物を、ＧＰＣＲを発現している指標細胞と接触させて、その指標細胞の細胞代謝の少なくとも１つのパラメーターを測定して、この試験組成物中の試験化合物をレセプターアゴニスト又はアンタゴニストとして同定する。これらのアッセイを用いて、試験化合物のライブラリーをスクリーニングして、病状に関係のある治療上有用なＧＰＣＲのアゴニスト又はアンタゴニストをを同定することができる。これらのアッセイを用いて、天然のリガンドが未知である「孤児」ＧＰＣＲのリガンドを同定することもできる。ＧＰＣＲを発現する指標細胞の生成方法及びかかる指標細胞の単離された集団も又、開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターの アゴニスト及びアンタゴニストの機能的バイオアッセイ発明の背景 外部刺激に対する細胞応答は、先ず、レセプターベースの系によって媒介され る。細菌、酵母からヒトに至る生物に認められる膜を伴う最も偏在的且つ大きい 膜貫通レセプターファミリーの１つは、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプター（Ｇ ＰＣＲ）のファミリーである。このファミリーのレセプターは、α、β及びγサ ブユニットからなる膜結合性のＧ蛋白質と会合している。アゴニストのレセプタ ーへの結合に続いて、コンホメーション変化がＧ蛋白質に伝えられ、それは、α サブユニットに結合したＧＤＰ分子のＧＴＰ分子への変換及びβγサブユニット からの解離を引き起こす。αサブユニットのＧＴＰ結合型は、典型的に、エフェ クター−モジュレーター部分として機能して、第２メッセンジャー例えばサイク リックＡＭＰ（例えば、アデニレートシクラーゼの活性化による）、ジアシルグ リセロール又はイノシトールホスフェートの生成へと導く。２０種類より多くの 型のαサブユニットがヒトにおいて知られており、それらは、一層小さいβ及び γサブユニットのプールと会合する。従って、種々のＧ蛋白質とカップルしたレ セプターが、種々のα、β及び／又はγサブユニットを有するＧ蛋白質と会合す ることができる。Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターによるシグナル変換につい ての総説としては、Gilman,A.G.(1987)Annu.Rev.Biochem.56:615-649;Stryer,L ．及びBourne,H.R.(1986)Annu.Rev.Cell.Biol.2:391-419;及びBirnbaumer,L.(19 90)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.30:675-705を参照されたい。 殆どのＧＰＣＲは、膜貫通の７セグメント（７ＴＭＳ）よりなるレセプターの ファミリーのメンバーである。このファミリーは、少なくとも数百の別個のレセ プターより構成され、環境刺激例えば光子、臭気分子及び甘味糖類からのシグナ ル範囲に応答し、細胞間コミュニケーションに関係する分子例えば生物起源の アミン、脂質、ペプチド及び糖蛋白質（神経伝達物質、ニューロモジュレーター 及びホルモンを含む）に応答するレセプターが含まれる。構造的に、これらの７ ＴＭＳファミリーのレセプターは、細胞外アミノ末端ドメイン、細胞膜をまたぐ ７つの疎水性領域、これらの膜貫通セグメントを連結する６つの「ループ」領域 （３つは細胞内であり３つは細胞外）及び、すべてではないが多くの膜について 、細胞内カルボキシ末端ドメインよりなる。７ＴＭＳファミリーのメンバーの膜 貫通セグメントは、かなりの相同性を示すが、連結ループは保存程度が低く、密 接に関係するレセプターサブタイプ間でのみ高い相同性を示す。最も大規模に研 究された７ＴＭＳレセプターの２つは、網膜杆細胞で発現されて光エネルギーを 神経化学的シグナルに変換するロドプシン（例えば、Nathans,J.(1987)Annu.Rev .Neurosci.10:163-194参照）及び殆どの哺乳動物組織で発現されて、アデニレー トシクラーゼを活性化してｃＡＭＰを生成するβ２−アドレナリン作動性レセプ ター（例えば、Dixon,R.A.F.等(1986)Nature 321:75-79参照）である。更に、７ ＴＭＳレセプター中の保存された構造は、天然のリガンド及び機能が未だ解明さ れていない７ＴＭＳレセプターをコードする多くの新規な遺伝子のクローニング を可能にした。これらのレセプターは、「孤児」レセプターとして言及されてき た（例えば、Mills,A.及びDuggan,M.J.(1993)Treds in Pharmacological Scienc es 14:394-396を参照されたい）。７ＴＭＳレセプターについての総説としては 、例えば、Dohlman,H.G.等(1991)Annu.Rev.Biochem.60:653-688;及びLefkowitz, R.J.等(1993)Trends in Pharm.Sciences 14:303-307を参照されたい。 多くの決定的に重要な生物学的機能の調節におけるＧ蛋白質とカップルしたレ セプターの改善のために、病状は、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターの活性化 又は封鎖の状態により影響され又は決定され得る。ヒトの病気の原因となり得る レセプターの突然変異は、増大する速度で解明されつつあって、機能喪失性変異 であるか又は活性化変異であり得る。例には、機能亢進性甲状腺腫へと導く甲状 腺刺激ホルモンレセプター遺伝子の変異(例えば、Parma,J.等(1993)Nature365:6 49-651参照）、色素性網膜炎へと導くロドプシン遺伝子の変異（例えば、Keen,T .J.等(1991)Genomics11:199-205;及びRobinson,P.R.等(1992)Neuron 9 :719-725参照）、性的早熟へと導く黄体形成ホルモンレセプター遺伝子の変異 （例えば、Shenker,A.等(1993)Nature365:652-654参照)及び家族性糖質コルチコ イド欠乏症へと導く副腎皮質刺激ホルモンレセプター遺伝子の変異（例えば、Cl ark,A.J.L.等(1993)Lancet 341:461-462参照）が含まれる。病気におけるＧＰＣ Ｒの役割の総説としては、Coughlin,S.R.(1994)Curr.Op.Cell.Biol.6:191-197を 参照されたい。 種々の病状の治療のための多くの重要な薬物が、Ｇ蛋白質とカップルしたレセ プターの活性に影響を与えることにより作用する。例には、前立腺癌及び乳癌、 子宮平滑筋腫、子宮内膜症、性的早熟及び非腫瘍性卵巣アンドロゲン過剰症候群 を治療するために用いられてきたゴナドトロピン放出ホルモンのアゴニストアナ ログ例えばロイプロリド、ゴナドレリン及びナファレリン（例えば、Pace，J.N. (1992)Am.Fam.Physician 44:1777-1782参照）、高血圧、狭心症及び精神病を治 療するために用いられてきた心臓のβ−アドレナリン作動性レセプターアンタゴ ニストであるプロプラノロール（例えば、Nace,G.S．及びWood,A.J.(1987)Clin. Pharmacokinet.13:51-64: Ananth,J.及びLin,K.M.(1986)Neuropsycho-biology 1 5 :20-27参照）、気管支拡張剤として用いられてきた肺のβ２−アドレナリン作 動性レセプターアゴニストであるメタプロテレノール（例えば、Hurst,A.(1973) Ann.Allergy 31:460-466参照）及び潰瘍及び特発性蕁麻疹を治療するために用い られてきたヒスタミン２レセプターアンタゴニストであるシメチジン（例えば、 Sontag,S．等(1984)N.Engl.J.Med.311:689-693; Choy，M.及びMiddleton,R.K.(1 991)DICP 25:609-612参照）が含まれる。発明の要約 正常の細胞応答及び異常型の病的過程の両者におけるＧＰＣＲの重要な役割を 仮定すれば、ＧＰＣＲのアゴニスト又はアンタゴニストの同定を可能にするアッ セイは、大いに望ましい。この発明は、広範囲のＧＰＣＲのアゴニスト又はアン タゴニストを同定するための機能的バイオアッセイを提供する。この発明のバイ オアッセイは、簡単で、迅速且つ高スループットである。その上、これらのスク リーニング法は、哺乳動物のＧＰＣＲ特にヒトのＧＰＣＲを哺乳動物細胞環境に てアッセイすることを可能にする。化合物を、単独で又は一層好ましくは化合物 のライブラリーにて、これらのアッセイで試験することができる。従って、これ らのアッセイは、化合物の大きいパネルの迅速なスクリーニングを可能にする。 更に、この発明のアッセイは、既知のＧＰＣＲ及び天然のリガンドが未知である 「孤児」ＧＰＣＲの両者に適用することができる。従って、この発明の方法は、 既知のＧＰＣＲの治療上有用なアゴニスト又はアンタゴニストを同定するために 並びに孤児ＧＰＣＲの機能を研究するために有用である。 この発明の方法においては、指標細胞（例えば、哺乳動物細胞）の集団を、１ 種以上の試験化合物を含む試験組成物と接触させ、これらの指標細胞の細胞代謝 の少なくとも１つのパラメーターを測定して試験化合物をレセプターアゴニスト 又はアンタゴニストとして同定する。これらの指標細胞は、好ましくは、ＧＰＣ Ｒをコードする核酸分子を細胞中に取り込むことにより、関心のあるＧＰＣＲを 発現する。この試験組成物は、１種類又は数種類（例えば、ライブラリー）の試 験化合物を含むことができる。更に、この試験組成物は、１種類以上の公知のレ セプターアゴニスト又はアンタゴニストを含むことができる。例えば、試験化合 物を、指標細胞をその試験化合物及び公知のレセプターアゴニストの両者に接触 させたときに公知のレセプターアゴニストの指標細胞に対する効果を変える能力 に基づいてレセプターアンタゴニストとして同定することができる。更に、この 試験組成物は、指標細胞中の第２メッセンジャーの代謝を変える１種類以上の薬 剤を含むことができる。 この発明のアッセイにおける利用のための好適なＧＰＣＲには、黄体形成ホル モン放出ホルモンレセプター（ＬＨＲＨ−Ｒ；ゴナドトロピン放出ホルモンレセ プター（ＧｎＲＨ））、Ｍ１ムスカリン性レセプター及びβ２−アドレナリン作 動性レセプター（β２−ＡＲ）が含まれる。他の具体例において、ＧＰＣＲは、 Ｇｑ／１１Ｇ蛋白質とカップルする（例えば、ＬＨＲＨ−Ｒ、アセチルコリン、 アデノシン１、α−アドレナリン作動性、アンギオテンシン、ボンベシン、ブラ ジキニン、Ｃ５ａ、コリシストキニン、エンドセリン、グルタメート、５ＨＴ、 ヒスタミン（Ｈ１サブタイプ）、ニューロテンシン、ニューロキニン、オキシト シン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、トロンボキサン Ａ２及びバソプレッシン）。他の具体例において、ＧＰＣＲは、ＧｓＧ蛋白質と カップルする（例えば、β２−ＡＲ、心臓のβ−アドレナリン作動性、ヒスタミ ン（Ｈ２サブタイプ）、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン放出因子及び副腎皮 質刺激ホルモン）。更に別の具体例において、ＧＰＣＲは、第１の膜貫通７セグ メントレセプターの少なくとも１つのリガンド結合ドメイン及び第２の膜貫通７ セグメントレセプターの少なくとも１つのシグナル変換ドメインからなるキメラ レセプターであって、このキメラレセプターが指標細胞中でＧｑ／１１Ｇ蛋白質 にカップルするようにしたものである。更に別の具体例においては、ＧＰＣＲは 、孤児レセプター（即ち、そのＧ蛋白質にカップルしたレセプターの天然のリガ ンドが未知）である。 この発明のスクリーニングアッセイの一具体例において、指標細胞において測 定される細胞代謝のパラメーターは、生存力又は増殖である。例えば、試験化合 物を、指標細胞と接触させたときにそれらの指標細胞の生存力及び／又は増殖を 減少させる能力に基づいてレセプターアゴニストとして同定することができる。 或は、試験化合物を、指標細胞及び既知のレセプターアゴニストと接触させたと きにそれらの指標細胞の生存力及び／又は増殖を増大させる能力に基づいてレセ プターアンタゴニストとして同定することができる。この具体例においては、Ｇ ＰＣＲは、好ましくは、Ｇｑ／１１Ｇ蛋白質（例えば、ＬＨＲＨ−Ｒ）とカップ ルし、又はキメラＧＰＣＲがＧｑ／１１Ｇ蛋白質とカップルするのを許すシグナ ル変換ドメインよりなるキメラＧＰＣＲである。 この発明のスクリーニングアッセイの他の具体例において、指標細胞において 測定される細胞代謝のパラメーターは、細胞形態である。例えば、試験化合物を 、指標細胞と接触させたときにそれらの指標細胞の形態を変える能力に基づいて レセプターアゴニストとして同定することができる。或は、試験化合物を、指標 細胞及び既知のレセプターアゴニストと接触させたときにそれらの指標細胞をそ れらの元の形態に回復させる能力に基づいてレセプターアンタゴニストとして同 定することができる。 この発明は、更に、スクリーニングアッセイにおける指標細胞として利用する ために、細胞膜上で組換えのＧ蛋白質とカップルしたレセプターを発現させる 細胞を調製する方法を提供する。この方法においては、レセプターをコードする 核酸分子を、レセプターアゴニストによるレセプターの刺激が阻止される培養条 件下で細胞に導入する。組換えのＧ蛋白質とカップルしたレセプターを、培養培 地中で、レセプターアゴニストによるレセプターの刺激が阻止される培養条件下 で発現する細胞の安定な集団も又、この発明の範囲内にある。 キメラＧＰＣＲをコードする核酸分子及びＧＰＣＲを発現する宿主細胞も又、 この発明により提供される。図面の簡単な説明 図１Ａ〜Ｂは、トランスフェクトしてない（パネルＡ）又は黄体形成ホルモン 放出ホルモンレセプター（ＬＨＲＨ−Ｒ）を発現するようにトランスフェクトし た（パネルＢ）ＣＨＯ細胞によるＭＴＴの還元のグラフ表示であり、増大する濃 度のＬＨＲＨ−Ｒアゴニストが単独で存在し、増大する濃度のＬＨＲＨ−Ｒアン タゴニスト（アンタイド）が単独で存在し、又はトランスフェクトした細胞につ いては（パネルＢ）、増大する濃度のＬＨＲＨ−ＲＲアゴニストが１ｎＭ、１０ ｎＭ又は１００ｎＭのアンタゴニストと共に存在する場合のグラフ表示である。 図２Ａ〜Ｂは、トランスフェクトしてない（パネルＡ）又はＭ１ムスカリン性 レセプターを発現するようにトランスフェクトした（パネルＢ）ＣＨＯ細胞によ るＭＴＴの還元のグラフ表示であり、増大する濃度のＭ１ムスカリン性レセプタ ーアゴニスト（カルバコール）が単独で存在し、増大する濃度のＭ１ムスカリン 性レセプターアンタゴニスト（ピレンゼピン）が単独で存在し、又は増大する濃 度のアゴニストが１μＭ（パネルＢのみ）、１０μＭ又は１００μＭのアンタゴ ニストと共に存在する場合のグラフ表示である。 図３は、組合せペプチドライブラリーをＣＨＯ細胞とインキュベートしたアッ セイにおいて、ＬＨＲＨレセプターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞によるＭ ＴＴの減少のグラフ表示であり、ＬＨＲＨアゴニストＤ−Ｈｉｓ⁶−ＬＨＲＨ（ １ｎＭ）の存在時（塗りつぶした棒）又は不在時（空白の棒）の何れかにおける グラフ表示である。２つの試料において、既知のＬＨＲＨアゴニスト又はアン タゴニストを、アゴニスト及びアンタゴニストの両者ともこのアッセイを用いて 同定することができることを示すためにこの試料に「加えた（spiked）」。 図４は、β２−アドレナリン作動性レセプターアゴニストであるサルブタモー ルの、ヒトβ２−アドレナリン作動性レセプターを発現しているＣＨＯ細胞の形 態及び整列に対する効果を示しているＣＨＯ細胞の写真である。発明の詳細な説明 この発明は、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプター（ＧＰＣＲ）のアゴニスト又 はアンタゴニストを同定する方法即ちＧＰＣＲの活性を刺激し又は阻止する薬剤 のスクリーニングアッセイ法を提供する。この発明の方法は、機能的バイオアッ セイである。これらの方法は、少なくとも部分的に、指標細胞をレセプターのア ゴニスト又はアンタゴニストに接触させたときにＧＰＣＲを発現するそれらの指 標細胞において生じる細胞代謝における検出可能な変化の発見に基づいている。 この発明の様々な具体例において、これらの細胞代謝における検出可能な変化に は、細胞の生存力、増殖又は形態における変化が含まれる。例えば、この発明の 方法の一具体例は、少なくとも部分的に、ＧＰＣＲを発現する指標細胞がレセプ ターアゴニストの存在時には減少した細胞生存力及び／又は増殖を示すという発 見に基づいている。その上、レセプターアゴニストの存在時の細胞の生存力及び ／又は増殖は、加えてレセプターアンタゴニストが存在することにより回復され 得る。この発明の方法の他の具体例は、少なくとも部分的に、ＧＰＣＲを発現す る指標細胞がレセプターアゴニストの存在時に細胞形態の検出可能な変化を示し 、これらの形態的変化がレセプターアンタゴニストの存在時に逆戻りするという 発見に基づいている。 この発明の方法は、個々の化合物又は化合物のライブラリーの効率的なスクリ ーニングを可能にする簡単で、迅速且つ高スループットのアッセイである。その 上、これらの方法は、種々のＧＰＣＲに広く適用可能であり、未知の機能の「孤 児」レセプターのリガンドを同定するために用いることさえできる。従って、こ の発明の方法を、ＧＰＣＲ機能を研究するため及び、例えば治療目的のためにＧ ＰＣＲ活性を操作し又は変えるために有用な化合物を同定するための両方に 用いることができる。この発明の好適具体例においては、哺乳動物細胞を、スク リーニングアッセイにおける指標細胞として用い、それにより、哺乳動物細胞環 境の関係において哺乳動物のＧＰＣＲのアゴニスト又はアンタゴニストの同定を 可能にする。 この発明の他の面は、この発明のスクリーニングアッセイにおいて有用な指標 細胞及びこのアッセイにおいて用いられる組成物例えば細胞及びベクターを調製 する方法に関係する。この発明の様々な面は、下記に、一層詳細に記載する。 一具体例において、この発明は、下記を含む、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプ ターのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法を提供する： ａ）指標細胞の集団を少なくとも１種の試験化合物を含む試験組成物と接触さ せ、 ｂ）これらの指標細胞の細胞代謝の少なくとも１つのパラメーターを測定し； そして ｃ）この試験組成物の少なくとも１種の試験化合物を、Ｇ蛋白質とカップルし たレセプターのアゴニスト又はアンタゴニストとして同定する。 ここで用いる場合、用語「Ｇ蛋白質とカップルしたレセプター」（又は「ＧＰ ＣＲ」）は、細胞により発現されたときにＧ蛋白質（例えば、α、β及びγサブ ユニットよりなり且つＧＴＰを加水分解する蛋白質）と会合するレセプターをい う。好ましくは、ＧＰＣＲは、「膜貫通７セグメントレセプター」（又は「７Ｔ ＭＳレセプター」）であり、これは、構造的に７つの疎水性の膜貫通領域を含む 蛋白質をいう。 この発明の方法における使用に適したＧＰＣＲの例には、黄体形成ホルモン放 出ホルモン（ＬＨＲＨ）（ゴナドトロピン放出ホルモン、ＧｎＲＨとしても知ら れる）レセプター、Ｍ１ムスカリン性レセプター及びβ２−アドレナリン作動性 レセプターが含まれる。他の好適レセプターには、オピオイドレセプター、エン ドセリンレセプター、アンギオテンシンレセプター、ニューロペプチドＹレセプ ター及びセロトニンＫレセプターが含まれる。 更に、ＧＰＣＲのグループは、それらが細胞内でカップルする（即ち、会合す る）Ｇ蛋白質によって分類された。従って、一具体例において、このスクリーニ ングアッセイで用いられるＧＰＣＲは、Ｇｑ／１１Ｇ蛋白質とカップルする（即 ち、会合する）。Ｇｑ／１１Ｇ蛋白質とカップルするＧＰＣＲの例には、次のレ セプターが含まれる：ＬＨＲＨ（＝ＧｎＲＨ）、アセチルコリン（ｍ１、３及び ５サブタイプ）、Ｍ１ムスカリン性、アデノシン１、α−アドレナリン作動性（ ａ１Ａ、ａ１Ｂ及びａ１Ｃ鎖部タイプ）、アンギオテンシン（ＡＴ１Ａサブタイ プ）、ボンベシン（ＢＢ１及びＢＢ２サブタイプ）、ブラジキニン（Ｂ２サブタ イプ）、Ｃ５ａ、コリシストキニン（ＣＣＫａ及びＣＣＫｂサブタイプ）、エン ドセリン（Ｅｔａ及びＥｔｂサブタイプ）、グルタメート（ｍＧ１ｕ１、５サブ タイプ）、５ＨＴ（２Ａ、Ｂ及びＣサブタイプ）、ヒスタミン（Ｈ１サブタイプ ）、ニューロテンシン、ニューロキニン（ＮＫ２、３サブタイプ）、オキシトシ ン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ ）、トロンボキサンＡ２及びバソプレッシン（Ｖ１ａサブタイプ）。 他の具体例において、このスクリーニングアッセイで用いられるＧＰＣＲは、 Ｇ_sＧ蛋白質とカップルする（即ち、会合する）。Ｇ_sＧ蛋白質とカップルするＧ ＰＣＲの例には、次のレセプターが含まれる：β２−アドレナリン作動性、心臓 のβ−アドレナリン作動性、ヒスタミン（Ｈ２サブタイプ）、甲状腺刺激ホルモ ン、成長ホルモン放出因子、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、５ＨＴ₄、濾 胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ＧＬＰ−１、グル カゴン、ドーパミン₅（Ｄ₅）、ドーパミン₁（Ｄ₁）、カルシトニン、アデノシン ２β（Ａ２β）、バソプレッシン₂、血管作用性小腸ポリペプチド及び副甲状腺 ホルモン。 他の具体例において、スクリーニングアッセイで用いるＧＰＣＲは、Ｇ_iＧ蛋 白質とカップルする（即ち、会合する）。Ｇ_iＧ蛋白質とカップルするＧＰＣＲ の例には、次のレセプターが含まれる：５ＨＴ（１Ａ、１Ｂ、１Ｄ及び１Ｆサブ タイプ）、_mグルタミンＲ（２、３サブタイプ）、ドーパミン₄（Ｄ４）、ドーパ ミン−２（Ｄ₂）カンナビノイド、アデノシン₃（Ａ₃）、ソマトスタチン（４、 ３サブタイプ）、μ−オピオド、δ−オピオド、κ−オピオド、ニューロ ペプチドＹ（１、２サブタイプ）。 更に別の具体例において、ＧＰＣＲは、当分野で「孤児」レセプターとして言 及されてきたものである。孤児レセプターは、他のＧＰＣＲに構造的に類似して いるが、この発明のスクリーニングアッセイにおけるその孤児レセプターの使用 前にその天然のリガンドが未知であるＧＰＣＲである。この後者の具体例におい て、このスクリーニングアッセイは、こうして、試験化合物を、孤児レセプター のリガンドとして同定するために用いることができる。例えば、天然物質をこの アッセイにおいてスクリーニングして、それらが孤児レセプターの天然のリガン ドであるかどうかを研究することができる。従って、公知のＧＰＣＲのアゴニス ト及びアンタゴニストを同定することを可能にすることに加えて、この発明のバ イオアッセイは又、孤児ＧＰＣＲの機能をこれらのレセプターのリガンドを同定 することにより研究するのにも有用である。 ここで用いる場合、レセプターの「アンタゴニスト」は、ＧＰＣＲの活性を阻 害する薬剤をいい、レセプターの「アゴニスト」は、ＧＰＣＲの活性を刺激する 薬剤をいう。アンタゴニスト又はアゴニストによるレセプター活性の阻害又は刺 激は、それぞれ、部分的であっても完全であってもよい。 ここで用いる場合、用語「指標細胞の集団」は、少なくとも１つの関心のある ＧＰＣＲ（即ち、レセプターのアゴニスト又はアンタゴニストが同定されるべき ＧＰＣＲ）を発現する多様な細胞をいう。指標細胞は、ＧＰＣＲがそれらの指標 細胞の膜上に存在するならば、ＧＰＣＲを「発現する」。これらの指標細胞は、 関心のあるＧＰＣＲを自然に発現し（「内因性」発現ともいう）、一層好ましく は、レセプターをコードする核酸分子が指標細胞に導入され、それによりそれら の細胞の膜上のレセプターの発現が可能になったので、関心のあるＧＰＣＲを発 現する（「外因性」発現ともいう）。 ＧＰＣＲを内因性発現する細胞は、当分野で周知であり、この発明のスクリー ニングアッセイにおいて用いることができる。しかしながら、一層好ましくは、 このアッセイで使用するための指標細胞を、その細胞膜上でＧＰＣＲが発現され るように関心のあるＧＰＣＲをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）をその細胞に 導入することにより調製する。好ましくは、この指標細胞は、ＧＰＣＲをコード する核酸をその細胞に導入する前には、その関心のあるＧＰＣＲを発現しない。 細胞に導入されるＧＰＣＲをコードする核酸は、その細胞の膜上でのレセプター の発現に適した形態であり、これは、その核酸が、ＧＰＣＲをコードする核酸の 転写及び翻訳に必要なコード配列及び調節用配列のすべてを含む（それは、プロ モーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを含むことができ、Ｎ末端 リーダー配列を含むこのレセプターの細胞表面までの輸送に必要な配列を含むこ とができる）ことを意味する。好適具体例において、これらの細胞に導入される 核酸は、ＧＰＣＲをコードするｃＤＮＡを有する組換え発現ベクターである。組 換え発現ベクターにおいて、ｃＤＮＡの転写及び／又は翻訳の原因となり得る調 節機能は、しばしば、ウイルス性の配列により与えられる。一般に用いられるウ イルスプロモーター及び／又はエンハンサーの例には、ポリオーマ、アデノウイ ルス２、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス４０並びにレトロウイルス のＬＴＲから導かれたものが含まれる。指標細胞中のＧＰＣＲの発現のために適 した発現ベクターは、当分野では周知であり、多くのものが市販されている。組 換え発現ベクターは、例えば、プラスミッドベクター又はウイルスベクター（例 えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイル スベクター）である。指標細胞の表面でのＧＰＣＲの発現は、例えば、組換え発 現ベクターにより運ばれるｃＤＮＡ中にＧＰＣＲの自然の配列を含有し、好まし くは、異質の（即ち、他の蛋白質由来の）シグナル配列をこの自然のＧＰＣＲ配 列のために加えてこのＧＰＣＲの細胞内プロセッシング経路を変えることにより 達成することができる。異質のリーダー配列の利用が宿主細胞内での蛋白質の発 現の効率を改善するということは、当分野で公知である。例えば、組織プラスミ ノーゲンアクチベーター（ｔｐＡ）からのリーダー配列を、ＧＰＣＲの自然の配 列に加えることができる。 宿主細胞中にＧＰＣＲをコードする核酸分子を導入することに加えて、他の遺 伝子産物をコードする更なる核酸分子も、所望であれば、導入して宿主細胞の応 答性を調節する（例えば、アゴニスト又はアンタゴニストに対するそれらの感受 性を増大し又は減少させる）ことができる。例えば、関心のあるＧ蛋白質（例え ば、Ｇｑ／１１、Ｇ_S、Ｇ_i等）をコードする核酸分子を、宿主細胞に同時トラ ンスフェクトして、Ｇ蛋白質がその宿主細胞で発現されるようにすることができ る（例えば、同じＧ蛋白質を内因性に発現する宿主細胞において発現されたＧ蛋 白質の量を増大させ、或は、特定のＧ蛋白質を内因性に発現していない宿主細胞 におけるその特定のＧ蛋白質の発現を可能にする）。 ＧＰＣＲをコードする核酸（例えば、組換え発現ベクター）を、様々な周知の 細胞トランスフェクション技術によって細胞に導入することができ、該技術は、 この目的に有用であって、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、Ｄ ＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクション及び ウイルスベクターの感染が含まれる。核酸を細胞に導入するのに適した方法は、 Sambrook等（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版、Cold Spring H arbor Laboratory press(1989)）及び他の実験マニュアル中に見出すことができ 、細胞をトランスフェクトするためのキットは市販されている。細胞は、ＧＰＣ Ｒをコードする核酸で一時的にトランスフェクトされ、一層好ましくは、安定に トランスフェクトすることができる。安定なトランスフェクションは、自律的に 複製する発現ベクター（例えば、エピソーム性のベクター）の使用により又はＧ ＰＣＲをコードする核酸をゲノム中にインテグレートした細胞を選択することに より達成することができる。典型的には、少ないパーセンテージのトランスフェ クトされた細胞だけが、導入した核酸をそれらのゲノム中にインテグレートする ので、選択マーカーをコードする核酸を、ＧＰＣＲをコードする核酸と共に指標 細胞にトランスフェクトすることは有利である。好適な選択マーカーには、Ｇ４ １８、ハイグロマイシン及びメトトレキセート等の薬物に対する耐性を与えるも のが含まれる。選択マーカーは、ＧＰＣＲをコードするのと同じ核酸分子（例え ば、プラスミッド）にて導入してもよいし、別々の核酸分子（例えば、プラスミ ッド）にて導入してもよい。 好適具体例において、この発明の方法で用いる指標細胞は、哺乳動物細胞であ る。この発明のスクリーニングアッセイにおいて哺乳動物細胞を用いることがで きることは、関心のあるＧＰＣＲがヒト又は他の哺乳動物に由来する場合に（例 えば、治療関連のＧＰＣＲ）、試験化合物を哺乳動物細胞の環境の関連における レセプターに対してアッセイするので、特に有利である。これは、酵母を利用す るアッセイ系（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／２３０２５号；及びJeansonne,M. E.等(1994)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.206:35-44）又は両生類若しくは爬虫類から の色素細胞を利用するアッセイ系（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９２／０１８１０及 びLerner,M.R.(1994)Trends in Neuroscience 17:142-146）と対照的である。こ の発明の方法における使用のための指標細胞を調製するために用い得る適当な哺 乳動物細胞系統の非制限的な例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細 胞、ＣＯＳ細胞、３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞及び２９３細胞が含まれる。この発 明の方法における使用のために最も好ましい細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の同 様に適した細胞は、当業者には明らかであろう。指標細胞を調製することのでき る哺乳動物細胞系統は、American Type Culture Collection（メリーランド、Rockvill e在）より入手することができる。 ここで用いる場合、用語「試験組成物」は、少なくとも１種の「試験化合物」 （これは、レセプターのアゴニスト又はアンタゴニストであるか否かをアッセイ して決定すべき化合物をいう）を含む物質を包含することを意図している。試験 組成物は、単一の試験化合物を含んでもよいし、複数の試験化合物を含んでもよ い。例えば、この試験組成物は、試験化合物のライブラリー例えばペプチドの組 合せライブラリーを含むことができる。試験化合物のライブラリーを、プールに おいてスクリーニングすることができ、レセプターのアゴニスト又はアンタゴニ ストについての試験で陽性のそれらのプールを細分割して再スクリーニングする ことができる。次いで、このプロセスを、単一の陽性の試験化合物がこのライブ ラリーから同定されるまで必要なだけ反復することができる。 適宜に、この試験組成物は、更なる物質を含むことができる。この試験組成物 に含むことのできる更なる物質には、公知のレセプターアゴニスト及び公知のレ セプターアンタゴニストが含まれる。例えば、公知のレセプターアゴニストが指 標細胞から代謝応答を誘出するために試験組成物に含まれてよく、そのレセプタ ーアゴニストにより誘出される代謝応答を逆転させ又は阻害する能力に基づいて 、試験化合物をレセプターアンタゴニストとして同定することができる。同様に 、公知のレセプターアンタゴニストが指標細胞から代謝応答を誘出するために試 験組成物に含まれてよく、そのレセプターアンタゴニストにより誘出される 代謝応答を逆転させ又は阻害する能力に基づいて、試験化合物をレセプターアゴ ニストとして同定することができる。この試験組成物に含むことのできる他の物 質には、指標細胞における第２メッセンジャーの代謝を変化させる薬剤が含まれ る。かかる薬剤の例には、ホルボールエステル（例えば、ホルボールミリステー トアセテート）、カルシウムイオノフォア（例えば、Ａ２３１８７）、ホスホジ エステラーゼ阻害剤（例えば、イソブチル−メチルキサンチン）及びストーロス ポリンが含まれる。かかる薬剤を試験組成物に含有して指標細胞の試験化合物及 び／又は公知のレセプターアゴニスト又はアンタゴニストに対する感受性を変え る（例えば、増大させ又は減少させる）ことができる。 ここで用いる場合、用語「細胞代謝のパラメーター」は、指標細胞により発現 されるＧＰＣＲにより少なくとも部分的に調節される細胞応答の検出可能な指標 を含むことを意図している。この発明のアッセイにおいて測定され又は決定され 得る細胞代謝のパラメーターの例には、細胞の生存力、増殖及び形態が含まれる （下記にて、一層詳細に説明する）。試験化合物は、その試験化合物を指標細胞 と接触させたときに、その試験化合物の不在時における指標細胞の細胞代謝と比 較して、その指標細胞の細胞代謝の少なくとも１つのパラメーターに変化を引き 起こすことに基づいてレセプターアゴニスト又はアンタゴニストとして同定され る。 この発明の一具体例において、ＧＰＣＲのアゴニスト又はアンタゴニストは、 指標細胞の集団の生存力及び／又は増殖を変える能力に基づいて同定される。従 って、一具体例において、この発明は、下記を含む、Ｇ蛋白質とカップルしたレ セプターのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法を提供する： ａ）指標細胞の集団を、少なくとも１種の試験化合物を含む試験組成物と接触 させ； ｂ）これらの指標細胞の生存力又は増殖を測定し；そして ｃ）少なくとも１種の試験化合物を、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターのア ゴニスト又はアンタゴニストとして同定する。 実施例２及び３で更に詳細に説明するように、この発明のＧＰＣＲを発現する 指標細胞は、レセプターアゴニストと接触させたときに減少した細胞生存力及び ／又は増殖を示す。その上、これらの指標細胞の減少した細胞生存力及び／又は 増殖は、これらの指標細胞を更にレセプターアンタゴニストと接触させることに より打ち消し又は逆転させることができる。それ故、試験化合物を、指標細胞と 接触させたときに、その試験化合物の不在時の指標細胞の生存力及び／又は増殖 と比較してそれらの細胞の集団の生存力及び／又は増殖を減少させる能力に基づ いて、ＧＰＣＲのアゴニストとして同定することができる。 他の具体例において、この試験組成物は、試験化合物及び少なくとも１種の公 知のレセプターアゴニスト又はアンタゴニストを含む。例えば、試験化合物を、 指標細胞と接触させたときに、レセプターアゴニストの単独での存在時における 指標細胞の生存力及び増殖と比較してそれらの細胞の集団の生存力及び／又は増 殖を増大させる能力に基づいて、ＧＰＣＲのアンタゴニストとして同定すること ができる。従って、他の具体例において、この発明は、下記を含む、Ｇ蛋白質と カップルしたレセプターのアンタゴニストを同定する方法を提供する： ａ）指標細胞の集団を、少なくとも１種の試験化合物及び少なくとも１種の公 知のレセプターアゴニストを含む試験組成物と接触させ； ｂ）指標細胞の生存力又は増殖を測定し；及び ｃ）少なくとも１種の試験化合物をＧ蛋白質とカップルしたレセプターとして 同定する。 この系では、同定されたアンタゴニストは、指標細胞に対する陽性の効果を有す る（即ち、このアンタゴニストは、これらの細胞の生存力及び／又は増殖性応答 を回復する）ので、偽陽性がこのアッセイにより同定されることはありそうにな い。これは、アンタゴニスト刺激が細胞死へと導くアッセイ系（この場合には、 レセプターアゴニストとして特異的に作用する化合物に加えて、これらの細胞に 対して非特異的に毒性である化合物が選択されよう）と対照的である。 指標細胞の生存力又は増殖を、当分野で周知の１つ又は幾つかの適当な技術に よって測定することができる。例えば、細胞生存力を、細胞の、好ましくは染料 例えばトリパンブルー（これは、生存細胞から排除される）で処理した細胞の 細胞計数により（例えば、血球計を用いて）、又は細胞生存力と相関する指標細 胞の酵素活性例えばテトラゾリウム塩（例えば、３，（４，４−ジメチルチアゾ ール−２−イル）２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド［ＭＴＴ］）の 還元（分光測光的に検出可能）を測定することにより測定することができる（実 施例２及び３を参照されたい）。更に、細胞生存力は、ヨウ化プロピジウム、ア クリジンオレンジ及びHoechst 33342等の指示染料を用いて測定することができ る。細胞増殖は又、例えば、トリチウム化チミジンの取り込みによっても測定す ることができる。哺乳動物細胞については、指標細胞の細胞生存力又は増殖の測 定は、典型的には、試験組成物との接触後２〜７日にて行なう。 このアッセイ系における使用のための好適なＧＰＣＲは、ＬＨＲＨ−Ｒである 。実施例２で示すように、ＬＨＲＨ−Ｒを発現するチャイニーズハムスター卵巣 （ＣＨＯ）細胞を公知のＬＨＲＨ−Ｒアゴニストと接触させた場合には、これら の細胞によるＭＴＴの還元（細胞生存力の指標）は、減少する。その上、ＬＨＲ Ｈ−Ｒを発現するＣＨＯ細胞をレセプターアゴニストと公知のレセプターアンタ ゴニストの両者と接触させた場合には、アゴニストにより誘導された細胞の減少 した生存力が逆転する。試験化合物をかかる細胞に対して同様にスクリーニング することができ、それらの細胞の生存力及び／又は増殖を測定して試験化合物を レセプターアゴニスト又はアンタゴニストとして同定することができる。試験組 成物に含有することのできる公知のＬＨＲＨ−Ｒアゴニスト又はアンタゴニスト （例えば、公知のアゴニストを試験組成物中に含有して、試験化合物をレセプタ ーアンタゴニストとして同定することができる）は、市販されている（例えば、ミズーリ 、St.Louis在、Sigma Chemical Co.）。好適なＬＨＲＨ−Ｒアゴニストには 、ＬＨＲＨアナログ例えば［Ｄ−Ｈｉｓ⁶］−ＬＨＲＨが含まれるが、好適なＬ ＨＲＨ−Ｒアンタゴニストは、アンタイドである。 このアッセイ系での使用のための他の好適なＧＰＣＲは、Ｍ１ムスカリン性レ セプターである。実施例３に示すように、Ｍ１ムスカリン性レセプターを発現す るＣＨＯ細胞を公知のＭ１ムスカリン性レセプターアゴニストと接触させた場合 には、それらの細胞によるＭＴＴの還元（細胞生存力の指標）は、減少する。そ の上、Ｍ１ムスカリン性レセプターを発現するＣＨＯ細胞をレセプターアゴニス トと公知のレセプターアンタゴニストの両者と接触させた場合には、そのアゴニ ストにより誘導されたそれらの細胞の減少した生存力が逆転する。試験化合物を 、同様にしてかかる細胞に対してスクリーニングすることができ、それらの細胞 の生存力及び／又は増殖を測定してその（それらの）試験化合物をレセプターア ゴニスト又はアンタゴニストとして同定することができる。試験組成物中に含有 することのできる公知のＭ１ムスカリン性レセプターのアゴニスト又はアンタゴ ニスト（例えば、公知のアゴニストを試験組成物に含有させて、試験化合物をレ セプターアンタゴニストとして同定することができる）は、市販されている（例 えば、ミズーリ、St.Louis在、Sigma Chemical Co.）。好適なＭ１ムスカリン性レセ プターアゴニストは、カルバコールであるが、好適なＭ１ムスカリン性レセプタ ーアンタゴニストは、ピレンゼピンである。 好適具体例において、指標細胞の生存力又は増殖を、試験化合物をレセプター アゴニスト又はアンタゴニストとして同定する基礎となる代謝パラメーターとし て用いた場合、これらの指標細胞により発現されるＧＰＣＲは、Ｇｑ／１１Ｇ蛋 白質とカップルする。上記のＬＨＲＨレセプターに加えて、Ｇｑ／１１Ｇ蛋白質 とカップルするＧＰＣＲの他の例には、次のレセプターが含まれる：Ｍ１ムスカ リン性、アセチルコリン（ｍ１、３及び５サブタイプ）、アデノシン１、α−ア ドレナリン作動性（ａ１Ａ、ａ１Ｂ及びａ１Ｃサブタイプ）、アンギオテンシン （ＡＴ１Ａサブタイプ）、ボンベシン（ＢＢ１及びＢＢ２サブタイプ）、ブラジ キニン（Ｂ２サブタイプ）、Ｃ５ａ、コレシストキニン（ＣＣＫａ及びＣＣＫｂ サブタイプ）、エンドセリン（Ｅｔａ及びＥｔｂサブタイプ）、グルタメート（ ｍＧ１ｕ１、５サブタイプ）、５ＨＴ（２ＡＮＢ及びＣサブタイプ）、ヒスタミ ン（Ｈ１サブタイプ）、ニューロテンシン、ニューロキニン（ＮＫ２、３サブタ イプ）、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン （ＴＲＨ）、ＴＳＨ、トロンボキサンＡ２及びバソプレッシン（Ｖ１ａサブタイ プ）。 更に別の具体例において、この機能的バイオアッセイにおいて用いるＧＰＣＲ は、キメラＧＰＣＲである。このキメラレセプターは、少なくとも１つの第１の 膜貫通７セグメント（７ＴＭＳ）レセプターのリガンド結合ドメイン、及び少な くとも１つの第２の膜貫通７セグメント（７ＴＭＳ）レセプターのシグナル変換 ドメインを含む。好適具体例において、第２の膜貫通７セグメント（７ＴＭＳ） のシグナル変換ドメインを、キメラレセプターがこれらの指標細胞においてＧｑ ／１１Ｇ蛋白質とカップルするように選択する。他の具体例においては、第２の 膜貫通７セグメント（７ＴＭＳ）のシグナル変換ドメインを、このキメラレセプ ターが指標細胞中のＧ蛋白質の他の型例えばＧ_s又はＧ_iとカップルするように選 択する。 ７ＴＭＳレセプターの構造に関して、膜貫通セグメントは、ここでは、ＴＭＳ Ｉ−ＶＩＩ（Ｎ末端からＣ末端に至る）として言及し、３つの細胞内ループを、 ＩＣ１（ＴＭＳＩとＴＭＳＩＩを繋ぐ）、ＩＣ２（ＴＭＳＩＩＩとＴＭＳＩＶを 繋ぐ）及びＩＣ３（ＴＭＳＶとＶＩを繋ぐ）として言及し、３つの細胞外ループ を、ＥＣ１（ＴＭＳＩＩとＴＭＳＩＩＩを繋ぐ）、ＥＣ２（ＴＭＳＩＶとＶを繋 ぐ）及びＥＣ３（ＴＭＳＶＩとＶＩＩを繋ぐ）として言及する。７ＴＭＳレセプ ターの「リガンド結合ドメイン」は、レセプターによるリガンドの認識に必要な レセプターの部分をいい、７ＴＭＳレセプターの「シグナル変換ドメイン」は、 レセプターによるシグナル変換特にレセプターの特異的なＧ蛋白質（例えば、Ｇ ｑ／１１）へのカップリングに必要なレセプターの部分をいう。 ある種のキメラ７ＴＭＳレセプター（第２の７ＴＭＳレセプターの部分に融合 した一つの７ＴＭＳレセプターの部分よりなるもの）の構築及び発現は、当分野 で記載されてきた。例えば、キメラは、α２−及びβ２−アドレナリン作動性レ セプター間で（例えば、Kobilika,B.K．等(1988)Science 240:1310-1316;参照） 、α１−及びβ２−アドレナリン作動性レセプター間で（例えば、Cotecchia,S. 等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2896-2900参照）並びにＭ１−及びＭ２− ムスカリン性レセプター間（例えば、Kubo,T．等(1988)FEBS Letters 241:119-125参照）で構築された。これらの研究は、７ＴＭＳレセプタ ーの別個の構造的決定基がレセプターのリガンド結合特性又はＧ蛋白質カップリ ング特性に寄与することを示した。特に、Ｇ蛋白質認識に関与する決定基は、Ｔ ＭＳＶ及びＴＭＳＶＩに繋がる細胞内ループ３（ＩＣ３）にマップされた。従っ て、一具体例において、キメラレセプターの「少なくとも１つの第２の７ＴＭＳ レセプターのシグナル変換ドメイン」は、関心のあるＧ蛋白質例えばＧｑ／１１ 、Ｇ_S又はＧ_iＧ蛋白質にカップルする７ＴＭＳレセプターの少なくとも１つの細 胞内ループ３（ＩＣ３）を含む。 好ましくは、ＬＨＲＨレセプター（Ｇｑ／１１とカップルする）からのＩＣ３ を用いる。一層好ましくは、ヒトのＬＨＲＨレセプターからのＩＣ３を用いる。 マウス及びヒトのＬＨＲＨ−Ｒのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、S.C.Sealfo nのＰＣＴ出願ＷＯ９４／００５９０号に開示されている。そこに開示されたヒ トＬＨＲＨ−Ｒのアミノ酸配列によれば、ＩＣ３は、ほぼアミノ酸残基２３４〜 ２６８に対応する。それ故、ヒトのＬＨＲＨ−ＲのＩＣ３を含むキメラＧＰＣＲ を構築するために、ヒトＬＨＲＨ−Ｒのアミノ酸残基２３４〜２６８をコードす るヌクレオチド配列を、標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖 反応、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡライゲーション等）を用いて、他の ７ＴＭＳレセプターのＩＣ３をコードするヌクレオチド配列と交換する。例えば 、β２−アドレナリン作動性レセプター（β２−ＡＲ）／ＬＨＲＨ−Ｒキメラレ セプターを構築するために、ＩＣ３をコードするβ２−ＡＲｃＤＮＡの領域を欠 失させ、ＬＨＲＨ−ＲのＩＣ３をコードするヌクレオチド配列で置き変える。こ のキメラｃＤＮＡを組換え発現ベクター中にクローン化して、上記のような標準 的技術によって宿主細胞中に導入して、この発明のバイオアッセイで用いるため のキメラレセプターを発現する指標細胞を造ることができる。 ＩＣ３に加えて、キメラレセプターは、ＩＣ１及び／又はＩＣ２等のシグナル 変換に関与する第２の７ＴＭＳレセプターの更なる部分を含むことができる。例 えば、キメラの第２の７ＴＭＳレセプターがヒトＬＨＲＨ−Ｒであるとき、ヒト ＬＨＲＨ−Ｒのアミノ酸残基６２〜７６（ＩＣ１に対応）及び／又は１４０〜１ ５６（ＩＣ２に対応）を、キメラの第１の７ＴＭＳレセプターの同等 のＩＣ１及び／又はＩＣ２ドメインと交換することができる。その上、カルボキ シ末端領域を欠失させ、又はキメラに加えることができる。例えば、キメラの第 １の７ＴＭＳレセプター（リガンド結合ドメインに寄与）が普通にカルボキシ末 端領域を含み、キメラの第２の７ＴＭＳレセプター（シグナル変換ドメインに寄 与）がＬＨＲＨ−Ｒであるときは、第１の７ＴＭＳレセプターのカルボキシ末端 領域は、ＬＨＲＨレセプターが普通にカルボキシ末端領域を欠いているので、キ メラから欠失させ又は削除することができる。 この発明の他の具体例において、ＧＰＣＲのアゴニスト又はアンタゴニストは 、指標細胞の集団の細胞形態を変える能力に基づいて同定される。従って、この 発明は、下記を含む、Ｇ蛋白質とカップルするレセプターのアゴニスト又はアン タゴニストを同定する方法を提供する： ａ）指標細胞の集団を、少なくとも１種の試験化合物を含む試験組成物と接触 させ； ｂ）これらの指標細胞の形態を測定し；そして ｃ）少なくとも１種の試験化合物を、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターのア ゴニスト又はアンタゴニストとして同定する。 この発明のＧＰＣＲを発現する指標細胞は、レセプターアゴニストと接触した ときに細胞形態の変化を示すことが認められた。例えば、Ｇｑ／１１Ｇ蛋白質と カップルするＧＰＣＲ（例えば、ＬＨＲＨ−Ｒ）を発現するＣＨＯ細胞等の指標 細胞は、レセプターアゴニストと接触したときに、一層丸くなり、培養皿からは がれる。更に、Ｇ_SＧ蛋白質とカップルするＧＰＣＲ（例えば、β２−アドレナ リン作動性レセプター）を発現する指標細胞は、レセプターアゴニストと接触し たときに、一層紡錘形になり長くなる。その上、細胞形態におけるかかる変化は 、これらの指標細胞をレセプターアンタゴニストと更に接触させることによって 打ち消し又は逆転させることができる。それ故、試験化合物を、指標細胞をその 試験化合物と接触させたときに指標細胞の細胞形態をその試験化合物の不在時の 細胞形態と比較して変化させる能力に基づいて、ＧＰＣＲのアゴニストとして 同定することができる。 このバイオアッセイの他の具体例において、試験組成物は、試験化合物と少な くとも１種の公知のレセプターアゴニスト又はアンタゴニストを含む。例えば、 試験化合物は、レセプターアゴニストの存在時に、指標細胞を、アゴニストの不 在時に培養したときの元の形態に戻す能力に基づいて、ＧＰＣＲのアンタゴニス トとして同定することができる。従って、他の具体例において、この発明は、下 記を含む、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターのアンタゴニストを同定する方法 を提供する： ａ）指標細胞の集団を、少なくとも１種の試験化合物と少なくとも１種の公知 のレセプターアゴニストを含む試験組成物と接触させ； ｂ）これらの指標細胞の細胞形態を測定し；そして ｃ）少なくとも１種の試験化合物を、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターのア ンタゴニストとして同定する。 ここで用いる場合、用語「細胞形態」は、一般に、細胞の全体的形状をいう。 指標細胞の細胞形態は、標準的な光学顕微鏡観察により測定することができる。 その上、細胞のデジタルイメージングを行なって、細胞形態のパラメーター例え ば細胞表面積を定量することができる。哺乳動物細胞について、形態の測定は、 典型的には、試験組成物との接触の約２４〜７２時間後に行なう。 本明細書中で上記したように、ＧＰＣＲを、レセプターアゴニスト又はアンタ ゴニストをこれらの指標細胞の形態に対するそれらの効果に基づいて同定するこ のバイオアッセイにおいて用いることができる。例えば、様々な具体例において 、ＧＰＣＲは、Ｇｑ／１１Ｇ蛋白質又はＧ_S蛋白質とカップルすることができ、 ＧＰＣＲは、キメラレセプターであってよく又はＧＰＣＲは、「孤児」レセプタ ーであってよい。 この発明の他の面は、組換えＧＰＣＲを発現する細胞を調製する方法に関係す る。これらの細胞は、この発明のバイオアッセイにおける指標細胞としての使用 に適している。ＧＰＣＲを発現する細胞を調製するためのこの発明の方法は、少 なくとも部分的に、宿主細胞上で発現された組換えＧＰＣＲのレセプターアゴ ニストでの刺激は、減少した細胞生存力及び／又は減少した細胞増殖へと導くと いう発見に基づいている。従って、ＧＰＣＲを発現する細胞の改良された生成の ためには、レセプターアゴニストによるＧＰＣＲの刺激を阻止し又は回避する。 こうして、この発明は、細胞膜上で組換えのＧ蛋白質とカップルしたレセプター を発現する細胞を調製する改良された方法であって、レセプターアゴニストによ るレセプターの刺激が阻止されている培養条件下でその細胞にそのレセプターを コードする核酸分子を導入してその細胞の膜上でそのレセプターが発現されるよ うにすることを含む上記の方法を提供する。 ここで用いる場合、用語「組換えＧ蛋白質とカップルしたレセプター」は、宿 主細胞に導入された外因性核酸分子によりコードされるＧＰＣＲをいう（例えば 、このＧＰＣＲは、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターによ りコードされる）。好ましくは、宿主細胞は、ＧＰＣＲの内因性の発現を欠いて いる。組換えＧＰＣＲは、宿主細胞と同じ種から又は宿主細胞と異なる種から導 くことができる（例えば、ヒトの組換えＧＰＣＲを、非ヒト宿主細胞例えばＣＨ Ｏ、ＣＯＳ又は３Ｔ３細胞等の上で発現させることができる）。 組換えＧＰＣＲを発現する細胞を生成する方法の一具体例において、「レセプ ターアゴニストよるレセプターの刺激が阻止されている培養条件」は、レセプタ ーアンタゴニストを含む培地における細胞の培養を含む。多くの異なるＧＰＣＲ の故落ちのレセプターアンタゴニストは、市販されている。例えば、ＬＨＲＨ− Ｒに対しては、公知のレセプターアンタゴニストアンタイドを培地に含有するこ とができ、又はＭ１ムスカリン性レセプターに対しては、公知のレセプターアン タゴニストピレンゼピンを培地に含有させることができる。 組換えＧＰＣＲを発現する細胞を生成する方法の他の具体例において、「レセ プターアゴニストによるレセプターの刺激が阻止されている培養条件」は、レセ プターアゴニストを欠く培地中での細胞の培養を含む。レセプターアゴニストを 欠く培地は、例えば、レセプターアゴニストを例えば透析により除去した血清を 用いて調製することができる。例えば、透析したウシ胎児血清を、細胞の成長因 子源として用いることができる。 ＧＰＣＲを発現する細胞を調製するためのこの発明の方法において、細胞を、 細胞膜上のレセプターの安定な発現が達成されるまで、レセプターアゴニストに よるレセプターの刺激が阻止されている培養条件下に維持することができる。従 って、この発明は、更に、組換えＧＰＣＲを発現する細胞の安定した集団を調製 する方法を提供する。ここで用いる場合、「安定な」細胞集団は、組換えＧＰＣ Ｒの発現が（例えば、ＧＰＣＲをコードする核酸の細胞ゲノムへのインテグレー ションにより）培養期間を通して本質的に不変のままである細胞をいう。好まし くは、この細胞によるＧＰＣＲの発現は、少なくとも１か月、一層好ましくは少 なくとも６か月、更に一層好ましくは少なくとも１年間にわたって、最も好まし くは無期限に安定である。 それ故、この発明の他の面は、組換えＧＰＣＲを発現する細胞の安定な集団に 関係する。この発明は、例えばこの発明のバイオアッセイにおける指標細胞とし て用いることのできる改良された細胞集団を提供する。一具体例において、これ らの細胞は、レセプターアゴニストによるレセプターの刺激が阻止されている条 件下で培養培地中で組換えのＧ蛋白質とカップルするレセプターを発現する細胞 の安定な集団を含む。「レセプターアゴニストによるレセプターの刺激が阻止さ れている培養条件」には、例えば、上記のように、レセプターアンタゴニストを 含む培養培地又はレセプターアゴニストを欠く培養培地（例えば、含有する血清 が透析されたものである培養培地）が含まれ得る。 この発明の更に別の面は、キメラＧＰＣＲをコードする核酸組成物及びキメラ ＧＰＣＲを発現する宿主細胞に関係する。例えば、この発明は、キメラのＧ蛋白 質とカップルしたレセプター（ＧＰＣＲ）をコードする単離した核酸分子を提供 する。このキメラＧＰＣＲは、第１の膜貫通７セグメントレセプターの少なくと も１つのリガンド結合ドメイン及び第２の膜貫通７セグメントレセプターの少な くとも１つのシグナル変換ドメインを、キメラＧＰＣＲが宿主細胞内で発現され たときにキメラＧＰＣＲがＧｑ／１１Ｇ蛋白質にカップルするように含む。好ま しくは、第２の７ＴＭＳレセプターは、ＬＨＲＨレセプターである。一層好まし くは、第２の７ＴＭＳレセプターは、ヒトのＬＨＲＨレセプターである。このキ メラの第１の７ＴＭＳレセプターは、通常Ｇｑ／１１Ｇ蛋白質とカッ プルしないＧＰＣＲである。例えば、この第１の７ＴＭＳレセプターは、β２− アドレナリン作動性レセプターであってよい（これは、Ｇ_Sとカップルする）。 キメラレセプターをコードする核酸は、標準的分子生物学技術を用いて、第２の ７ＴＭＳレセプターの部分をコードするヌクレオチド配列を、第１の７ＴＭＳレ セプターの対応する部分をコードするヌクレオチド配列と交換することにより調 製することができる（上記のように）。例えば、好適具体例において、第１の７ ＴＭＳレセプターをコードするｃＤＮＡの部分を、ＬＨＲＨ−Ｒのシグナル変換 ドメインを含むＬＨＲＨ−ＲｃＤＮＡの部分と置き換える。従って、一具体例に おいて、この発明の核酸は、Ｇｑ／１１とカップルするＧＰＣＲの細胞内ループ ３好ましくはＬＨＲＨ−ＲのＩＣ３を含むキメラレセプターをコードする。他の 具体例において、この発明の核酸は、Ｇｑ／１１とカップルするＧＰＣＲの細胞 内ループ１、２及び３（例えば、好ましくは、ＬＨＲＨ−ＲのＩＣ１、２及び３ ）を含むキメラレセプターをコードする。更に他の具体例において、この発明の 核酸は、Ｇｑ／１１とカップルするＧＰＣＲの細胞内ループ１、２及び３を含む キメラレセプターをコードし、更に、このキメラレセプターのカルボキシ末端ド メインは欠失している。キメラＧＰＣＲをコードする核酸分子を含む組換え発現 ベクター及びかかる組換え発現ベクターを導入した宿主細胞も又、この発明に包 含される。かかるキメラＧＰＣＲを発現する宿主細胞を、この発明のバイオアッ セイにおいて指標細胞として用いることができる。 この発明の他の面は、組換えヒト黄体形成ホルモン放出ホルモンレセプターを 発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に関係する。この発明の更 に別の面は、組換えのＧ蛋白質とカップルしたレセプターを発現するチャイニー ズハムスター卵巣細胞に関係する。このキメラレセプターは、少なくとも１つの 第１の膜貫通７セグメントレセプターのリガンド結合ドメイン及び少なくとも１ つの第２の膜貫通７セグメントレセプターのシグナル変換ドメインを含み、この キメラレセプターは、細胞内のＧｑ／１１Ｇ蛋白質とカップルする。好ましくは 、このキメラの第２の７ＴＭＳレセプターは、ＬＨＲＨレセプターである。一層 好ましくは、このキメラの第２の７ＴＭＳレセプターは、ヒトＬＨＲＨレセ プターである。この発明のＣＨＯ細胞は又、この発明のバイオアッセイにおける 指標細胞として用いることもできる。 ＧＰＣＲのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するためのこの発明の方法は 、ＧＰＣＲの異常な活性に関係する病状の治療において有用な化合物を同定する のに有用である。多くのヒトの病気が、ＧＰＣＲにおける突然変異にまで、その 由来が明らかにされてきた（Coughlin,S.R.(1994) Curr.Op.Cell.Biol.6:191-10 7に総説あり）。その上、多くのヒトの病気は、現在、公知のＧＰＣＲのアゴニ スト又はアンタゴニストを用いて治療されている。例には、前立腺癌及び乳癌、 子宮平滑筋腫、子宮内膜症、性的早熟及び非腫瘍性卵巣アンドロゲン過剰症候群 を治療するために用いられてきたＬＨＲＨアゴニスト例えばロイプロリド、ゴナ ドレリン及びナファレリン、高血圧、狭心症及び精神病を治療するために用いら れてきた心臓のβ−アドレナリン作動性レセプターアンタゴニストであるプロプ ラノロール、気管支拡張剤として用いられてきた肺のβ２−アドレナリン作動性 レセプターアゴニストであるメタプロテレノール並びに潰瘍及び特発性蕁麻疹を 治療するために用いられてきたヒスタミン２レセプターアンタゴニストであるシ メチジンが含まれる。ＧＰＣＲ及びそれらの潜在的な臨床上の適応症の他の例は 、次のとおりである：アセチルコリン（乗り物酔い）、アデノシン１（腎臓病、 睡眠性無呼吸；認知障害）、α−アドレナリン作動性（高血圧、良性前立腺肥大 、性的不能）、アンギオテンシン（腎臓病）、ボンベシン（小細胞肺癌；平滑筋 収縮）、ブラジキニン（炎症）、Ｃ５ａ（炎症）、コリシストキニン（恐慌的発 作；痛覚脱失）、エンドセリン（高血圧、心筋梗塞、潰瘍、喘息、腎不全）、及 びグルタメート（記憶及び学習）。更なる及び改良されたレセプターアゴニスト 及びアンタゴニストを、この発明のスクリーニングアッセイを用いて同定するこ とができる。その上、未知の機能の孤児ＧＰＣＲのリガンドを同定することがで き、それにより、これらの孤児ＧＰＣＲの生理的役割の増大した理解が可能にな り、恐らく、それらに対するアゴニスト又はアンタゴニストの治療標的としての 利用が可能になる。 この発明を、下記の実施例により更に説明するが、制限するものと解釈すべき ではない。この出願中で引用されているすべての参考文献、特許及び公開された 特許出願の内容を、参考として本明細書中に援用する。実施例１ ： 黄体形成ホルモン放出ホルモンレセプターを発現する指標細胞の 構築 この発明のスクリーニングアッセイにおける使用に適した黄体形成ホルモン放 出ホルモンレセプター（ＬＨＲＨ−Ｒ）を発現する指標細胞を造るために、ヒト ＬＨＲＨ−ＲをコードするｃＤＮＡを組換え発現ベクター中にクローン化し、そ のベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中にトランスフェクト して、安定にトランスフェクトされたクローンを下記のようにして選択した。 ヒトＬＨＲＨ−Ｒ蛋白質のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（そのヌクレオ チド及びアミノ酸配列は、S.C.SealfonのＰＣＴ公開ＷＯ９４／００５９０中に 開示されている）を、標準的分子生物学技術を用いて、組換え発現ベクター中に クローン化した。このベクターにおいて、ＬＨＲＨ−Ｒの発現は、ＳＶ４０エン ハンサー及びアデノウイルス主要後期プロモーターにより指示される。更に、こ のベクターは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を選択マーカーと して含有した。 ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠乏ＣＨＯ細胞（DUKX B1 細胞；メリーランド、Rockville 在、American Type Culture Collectionより入手可能、カタログ番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ９０１０）を、標準的リポフェクション法を用いて、上記のＬＨＲＨ−Ｒ 発現ベクターでトランスフェクトした（例えば、メリーランド、Gaithersburg在、Gibc o/BRLから市販されているリポフェクチン（商標）試薬を使用）。安定にトラン スフェクトされたクローンを選択するために、トランスフェクトした細胞を、増 加する量のメトトレキセートを含むアルファＭＥＭ培地／透析済ウシ胎児血清中 に維持した。安定なクローンを、それらの獲得したメトトレキセート耐性に基づ いて選択した。実施例２ ： ＬＨＲＨ−Ｒアンタゴニスト及びアゴニストのアッセイ ＬＨＲＨ−Ｒを発現するＣＨＯ細胞クローン（実施例１に記載）を、バイオア ッセイで用いて、下記のようにＬＨＲＨ−Ｒアンタゴニスト又はアゴニストを同 定した。これらの細胞を、９６ウェルプレートのウェル中にプレートして（２５ ００細胞／ウェル）、公知のＬＨＲＨ−Ｒアゴニスト単独（［Ｄ−Ｈｉｓ⁶］− ＬＨＲＨ）（ミズーリ、St.Louis在、Sigma Chemical Co.より市販されている）の１ ピコモル〜１０ナノモルの濃度の存在下で、又は公知のＬＨＲＨアンタゴニスト 単独（アンタイド）（ミズーリ、St.Louis在、Sigma Chemical Co.より市販されてい る）の１ピコモル〜１００ナノモルの濃度の存在下で、又はこれらのアゴニスト 及びアンタゴニストの両者の様々な濃度の組合せの存在下で培養した。対照とし て、ＬＨＲＨ−Ｒを発現するＣＨＯ細胞を、更に如何なる物質をも含まずに培養 した。他の対照として、トランスフェクトしてないＣＨＯDUKX B1細胞を、種々 の濃度のアゴニスト（［Ｄ−Ｈｉｓ⁶］−ＬＨＲＨ）を単独で伴って又はアンタ ゴニスト（アンタイド）を単独で伴って培養した。 ５日間の培養の後に、細胞生存力を、生存力の指標である３，（４，４−ジメ チルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（Ｍ ＴＴ）を用いて評価した。（Shearman,M.S．等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9 1 :1470-1474; Hansen,M.B．等(1989)J.Immun.Methods 119:203-210を参照された い）。ＭＴＴ（ミズーリ、St.Louis在、Sigma Chemical Co.より市販されている）は 、生存細胞中で酵素により還元されて黄色から青色になる発色性物質であり、そ れは、分光測光により検出することができる。細胞の生存力を、アゴニスト及び ／又はアンタゴニストの存在下で測定するために、ＭＴＴを、３７℃での培養の 最後の２．７５時間にわたって細胞に加えた（終濃度１ｍｇ／ｍｌ）。 ＭＴＴとのインキュベーションの後に、培地を除去して、細胞をイソプロパノー ル／０．４ＨＣｌ中で攪拌して溶解させた。各ウェルの５７０ｎｍでの吸光度を 測定して生存細胞を定量した。或は、ＭＴＴを、５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム アミド／２０％ドデシル硫酸ナトリウムの添加（ウェル中の培地に直接加える） により可溶化して、生存細胞を、同様に、５７０ｎｍの吸光度を測定することに より定量した。 ＬＨＲＨ−Ｒを発現するＣＨＯ細胞を用いたバイオアッセイの代表例の結果を 図１Ｂにグラフで示し、対照用のトランスフェクトしてないＣＨＯ細胞を用いた 結果を図１Ａにグラフで示す。図１Ｂに示したデータは、ＬＨＲＨ−Ｒを発現す るＣＨＯ細胞の生存力は、増大する量のレセプターアンタゴニストが単独で存在 することによっては影響を受けないが、細胞生存力は、増大する量のレセプター アゴニストが単独で存在する場合には顕著に減少した（５７０ｎｍでの減少した 吸光度により示される）ことを示している。特に、このレセプターアゴニストの 存在時における減少した細胞生存力は、レセプターアンタゴニストがレセプター アゴニストと共に存在するときには逆転した。この効果は、投与量依存性であっ て、一層高濃度のレセプターアンタゴニストの使用は、一層大きい細胞生存力へ と導いた。対照的に、アゴニストもアンタゴニストもトランスフェクトしてない ＣＨＯ細胞の生存力には何らの効果も有さず（図１Ａ）、これは、この現象がＣ ＨＯ細胞上でのＬＨＲＨ−Ｒの発現に依存していることを示している。 ここに記載した結果は、アゴニストが単独で存在する場合のＬＨＲＨ−Ｒを発 現するＣＨＯ細胞の生存力と比較して、レセプターアゴニスト及び第２の化合物 の存在下での増大した細胞生存力が、その第２の化合物がレセプターアンタゴニ ストであることを示すことを示している。更に、これらの結果は、アンタゴニス トが単独で存在するか又は如何なる化合物も存在しない場合のＬＨＲＨ−Ｒを発 現するＣＨＯ細胞の生存力と比較して、レセプターアンタゴニスト及び第２の化 合物が存在する場合又は第２の化合物が単独で存在する場合における減少した細 胞生存力が、その第２の化合物がレセプターアゴニストであることを示すという ことを示している。実施例３ ： Ｍ１ムスカリン性レセプターアンタゴニスト及びアゴニストの アッセイ Ｍ１ムスカリン性レセプターを発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ 細胞（例えば、Ｍ１ＷＴ３細胞、メリーランド、Rockville在、American Type Culture Collectionより入手可能、カタログ番号ＣＲＬ１９８５）をバイオアッセイで用 いて、本質的に実施例２に記載したように、Ｍ１ムスカリン性レセプターのアン タゴニスト又はアゴニストを同定した。簡単には、これらの細胞を、９６ウェル プレートのウェル中にプレートし（２５００細胞／ウェル）、公知のＭ１ムスカ リン性レセプターアゴニスト単独（カルバコール）（カルバミルコリンクロリド としても知られ、ミズーリ、St.Louis在、SigmaChemical Co.より市販されている）の １００ナノモル〜１０ミリモルの濃度の存在下で、又は公知のＭ１ムスカリン性 レセプターアンタゴニスト単独（ピレンゼピン）（ミズーリ、St.Louis在、Sigma Che mical Co.より市販されている）の１００ナノモル〜１ミリモルの濃度の存在下 で、又はこれらのアゴニスト及びアンタゴニストの両者の様々な濃度の組合せの 存在下で培養した。対照として、Ｍ１ムスカリン性レセプターを発現するＣＨＯ 細胞を、更に如何なる物質をも含まずに培養した。他の対照として、トランスフ ェクトしてないＣＨＯDUKX B1細胞を、種々の濃度のアゴニスト（カルバコール ）を単独で伴って又はアンタゴニスト（ピレンゼピン）を単独で伴って培養した 。 ５日間の培養の後に、細胞生存力を、実施例２に記載したように、生存力の指 標であるＭＴＴを用いて測定した。Ｍ１ムスカリン性レセプターを発現するＣＨ Ｏを用いたバイオアッセイの代表例の結果を図２Ｂにグラフで示し、対照用のト ランスフェクトしてないＣＨＯ細胞を用いた結果を図２Ａにグラフで示す。実施 例２に記載したＬＨＲＨ−Ｒを発現する細胞を用いて認められた結果に類似して 、図２Ｂに示したデータは、Ｍ１ムスカリン性レセプターを発現するＣＨＯ細胞 の生存力は、増大する量のレセプターアンタゴニスト（ピレンゼピン）が単独で 存在することによっては影響を受けないが、細胞生存力は、増大する量のレセプ ターアゴニスト（カルバコール）が単独で存在する場合には顕著に減少した（５ ７０ｎｍでの減少した吸光度により示される）。特に、このレセプターアゴニス トの存在時における減少した細胞生存力は、レセプターアンタゴニストがレセプ ターアゴニストと共に存在するときには逆転した。この効果は、投与量依存性で あって、一層高濃度のレセプターアンタゴニストの使用は、一層大きい細胞生存 力へと導いた。対照的に、アゴニストもアンタゴニストもトランスフェ クトしてないＣＨＯ細胞の生存力には殆ど効果を有さず（図２Ａ）、これは、こ の現象がＣＨＯ細胞上でのＭ１ムスカリン性レセプターの発現に依存しているこ とを示している。 ここに記載した結果は、アゴニストが単独で存在する場合のＭ１ムスカリン性 レセプターを発現するＣＨＯ細胞の生存力と比較して、レセプターアゴニスト及 び第２の化合物の存在下での増大した細胞生存力が、その第２の化合物がレセプ ターアンタゴニストであることを示すことを示している。更に、これらの結果は 、アンタゴニストが単独で存在するか又は如何なる化合物も存在しない場合のＭ １ムスカリン性レセプターを発現するＣＨＯ細胞の生存力と比較して、レセプタ ーアンタゴニスト及び第２の化合物が存在する場合又は第２の化合物が単独で存 在する場合における減少した細胞生存力が、その第２の化合物がレセプターアゴ ニストであることを示すということを示している。実施例４ ： 試験化合物のライブラリーのスクリーニング 実施例１に記載のようにして調製したＬＨＲＨ−Ｒを発現する細胞系統を、化 合物のライブラリーと共にインキュベートして、このレセプターのアゴニスト又 はアンタゴニストを同定した。このライブラリーは、組合せ法を用いて生成した 少なくとも１００の異なるペプチド化合物よりなり、これを、各々少なくとも１ ０の化合物を含む１０の試料プールに分割した。９６ウェルプレートの各ウェル 中のペプチドの終濃度は、１．５μＭであった。これらの試料の２つに、ＬＨＲ Ｈ−Ｒアンタゴニストであるアンタイドを（試料６に１．５μＭで）又はＬＨＲ Ｈ−ＲアゴニストであるＤ−Ｈｉｓ⁶−ＬＨＲＨを（試料４に１．５μＭで）「 加えた」。 細胞を、試験化合物を１ｎＭ Ｄ−Ｈｉｓ⁶−ＬＨＲＨの存在下で同時インキ ュベートすることにより「アンタゴニストモード」（即ち、レセプターアンタゴ ニストの同定を可能にする条件）でアッセイするか、又は試験化合物を細胞培養 物に他に何も加えないで単独でインキュベートすることにより「アゴニストモー ド」（即ち、レセプターアゴニストの同定を可能にする条件）でアッセイした。 ５日間の培養の後に、細胞生存力を、実施例２に記載のようにして評価した。図 ３にグラフで示したそれらの結果は、このアッセイ系が、公知のＬＨＲＨアゴニ ストを加えた試料（試料４、Ｄ−Ｈｉｓ⁶−ＬＨＲＨ）を、「アゴニストモード 」において容易に同定したが、このアッセイ系が、公知のＬＨＲＨアンタゴニス トを加えた試料（試料６、アンタイド）を、「アンタゴニストモード」において 容易に同定したことを示している。更に、組合せにより生成したペプチドのプー ルの存在は、このアッセイを邪魔せず、これは、化合物の複雑な混合物を、この 発明の系を用いてスクリーニングすることができることを示している。実施例５ ： 細胞形態変化の説明 実施例１に記載したようにして調製したヒトのβ２−アドレナリン作動性レセ プターを発現している細胞系統を、完全な生育培地中で、１）１ｎＭ サルブタ モール（公知のβ２−アドレナリン作動性レセプターアゴニスト）又は２）サル ブタモールを伴う１０ｎＭ ブトキサミン（公知のβ２−アドレナリン作動性レ セプターアンタゴニスト）と共にインキュベートした。数日後に、細胞を光学顕 微鏡により分析して、細胞形態に対する処理の効果を測定した。サルブタモール 単独で処理した細胞での結果の代表的写真を図４に示す。サルブタモールは、細 胞形状の変化（即ち、細胞の伸長）及び細胞相互の整列の変化の両者を誘導した 。従って、細胞により覆われた培養の全表面積は、細胞をサルブタモールにさら すことにより大いに減少した。サルブタモールとブトキサミンの両者にさらした 細胞は、対照用細胞と区別することができず、これは、レセプターアンタゴニス トによるこの効果の拮抗作用を示している。個々の化合物又は化合物のライブラ リーのアゴニスト又はアンタゴニスト特性の評価を、例えば、これらの細胞の顕 微鏡観察により、或は、細胞形状の変化及び／又は細胞整列の変化を定量するビ デオデジタイジング技術によって達成することができる。ブトキサミン単独は、 細胞の形状及び整列に検出可能な変化を生じなかったし、サルブタモールも組換 えβ２−アドレナリン作動性レセプターを発現しないトランスフェクトしてない ＣＨＯ細胞に対しては変化を生じなかった。同等物 当業者は、本明細書中に記載したこの発明の特定の具体例に対する多くの同等 物を認識し、又は常例的実験を用いて確認することができるであろう。かかる同 等物は、後記の請求の範囲に包含されるものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターのアゴニスト又はアンタゴニストを同定 する方法であって、下記を含む該方法： ａ）哺乳動物指標細胞の集団を、少なくとも１種の試験化合物を含む試験組成 物と接触させ； ｂ）これらの指標細胞の細胞代謝の少なくとも１つのパラメーターを測定し； そして ｃ）Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターのアゴニスト又はアンタゴニストとし て少なくとも１つの試験化合物を同定する。 ２．レセプターをコードする核酸分子をそのレセプターが細胞膜上で発現される ように指標細胞に導入した、請求項１に記載の方法。 ３．試験組成物が試験化合物のライブラリーを含む、請求項２に記載の方法。 ４．試験組成物が、少なくとも１種の公知のレセプターアゴニスト又は少なくと も１種の公知のレセプターアンタゴニストを更に含む、請求項２に記載の方法。 ５．試験組成物が、指標細胞中の少なくとも１種の第２メッセンジャーの代謝を 変える少なくとも１種の薬剤を更に含む、請求項２に記載の方法。 ６．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターの天然のリガンドが未知である、請求項 ２に記載の方法。 ７．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターのアゴニスト又はアンタゴニストを同定 する方法であって、下記を含む該方法： ａ）指標細胞の集団を、少なくとも１種の試験化合物を含む試験組成物と接触 させ； ｂ）これらの指標細胞の生存力又は増殖を測定し；そして ｃ）少なくとも１種の試験化合物をＧ蛋白質とカップルしたレセプターのアゴ ニスト又はアンタゴニストとして同定する。 ８．指標細胞が哺乳動物細胞である、請求項７に記載の方法。 ９．レセプターをコードする核酸分子をそのレセプターが細胞膜上で発現される ように指標細胞に導入した、請求項８に記載の方法。 １０．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターが、Ｇｑ／１１Ｇ蛋白質とカップルす る、請求項９に記載の方法。 １１．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターが、黄体形成ホルモン放出ホルモンレ セプター又はＭ１ムスカリン性レセプターである、請求項１０に記載の方法。 １２．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターが、Ｇ_s又はＧ_iＧ蛋白質とカップルす る、請求項９に記載の方法。 １３．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターが、第１の膜貫通７セグメントレセプ ターの少なくとも１つのリガンド結合ドメイン及び第２の膜貫通７セグメントレ セプターの少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むキメラレセプターであ って、そのキメラレセプターが指標細胞中でＧｑ／１１Ｇ蛋白質とカップルする 、請求項１０に記載の方法。 １４．試験組成物が、試験化合物のライブラリーを含む、請求項９に記載の方法 。 １５．試験組成物が、少なくとも１種の公知のレセプターアゴニスト又は少なく とも１種の公知のレセプターアンタゴニストを更に含む、請求項９に記載の方法 。 １６．試験組成物が、少なくとも１種の公知のレセプターアゴニストを更に含み 、それにより、レセプターアンタゴニストを同定する、請求項９に記載の方法。 １７．試験組成物が、指標細胞中の少なくとも１種の第２メッセンジャーの代謝 を変える少なくとも１種の薬剤を更に含む、請求項９に記載の方法。 １８．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターの天然のリガンドが未知である、請求 項９に記載の方法。 １９．少なくとも１種の試験化合物を、その少なくとも１種の試験化合物の不在 時における指標細胞の生存力又は増殖と比較して、それらの指標細胞に接触させ たときにそれらの指標細胞の生存力又は増殖を減少させる少なくとも１種の試験 化合物の能力に基づいてＧ蛋白質とカップルしたレセプターのアゴニストとして 同定する、請求項７に記載の方法。 ２０．少なくとも１種の試験化合物を、レセプターアゴニストが単独で存在する 場合における指標細胞の生存力又は増殖と比較して、レセプターアゴニストの存 在下で指標細胞と接触させたときにその指標細胞の生存力又は増殖を増大させる その少なくとも１種の試験化合物の能力に基づいてＧ蛋白質とカップルしたレセ プターのアンタゴニストとして同定する、請求項７に記載の方法。 ２１．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターのアゴニスト又はアンタゴニストを同 定する方法であって、該方法は： ａ）指標細胞の集団を、少なくとも１種の試験化合物を含む試験組成物と接触 させ； ｂ）これらの指標細胞の形態を測定し；そして ｃ）少なくとも１種の試験化合物をＧ蛋白質とカップルしたレセプターのアゴ ニスト又はアンタゴニストとして同定する。 ２２．指標細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２１に記載の方法。 ２３．レセプターをコードする核酸分子をそのレセプターが細胞膜上で発現され るように指標細胞に導入した、請求項２２に記載の方法。 ２４．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターが、Ｇｑ／１１Ｇ蛋白質とカップルす る、請求項２３に記載の方法。 ２５．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターが、黄体形成ホルモン放出ホルモンレ セプター又はＭ１ムスカリン性レセプターである、請求項２４に記載の方法。 ２６．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターが、Ｇ_sＧ蛋白質とカップルする、請 求項２３に記載の方法。 ２７．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターが、β２−アドレナリン作動性レセプ ターである、請求項２６に記載の方法。 ２８．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターが、Ｇ_iＧ蛋白質とカップルする、請 求項２３に記載の方法。 ２９．試験組成物が、試験化合物のライブラリーを含む、請求項２３に記載の方 法。 ３０．試験組成物が、少なくとも１種の公知のレセプターアゴニスト又は少なく とも１種の公知のレセプターアンタゴニストを更に含む、請求項２３に記載の 方法。 ３１．試験組成物が、少なくとも１種の公知のレセプターアゴニストを更に含み 、それにより、レセプターアンタゴニストを同定する、請求項３０に記載の方法 。 ３２．試験組成物が、指標細胞中の少なくとも１種の第２メッセンジャーの代謝 を変える少なくとも１種の薬剤を更に含む、請求項２３に記載の方法。 ３３．Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターの天然のリガンドが未知である、請求 項２３に記載の方法。 ３４．細胞膜上で組換えのＧ蛋白質とカップルしたレセプターを発現する細胞を 調製する方法であって、その細胞に、そのレセプターをコードする核酸分子をレ セプターアゴニストによるレセプターの刺激が阻止された培養条件下でそのレセ プターが細胞膜上で発現されるように導入することを含む、上記の方法。 ３５．培養条件が、レセプターアンタゴニストを含む培地での細胞培養を含む、 請求項３４に記載の方法。 ３６．培養条件が、レセプターアゴニストを欠く培地での細胞培養を含む、請求 項３４に記載の方法。 ３７．細胞を、細胞膜上でのレセプターの安定な発現が達成されるまで、レセプ ターアゴニストによるレセプターの刺激が阻止された培養条件下に維持する、請 求項３４に記載の方法。 ３８．レセプターアゴニストによるレセプターの刺激が阻止された培養条件下で 培養培地中で組換えのＧ蛋白質とカップルしたレセプターを発現する細胞の安定 した集団。 ３９．培養培地が、レセプターアンタゴニストを含む、請求項３８に記載の細胞 。 ４０．培養培地が、レセプターアゴニストを欠く、請求項３８に記載の細胞。 ４１．培養培地中の血清が透析したものである、請求項４０に記載の細胞。 ４２．組換えのヒト黄体形成ホルモン放出ホルモンレセプターを発現するチャイ ニーズハムスター卵巣細胞。 ４３．組換えのキメラのＧ蛋白質とカップルしたレセプターを発現するチャイニ ーズハムスター卵巣細胞であって、このキメラのレセプターが、第１の膜貫通７ セグメントレセプターの少なくとも１つのリガンド結合ドメイン及び第２の膜貫 通７セグメントレセプターの少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含み、こ のキメラのレセプターが、細胞内でＧｑ／１１Ｇ蛋白質とカップルする、上記の チャイニーズハムスター卵巣細胞。