CN1644035A - 一种无菌松材线虫的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种无菌松材线虫的培养方法，包括：①培养荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5－1A CCTCC No：M 204065灭活处理从而获得死细胞；②培养黑松愈伤组织；③灭活获得死黑松愈伤组织；④制备无菌松材线虫卵备用；⑤无菌条件下，按比例配制死/活愈伤组织与死细菌与适量的无菌水成不同的培养液；⑥向获得的任一培养液中加入制备好的无菌松材线虫卵，置于温度15－40℃下暗培养4－20d得所需的无菌松材线虫。本发明方法培养的松材线虫其产量和质量都较现有技术更高，同时，该方法便于大规模的工业化生产。
Description
(一)技术领域：
本发明涉及一种无菌松材线虫的培养方法。
(二)背景技术：
松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus(Steiner & Buhrer)Nickle)是松树上的一种毁灭性病害，主要由松墨天牛(Monochamus alternatusHope)传播，可为害黑松(Pinus thunbergii)、赤松(P.densiflora)、湿地松(Pelliottii)、马尾松(P.massoniana)等近40种松树。松材线虫病使得松树植株大量死亡，流行成灾，它已给我国的林业生产造成了严重的威胁。
虽然早在20世纪初就有关于松材线虫病的记载，但直到进入70年代才开始对该病害进行较为深入的研究，并取得了一些成果。然而，对松材线虫引起松树枯萎的机理至今尚无为大多数人所接受的解释，尤其对松材线虫携带的细菌在松材线虫病中的作用更是看法不一。在我国，赵博光教授对松材线虫病的致病机理作了比较系统的研究，提出松材线虫病是由松材线虫和其携带的致病细菌共同侵染引起的复合侵染性病害，而且确定了致病细菌是松树线虫病的主要致萎因素。目前，对松材线虫携带细菌产生的毒素的研究在国内外均有较多报道，但真正关于毒素的分离纯化的研究则相对较少。
植物线虫虽然和昆虫同属动物，但它在侵染、危害和研究方法上更近于真菌、细菌等其它植物病原物，所以习惯上把植物线虫病害的研究包含于植物病理学范围之内。
根据植物病理学的经典法则-柯赫氏法则，要对由病原物引起的植物病害进行研究时，获得病原物的纯培养是整个研究的关键。因此，要对植物线虫病害进行研究，首先就要获得大量的线虫。获得大量足够的松材线虫纯培养，无论是对松材线虫本身生物化学、生理学或是对松材线虫与其携带的致病细菌关系以及其携带的致病细菌的致萎毒素的研究，是至关重要的。
线虫大量培养的方法主要有三种，即单生物培养、多生物培养和纯培养。
目前对松材线虫病进行人工培养的方法多是单异活体培养，即单生物培养，其方法主要有两种，一种是以真菌为食料培养(Mamiya，1975 Behavior ofBursaphelenchus lignicolus in the wood of pine seedlings andpathological responses of pine to nematode infection.Trans.86th.Mty.Jpn.For.Soc.，285-286；清原友也，1970マツ材线虫の侵入と繁殖.81回日林講，255-256)，另一种则利用植物组织培养技术培养松树愈伤组织，然后以松树愈伤组织为食料培养(Tamura H.Mamiya Y.1979 Reproductipn ofBursaphelenchus lignicolus on pine callus.Nematologica.25：149-151)。
引起松材线虫病的松材线虫属于散滑刃属线虫(Bursaphelenchus)，能够以多种真菌为食，易于在多种真菌培养基上培养繁殖(Dozono et al.，1974；Kobayashi et al.，1974，1975；Kondo et al.，1978)。因此，以真菌为食料的单异活体培养法，是培养松材线虫最主要的方法。自从清原友也(清原友也.(1970)マツ材线虫の侵入と繁殖.81回日林講，255-256)开始用丝状真菌培养松材线虫用于接种实验以来，研究用松材线虫基本上都采用PDA平面培养基上生长的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)为食料真菌来培养繁殖。在25℃温度下，约4-5天松材线虫可完成一代(Mamiya Y.(1975)Behavior ofBursaphelenchus lignicolus in the wood of pine seedlings andpathological responses of pine to nematode infection.Trans.86th.Mty.Jpn.For.Soc.，285-286)。关于松材线虫单异活体培养的研究大都以此为基础，进行方法的改进：曹越，沈伯葵(曹越，沈伯葵.(1996)人工培养条件下松材线虫提取物的毒性研究.南京林业大学学报，20(4)：13-16)分别以灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和松梢枯病菌(Sphaeropsis sapinea)为食料真菌，以PDA-真菌、玉米粒-真菌为培养基，培养松材线虫，结果表明无论食料真菌是灰葡萄孢(Botrytis cinerea)还是松梢枯病菌(Sphaeropsissapinea)，玉米粒-真菌培养基都要比常规的平面的PDA-真菌培养基上的线虫产量都要高。Yasuharu Mamiya(Yasuharu Mamiya.(1990)Effects of FattyAcids Added to Media on the Population Growth of Bursaphelenchusxylophilus(Nematoda：Aphelenchoididae).Appl.Ent.Zool.，25(2)：299-309)将油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸加入用于培养松材线虫的真菌培养基中，发现油酸能提高松材线虫的产卵量。曾永三(曾永三.冯志新.(1996)松材线虫的人工培养研究.促恺农业技术学院学报，9(1)：44-49)等以纯的松木屑或松木屑-PDA培养线虫，并对松木屑进行三种不同的处理，即不经消毒、表面消毒、和完全消毒，结果发现线虫在无菌的培养基上线虫完全不能繁殖，在有菌培养基上能繁殖，而且繁殖线虫的效果与真菌的数量成正相关；在用不同的食料真菌培养线虫时，发现长喙壳菌(Ceratocystis sp)、毛壳菌(Chaetomium sp)和镰刀菌(Fusarium sp)的培养效果要明显优于常用的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和盘多毛孢菌(Pestalotia sp)。
目前，关于松材线虫的无异培养的报道并不多。在国外，由Bolla及其同事于1982年提出了一种利用培养无菌松材线虫的方法(Bolla RI，JordanW.(1982b)Cultivation of the pine wilt nematode，Bursaphelenchusxylophilus，in axenic culture media.J.Nematol.，14(3)：377-381)，该方法是用SP/YE补充培养基(SP/YE supplemented medium)和改进的新小杆线虫属培养基(modified Caenorhabditi medium)对松材线虫进行培养。Bolla等发现，线虫种群数量增长一倍所需时间，前者为后者的1/2；线虫所能达到的最大种群数量，前者比后者大1.5-2倍。以此研究结果为基础，曹越(曹越，沈伯葵。(1996)人工培养条件下松材线虫提取物的毒性研究。南京林业大学学报，20(4)：13-16)在对松材线虫进行无异培养时，采用了SP/YE补充培养基，也取得了较好的培养效果。然而无论是Bolla(1982b)或是曹越(1996)的研究都显示，在培养中出现线虫种群达到最大值后开始下降的现象。这与在自然感病的松树死亡前后，也出现类似的松材线虫种群规模开始减小的现象一致(Kondo E，Ishibashi N.(1978)Ultractructural differences betweenthe propagative and dispersal forms in pine wood nematode，Bursaphelenchus lignicolus，with reference to the survival.Appl.Entomol.Zool.，13：1-11)。Bolla(1982出处见前)等用100mM NaOH每天调节培养线虫的SP/YE补充培养基，也未能延长线虫种群增长的阶段。上述培养方法，相对以前的方法而言，取得了良好的结果，但都存在如下的不足之处：1、配方所用材料价格较贵，且不易配齐，2、培养出的无菌松材线虫个体大小和繁殖率较野生松材线虫用相应的真菌或黑松愈伤组织低得多，3、培养中出现线虫种群达到最大值后开始迅速下降的现象。目前尚不了解该现象的原因，因此尚无解决方法。
现有最接近的技术为郭道森(郭道森，丛培江，李丽，赵博光.(2002)松材线虫携带细菌的数量的测定及无菌松材线虫的培养.青岛大学学报，15(4)：29-31)等报道的在黑松愈伤组织上培养无菌松材线虫方法，该方法是利用植物组织培养技术培养松树愈伤组织，然后以愈伤组织来培养线虫。该方法比常用的方法要有效，既克服了食料真菌法操作繁琐、易污染、难以排除食料真菌或消毒剂对实验结果可能产生影响等缺点，又较无异活体培养法所用培养周期短，产量要高。目前在国内培养无菌松材线虫多采用此方法。
该方法的具体步骤是：
1.培养黑松愈伤组织
选取黑松成熟种子，用自来水冲洗干净，剥去种皮，于75％乙醇溶液中浸40s，再在0.1％HgCI2溶液中处理4min，无菌水冲洗5次，剥除胚乳，取出成熟胚，置于愈伤组织诱导培养基上于25℃下黑暗培养。待愈伤组织长出后移至含适量激素的1P2MS固体培养基上继代培养(高蓉，赵博光.防止黑松外质体及其愈伤组织褐变的方法[J].南京林业大学学报，2001，25(5)：75-77.)。
2.松材线虫的无菌处理和培养
经接种试验选出致病力较强的Nt和Nm两个虫株作为供试虫株，其中Nt来自黑松，Nm来自马尾松。培养在灰葡萄孢菌上的松材线虫，采用贝曼漏斗法分离。获得的松材线虫先用3％H2O2处理10min，再用0.5％硫酸链霉素和0.5％硫酸庆大霉素各处理2h。每次处理后均用无菌水换洗3次。在体视显微镜下，用灭过菌的细针挑取经上述处理的线虫20～30条，移至黑松愈伤组织上，置25℃下黑暗培养。将培养出的线虫先用牛肉膏蛋白胨培养基检验，确系无菌后再用黑松愈伤组织继代培养。试验时，用无菌水冲洗出无菌松材线虫，制成16000条/mL的线虫悬液。用灭过菌的微量进样器取线虫悬液25μL(含线虫400条)，滴在培养于三角烧瓶内的鲜重为3g的愈伤组织表面，每一虫株接种30瓶，置25℃下黑暗培养。
该方法的不足之处在于：1、从培养获得的松材线虫的体积、数量及线虫产卵量等生长、繁殖指标方面看，较自然感病的松树中的松材线虫尚有不能令人满意之处。2、该方法仍不便于大规模的工业化生产。
(三)发明内容：
本发明旨在克服现有技术的不足之处，提供一种能大量、快速、方便而成本又低的无菌松材线虫的培养方法。
本发明的技术解决方案如下：
从自然条件下松材线虫携带的细菌中分离选取荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A菌株。
该细菌菌株的生物学特性：
(1)培养性状：菌落形态：B619菌株在10～41℃的NB培养液中均可生长，菌落圆形，淡黄色，半透明，不产生色素，表面湿润、光滑、边缘整齐。以25～35℃生长为好；在pH4～4.5的NB培养液中不生长，在pH5～9范围内均可生长，最适pH7～8。个体形态：细胞杆状，有些细胞内有空泡，大小0.5～0.6×1.0～2.0μm。革兰氏染色阴性反应，运动，生有一根极生鞭毛。无荚膜。
(2)生理生化特征：革兰氏反应阴性，严格好氧生长，在休-利夫森氧化发酵培养基上呈氧化产酸反应。不产生色素。细胞内有聚β-羟基丁酸盐颗粒。接触酶和氧化酶皆阳性。不产生精氨酸双水解酶。水解明胶，不利用硝酸盐厌氧生长，不产卵磷脂酶。不水解淀粉。能利用葡萄糖、木糖、核糖、肌醇和β-丙氨酸生长，但不利用海藻糖和酒石酸盐生长。
该菌株已于2004年9月5日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC No：M 204065。
1、将上述菌株进行培养获得细菌活菌体细胞。
2、将上述获得细菌活菌体细胞进行灭活处理从而获得死细胞，备用。
3、分离、培养松材线虫并制备无菌松材线虫卵，备用。
4、培养黑松愈伤组织，备用。
5、将上述获得黑松愈伤组织进行灭活处理从而获得死黑松愈伤组织，备用。
6、无菌条件下，以步骤2~5获得的各备用材料按下列比例与适量的无菌水配制成不同的培养液：
无菌干燥的死愈伤组织∶死细菌(质量比)为5~100∶1
活愈伤组织∶死细菌(质量比)为100~2000∶1
7、向步骤6获得的任一培养液中加入步骤5中制备好的无菌松材线虫卵，置于温度：15-40℃，暗培养4-20d后，得所需的无菌松材线虫。
以下对上述各步骤做进一步详述：
步骤1中细菌菌体的培养：
可采用通用的NA培养基进行平板培养或斜面培养。培养方法为常用的培养方法。如：称取NA营养琼脂粉32g溶于1000mL蒸馏水中，在电炉上加热煮沸，然后分装于试管中，于121℃、1.05kg/cm2灭菌20min，用平板培养。工业生产时可用NB液体培养基进行培养。培养后用细菌滤膜(膜孔直径约0.5μ)将培养后的培养液过滤。得细菌菌体。
上述培养过程中，培养基的PH值为7.0±0.2、温度28±0.1℃、斜面培养时间为48h，液体培养时间为4天。
步骤2中荧光假单胞菌死细胞的获得：可采用化学方法或冷冻干燥，紫外线照射等物理学方法获得。通过化学方法中的灭菌剂对步骤1所得的细菌菌体进行处理，或将步骤1所得的细菌菌体(菌液)在无菌条件下，通过低温冷冻、干燥，得无菌干燥的死细菌，或将步骤1所得的细菌菌体(菌液)置于紫外线下照射从而获得死细菌。如：采用化学方法中的三氯甲烷法，具体做法如下：
a.将培养得到的菌体细胞置于试管或烧瓶中，用灭过菌的脱脂棉浸适量三氯甲烷(浸透但不滴下)塞入试管或烧瓶口，后塞上棉塞；置于无菌室内约2-4h；
b.2h后，用无菌镊子取出浸有三氯甲烷脱脂棉，将试管口或烧瓶口敞开，在无菌室内放置2-4h，待试管中的三氯甲烷挥发尽后，用接种环取1环菌苔，接入已制备好的NA斜面培养基上，置于28℃的恒温培养箱中培养48h；
c.48h后观察上述NA斜面培养基上是否有细菌生长，若没有，则表明细菌已被三氯甲烷杀死，死细菌可备用；否则重新灭菌。
采用上述化学方法中的三氯甲烷法是便于工业化生产的最佳方法之一。该方法简单、有效。
步骤3中无菌松材线虫卵的制备：可采用已知的方法培养松材线虫，待其产卵，采用升汞、抗菌素等杀菌剂分离获得无菌卵。采用H2O2是一个优选的方法。实验证明，H2O2相对于升汞、抗菌素等不仅杀菌效果好、且由于卵与线虫对H2O2的抗性差别较大，所以使用高浓度的H2O2可以完全杀灭细菌而不影响卵的孵化率。其具体做法如下：
a.分离松材线虫：将在灰葡萄孢(Botryis cinerea)上培养的松材线虫用贝曼漏斗法分离。把分离到的松材线虫离心，鉴定，备用；
b.将上述离心，鉴定后的松材线虫加在事先制备好的2％的平板琼脂培养基上，用封口膜封好培养皿，置入27℃的恒温培养箱中培养6-24h；
c.在培养期间，观察松材线虫的产卵情况；当线虫产卵量达到实验所需要求时，在无菌条件下，用灭过菌的吸管吸适量无菌水将琼脂培养基上的松材线虫及其中的卵全部洗到灭过菌的离心管中，滴入30％的H2O2(与卵悬液的体积比为1∶1)，在15℃下静置10min，在显微镜下观察线虫的死亡情况；
d.待线虫大部分死亡，用无菌水冲洗3-5遍，每次加无菌水后，摇匀后放在离心机上离心3-4min，待冲净离心管中双氧水后，用无菌的200目不锈钢过滤筛过滤，重复过滤4-6次，直至将大部分线虫过滤掉为止；
e.用事先制备好的NA斜面培养基检查线虫卵有无细菌；如果出现细菌，则放弃本次实验而重新进行。
步骤4中黑松愈伤组织的培养：可采用已知的培养方法培养黑松愈伤组织。如下列方法：
a.培养基的配制
采用1/2MS培养基为基本培养基，附加KT 4.0mg/L，BA 4.0mg/L，蔗糖30g/L，用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH调节pH值为5.86，再加入琼脂粉6.5g/L，加热溶解后分装于100mL的三角瓶中，于121℃，1.05kg/cm2灭菌15min，得到黑松愈伤组织诱导的培养基。
b.采用1/2MS培养基为基本培养基，附加NAA 0.5mg/L，IBA 0.1mg/L，GA3 1.0mg/L，2，4-D 1.0mg/L，LH 100mg/L，蔗糖30g/L，用1mol/L的HCl和1mol/LNaOH的调节pH值为5.86，再加入琼脂粉6.5g/L，加热溶解后分装于100mL的三角瓶中，于121℃，1.05kg/cm2灭菌15min，得到黑松愈伤组织继代培养用的培养基。若调节pH值后不添加琼脂粉，分装灭菌后得到黑松单细胞振荡培养用的液体培养基。
c.黑松愈伤组织的诱导
将黑松种子分别装在50mL的小烧杯中，加入少量洗洁精，用纱布封紧杯口，在流水下冲洗干净。去壳后以无菌水冲洗3次，75％的乙醇溶液表面消毒3次，每次40s，再用无菌水冲洗3次，之后用0.1％升汞溶液处理4min，无菌水冲洗5次。在超净工作台上，用灭过菌的镊子在灭过菌的培养皿中剥除胚乳，取出成熟胚，将其接入愈伤组织诱导培养基，每瓶接4-6个，置于27℃培养箱内黑暗培养。经过10d左右，将生长良好，即未被污染和未发生褐变的个体转移到继代培养基中保持和增殖。
d.黑松愈伤组织的继代培养
在无菌操作室中，将愈伤组织切成黄豆大小的组织块，接入继代培养基上，每个三角瓶中接入3-4块，置于27±2℃恒温箱中暗培养，每隔20-30d继代培养一次。
步骤5中死的黑松愈伤组织的获得：可采用化学方法或冷冻干燥，紫外线照射等物理学方法获得。通过化学方法中的灭活剂如溴乙烷对步骤4中获得的黑松愈伤组织进行处理，也可将步骤4所得的黑松愈伤组织在无菌条件下，通过低温冷冻、干燥，得无菌干燥的死黑松愈伤组织，或将其置于紫外线下照射从而获得。低温冷冻、干燥法是便于工业化生产的最佳方法之一。该方法简单、所获得的黑松愈伤组织便于使用、保存、运输。具体做法如下：
将以上步骤得到新鲜的黑松愈伤组织，在无菌条件下，置于-40℃下12h低温冷冻干燥，取出后置室温下解冻，进行冷冻干燥，得无菌干燥的愈伤组织。
步骤6中培养液的制备：无菌条件下，用获得的各备用材料按比例混合并加入到适量的无菌水中配制成不同的培养液。
该步骤中，优选配制比例为：
死愈伤组织∶死细菌(质量比)为20~75∶1
活愈伤组织∶死细菌(质量比)为400~1500∶1
以该比例配制而成的培养液较符合松材线虫的营养需要，因而松材线虫的生长发育较好。
该步骤中，最佳配制比例为：
死愈伤组织∶死细菌(质量比)为40~60∶1
活愈伤组织∶死细菌(质量比)为800~1200∶1
以该比例配制而成的培养液更为符合松材线虫的营养需要，因而松材线虫的生长发育最好。
步骤7中松材线虫的培养：向上述任一培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵，置于15-40℃下，暗培养4-20d后，得所需的健康无菌松材线虫。该步骤中，较佳培养条件为：温度为23-31℃，暗培养，培养时间4-10d。该培养条件较适宜于松材线虫的生长发育。因而每代松材线虫的培养所需时间也较短。该步骤中，最佳培养温度为25℃-28℃，暗培养，培养时间4-5d。该培养条件最适宜于松材线虫的生长发育。因而每代松材线虫的培养所需时间也最短。
本发明采用上述技术方案培养无菌松材线虫比现有的方法要有效，个体与野生松材线虫在带菌情况下培养的个体大小相同或稍大，其繁殖率也较高，因而产量和质量都较现有技术更高。
采用由死愈伤组织与死细菌、无菌水配制培养液培养松材线虫的方法是适合于大规模的工业化生产的最佳方法，研究表明，该方法相对于用步骤6中其它培养液能明显促进松材线虫的生长发育。同时，该方法无论从死愈伤组织、死细菌的保存还是从它们的使用、运输而言，都有利于大规模的工业化生产。
本发明的优越性在方便性上也有充分的体现，众所周知，无论愈伤组织、细菌的培养还是保存既需要相当的条件又需要相当的技术和时间。要培养出无菌松材线虫，都必须做这些大量的前期工作，非常复杂。本发明通过工业化生产出得无菌干燥的死愈伤组织与死细菌，保存非常方便，根本无需考虑愈伤组织是否发生褐变等问题。使用也非常方便，随时需要培养松材线虫，随时按比例配制培养液，随时培养。
以下通过下列对比实验显现本发明在培养效果上的优点：
对比实验1：荧光假单胞菌GcM5-1A对松材线虫产卵量的影响
(1)以上述方法依次制备无菌松材线虫卵、死荧光假单胞菌、配制NA斜面培养基、荧光假单胞菌菌种活化、死荧光假单胞菌的制备，并按下列方法获得细菌悬液：
a.无菌条件下，用接种环挑取活的荧光假单胞菌GcM5-1A 15环(内径约为1mm)，悬浮于30ml无菌水中，摇匀，备用。
b.无菌条件下，用上述同一接种环(经灼烧后)挑取死的荧光假单胞菌GcM5-1A 15环，悬浮于30ml无菌水中，摇匀，备用。
(2)准备40个无菌小培养皿(r＝1cm，h＝1cm)，8个无菌大培养皿(r＝5cm，h＝1.5cm)，将每5个小培养皿放入1个大培养皿中，然后分成三组，其中两组各有3个大培养皿，分别用记号笔标记为L组(living bacteria)和D组(deadbacteria)；剩下一组有2个大培养皿，标记为C组(control)；
(3)用无菌的自制毛细吸管向每个小培养皿中加入2个已制备好的无菌松材线虫卵；
(4)然后向L组的小培养皿中各加入1.5ml的活荧光假单胞菌GcM5-1A悬液；向D组的小培养皿中各加入1.5ml的死荧光假单胞菌GcM5-1A悬液；C组中小培养皿各加入1.5ml无菌水；
(5)在无菌室内完成上述步骤后，用封口膜将所有大培养皿的口封好，然后放入27℃的恒温箱中培养；
(6)5d后，在无菌室内观察各组内小培养皿的情况，连续观察5d，记录各天观察到的小线虫数，并将已统计的小线虫用毛细吸管挑出；用统计的线虫总量作为观察期内的线虫繁殖量，进行处理与对照间的显著性检验(由SPSS11.5分析)。
连续观察5d后，记录各组的小线虫总数，作为观察期间内线虫的繁殖量。对结果进行统计分析后，结果如下：
表1荧光假单胞菌GcM5-1A对松材线虫产卵量的影响
处理 N(线虫 各处理线虫产卵量平
对数) 均信±标准差(个)
无菌水 3 8.67±2.08a
活荧光假单胞菌 5 34.20±5.97b
死荧光假单胞菌 5 35.40±81b
注：数字右上角的字母为Duncan’s多重比较检验结果，字母不同表示两者之间差异达到显著水平。(α＝0.05)(下同)
从表1可以看出，加入死荧光假单胞菌GcM5-1A培养的松材线虫的产卵量平均值最大，各观察组内松材线虫产卵量的差异不大；加入活荧光假单胞菌GcM5-1A培养的松材线虫的产卵量平均值比死荧光假单胞菌GcM5-1A培养的松材线虫的产卵量平均值稍小，但各观察组内松材线虫产卵量的差异较大；用无菌水培养的松材线虫产卵量平均值较前两者都小。
由表1显著性检验结果可知：用经三氯甲烷处理后的死荧光假单胞菌GcM5-1A与活荧光假单胞菌GcM5-1A分别培养的松材线虫的产卵量都与用无菌水培养的松材线虫产卵量有显著差异，说明两者都对松材线虫的产卵量有显著的促进作用；但分别用两者培养的松材线虫的产卵量之间没有显著差异，说明荧光假单胞菌GcM5-1A是否死亡对松材线虫的产卵量没有显著影响。
对比实验2：黑松愈伤组织和荧光假单胞菌几种不同培养介质对松材线虫产卵量的影响
以前述方法依次进行制备无菌松材线虫卵、死荧光假单胞菌、配制NA斜面培养基、荧光假单胞菌菌种活化、死荧光假单胞菌的制备、黑松愈伤组织的制备并获得细菌悬液，然后，
a.准备90个无菌小培养皿(r＝1cm，h＝1cm)，18个无菌大培养皿(r＝5cm，h＝1.5cm)，将每5个小培养皿放入1个大培养皿中，然后分成七组，其中三组各有4个大培养皿，分别用记号笔标记为DD组(dead calli+dead bateria)、LL组(living calli+living bacteria)、LC组(living calli)、LCDB组(livingcalli+dead bacteria)；剩下三组各有2个大培养皿，分别标记为DB组(deadbateria)、DC组(dead calli)和C组(control)；
b.用无菌吸管向每个小培养皿中滴入1.0ml的黑松愈伤组织液体继代培养基；
c.用无菌自制毛细吸管向每个小培养皿中(LC组的15个小培养皿除外)加入2个已制备好的无菌松材线虫卵；
d.用无菌自制毛细吸管向LC组的每个小培养皿中加入2个未经无菌处理的松材线虫卵；后又依次各加入0.01g活黑松愈伤组织，1.5ml无菌水；
e.向LL组的小培养皿中各加入0.01g再向小培养皿中各加入1.5ml的活荧光假单胞菌GcM5-1A悬液；向DD组的小培养皿中各加入0.01g死黑松愈伤组织，后又各加入1.5ml的死荧光假单胞菌GcM5-1A悬液；向LCDB组的小培养皿中各加入0.01g的未经冷冻的活愈伤组织，后又各加入1.5ml的死荧光假单胞菌GcM5-1A悬液；向DC组的小培养皿中各加入0.01g死黑松愈伤组织，1.5ml无菌水；向DB组中各加入1.5ml的死荧光假单胞菌GcM5-1A悬液；C组中各加入1.5ml无菌水；
f.在无菌室内完成上述步骤后，用封口膜将所有大培养皿的口封好，然后放入27℃的恒温箱中培养；
g.5-7d后，在无菌室内观察各组内小培养皿的情况，连续观察5d，记录各天观察到的小线虫数，并将已统计的小线虫用毛细吸管挑出；用统计的线虫总量作为观察期内的线虫繁殖量，进行处理与对照间的显著性检验(由SPSS11.5分析)。
连续观察5d后，记录各组的小线虫总数，作为观察期间内线虫的繁殖量。对结果进行统计分析后，结果如下：
表2黑松愈伤组织和荧光假单胞菌的几种不同培养介质对松材线虫产卵量的影响
处理 N(线 各处理线虫产卵量平
虫对数) 均值±标准差(个)
无菌水 4 9.00±2.94a
死愈伤组织 5 35.00±6.82b
死细菌 4 42.00±4.97bc
死细菌加死愈伤组织 6 48.00±13.6c
死细菌加活愈伤组织 6 48.60±5.18bc
活愈伤组织(有菌卵) 7 49.71±11.38c
活细菌加活愈伤组织 6 54.83±9.20c
表2可以看出，以活黑松愈伤组织加活荧光假单胞菌培养的松材线虫产卵量最多，然后依次是活黑松愈伤组织培养的有菌卵、死细菌加活愈伤组织、死荧光假单胞菌加死黑松愈伤组织、死荧光假单胞菌、死黑松愈伤组织，无菌水培养的产卵量最少。其中用死荧光假单胞菌加死黑松愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫产卵量在各观察组内的差异最大，对照无菌水培养的松材线虫产卵量在各观察组内的差异最小，其它培养介质的松材丝虫产卵量在各观察组内都有一定的差异。
由表2的显著性检验结果，可以看出分别用活黑松愈伤组织加活荧光假单胞菌与死荧光假单胞菌加死黑松愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的无菌松材线虫的产卵量之间没有显著差异，同样三者都与用活黑松愈伤组织培养的有菌松材线虫的产卵量之间没有差异，但上述四种培养介质均与用其它介质培养的无菌松材线虫的产卵量之间具有显著性差异，说明这四种培养介质能明显地促进松材线虫的产卵。用死黑松愈伤组织培养的无菌松材线虫的产卵量与前三种培养介质之间有差异，但差异不显著；用死黑松愈伤组织培养的无菌松材线虫的产卵量和用死细菌培养的无菌松材线虫的产卵量之间没有明显差异，但相对于无菌水也有显著促进松材线虫产卵的作用。
对比实验3：黑松愈伤组织和荧光假单胞菌几种不同培养介质对松材线虫生长发育的影响
以前述方法依次进行制备无菌松材线虫卵、死荧光假单胞菌、配制NA斜面培养基、荧光假单胞菌菌种活化、死荧光假单胞菌的制备、黑松愈伤组织的制备并获得细菌悬液，然后，
a.准备25个无菌小培养皿(r＝1cm，h＝1cm)，5个无菌大培养皿(r＝5cm，h＝1.5cm)，将每5个小培养皿放入1个大培养皿中，然后分成五组，分别用记号笔标记为DD组(dead calli+dead bateria)、LCDB组(living calli+deadbacteria)、LB组(living bacteria)、LC组(living calli)DB组(deadbateria)；
b.用无菌吸管向LC组每个小培养皿中滴入1.0ml的黑松愈伤组织液体继代培养基；
c.用毛细吸管向每个小培养皿中加入20个上述已制备好的无菌松材线虫卵；后又各加入0.01g活黑松愈伤组织，1.5ml无菌水；
d.向LC组的小培养皿中各加入0.01g活黑松愈伤组织，向DB组的小培养皿中各加入1.5ml的活荧光假单胞菌GcM5-1A悬液；向DD组的小培养皿中各加入0.01g死黑松愈伤组织，后又各加入1.5ml的死荧光假单胞菌GcM5-1A悬液；向LCDB组的小培养皿中各加入0.01g活黑松愈伤组织，后又各加入1.5ml的死荧光假单胞菌GcM5-1A悬液；向DB组中各加入1.5ml的死荧光假单胞菌GcM5-1A悬液；
e.在无菌室内完成上述步骤后，用封口膜将所有大培养皿的口封好，然后放入27℃的恒温箱中培养；
f.5-7d后，在无菌室内观察各组内小培养皿的情况，从各组中挑出第一代雌雄成虫各20条，用显微目镜测微尺测量各代雌雄成虫的体长，直径；然后用毛细吸管另从各组的小培养皿中吸出第一代成虫繁殖的小线虫20条放入按a-e步骤准备好的下一批培养皿中，进行培养；按上述同样的步骤与方法观察测量第二代雌雄成虫各20条，根据体长、体直径计算两代雌雄成虫的体积；公式为2П×(d/2)2×(1/2)/3，其中d为线虫的体直径，l为线虫的体长。将测得的结果作统计分析，进行各处理间的显著性检验(由SPSS11.5分析)。
1、第一代雌雄成虫的观察测量结果
(1)不同培养介质对松材线虫雌成虫的体长、体直径及体积的影响
表3不同培养介质对松材线虫雌成虫体长的影响
培养介质 N 体长平均值±标准差(mm)
活愈伤组织 20 0.729800±0.0558047a
活细菌 20 0.855200±0.0273026b
死细菌 20 0.858700±0.0218080b
死细菌加死愈伤组织 20 0.880450±0.0195542c
死细菌加活愈伤组织 20 0.890530±0.0206628c
从表3可以看出，用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雌虫体长的平均值是最大的，然后依次是死细菌、活细菌；而且这四种培养介质培养的松材线虫雌虫体长在各自组内的个体差异都不大。用活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体长平均值最小，但在其组内体长个体差异较大。由显著性检验结果可知：死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体长与其它三种介质培养的松材线虫雌虫体长均有明显差异；死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织两种介质培养的松材线虫雌虫体长之间没有明显差异；活细菌与死细菌两种介质培养的松材线虫雌虫体长之间没有明显差异，但两者均与用活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体长有明显差异。以上结果说明用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雌虫体长的增长。
表4不同培养介质对松材线虫雌成虫体直径的影响
培养介质 N 体直径平均值±标准差(mm)
活愈伤组织 20 0.028130±0.0019445a
活细菌 20 0.030860±0.0044518b
死细菌 20 0.032670±0.0025695b
死细菌加死愈伤组织 20 0.039510±0.0040150c
死细菌加活愈伤组织 20 0.040320±0.0041623c
从表4可以看出，用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雌虫体直径的平均值最大，但其个体间体直径差异较大；然后依次是死细菌、活细菌，其中加活细菌培养的雌线虫体直径个体差异较加死细菌培养的雌虫体直径个体差异大；用活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体直径平均值最小，其组内体直径个体差异也最小。
由表4显著性检验结果可知：死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体直径与其它三种介质培养的松材线虫雌虫体直径均有明显差异；死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织两者间明显差异；无活细菌与死细菌两种介质培养的松材线虫雌虫体直径之间没有明显差异，但两者均与用活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体直径有明显差异。以上结果说明用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雌虫体直径的增加。
表5不同培养介质对雌松材线虫成虫体积的影响
培养介质 N 体积平均值±标准差(mm3)
活愈伤组织 20 0.00015322±0.000096122a
活细菌 20 0.00021915±0.000073201b
死细菌 20 0.00024207±0.000040577b
死细菌加死愈伤组织 20 0.00036475±0.000075644c
死细菌加活愈伤组织 20 0.00036589±0.000078332c
由表5可知：用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雌虫体积的平均值最大，然后依次是死细菌、活细菌、活愈伤组织。就组内个体体积差异而言，死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织与活细菌三种介质较大，死细菌与活愈伤组织两种培养介质较小。从表5显著性检验结果可以看出：死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体积与其它三种介质培养的松材线虫雌虫体积均有明显差异；活细菌与死细菌两种介质培养的松材线虫雌虫体积之间没有明显差异，但两者均与用活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体积有明显差异。以上结果说明用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雌虫体积的增大。
综合以上结果可以看出：用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雌虫的体长、体直径和体积的平均值都是最大的，而且与其它三种介质培养的松材线虫雌虫体长、体直径和体积均有明显差异，说明用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雌虫的生长发育。
(2)不同培养介质对松材线虫雄成虫的体长、体直径及体积的影响
表6不同培养介质对松材线虫雄成虫体长的影响
培养介质 N 体长平均值±标准差(mm)
活愈伤组织 20 0.625300±0.0349060a
活细菌 20 0.654700±0.0286321b
死细菌 20 0.670450±0.0340239bc
死细菌加死愈伤组织 20 0.685100±0.0218051c
死细菌加活愈伤组织 20 0.689000±0.0221331c
从表6可以看出：各种不同培养介质培养的松材线虫雄虫在各组内个体间体长上的差异都不是很大，其中用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体长组内差异是最小的。用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的雄松材线虫的体长的平均值最大，用死细菌、活细菌培养的松材线虫雄虫体长平均值较大，用活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体长平均值最小。显著性检验结果表明：用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体长与用活细菌、活愈伤组织两种介质培养的松材线虫雄虫体长均有明显差异，但与用死细菌培养的松材线雄虫体长差异不明显。用活细菌、死细菌两种介质培养的松材线虫雄虫体长之间没有明显差异，但两者与用活愈伤组织培养的松材线虫雄虫体长之间差异显著。以上结果说明用死细菌、死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织三种培养介质较用活愈伤组织、活细菌培养更能促进松材线虫雄虫体长的增长。
表7不同培养介质对松材线虫雄成虫体直径的影响
培养介质 N 体直径平均值±标准差
活愈伤组织 20 0.024325±0.0019404a
活细菌 20 0.026795±0.0028153b
死细菌 20 0.028970±0.0021428c
死细菌加死愈伤组织 20 0.030735±0.0028077d
死细菌加活愈伤组织 20 0.031864±0.0029002d
由表7可知：各种不同培养介质培养的第一代松材线虫雄虫在各组内个体间体直径的差异不大，其中用活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体直径组内差异是最小的。可以看出，用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的雄松材线虫的体直径的平均值是最大的，用死细菌、活细菌培养的松材线虫雄虫体直径平均值较大，用活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体长平均值最小。从显著性检验结果看出：用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体直径与其它三种介质培养的松材线虫雄虫体直径均有明显差异。以上结果说明用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养松材线虫较其它三种更能促进松材线虫雄虫体直径的增宽。
表8不同培养介质对松材线虫雄成虫体积的影响
培养介质 N 体积平均值±标准差(mm3)
活愈伤组织 20 0.00009823±0.000022354a
活细菌 20 0.00012536±0.000032230b
死细菌 20 0.00014912±0.000030663c
死细菌加死愈伤组织 20 0.00017151±0.000037063d
死细菌加活愈伤组织 20 0.00017842±0.000032419d
表8可以看出，各种不同培养介质培养的第一代松材线虫雄虫在各组内个体间体积的差异均不大。由表8可知：用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体积的平均值是最大的，然后依次是死细菌、活细菌、活愈伤组织。显著性检验结果表明：用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体积与其它三种介质培养的松材线虫雄虫体积均有明显差异；说明用死细菌加死愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雄虫的体积的增大。
综合以上体长、体直径和体积结果可以看出：用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体长、体直径和体积的平均值都是最大的，而且与其它三种介质培养的松材线虫雄虫体长、体直径和体积均有明显差异，说明用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雄虫的生长发育。
2、第二代雌雄成虫的观察测量结果
(1)不同培养介质对松材线虫雌成虫的体长、体直径及体积的影响
表9不同培养介质对松材线虫雌成虫体长的影响
培养介质 N 体长平均值±标准差(mm)
活愈伤组织 20 0.727800±0.0390541a
活细菌 20 0.859500±0.0253782b
死细菌 20 0.866900±0.0208071b
死细菌加死愈伤组织 20 0.887900±0.0149628c
死细菌加活愈伤组织 20 0.888300±0.0168961c
由上表可知：用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雌虫体长的平均值最大，然后依次是死细菌、活细菌，而且这三种培养介质培养的松材线虫雌虫体长在各自组内的个体差异都不大；用活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体长平均值最小，但在其组内体长个体差异较大。从表9的显著性检验结果可以看出：死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体长与其它三种介质培养的松材线虫雌虫体长均有明显差异；活细菌与死细菌两种介质培养的松材线虫雌虫体长之间没有明显差异，但两者均与用活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体长有明显差异。以上结果说明用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雌虫体长的增长。
表10不同培养介质对松材线虫雌成虫体直径的影响
培养介质 N 体直径平均值±标准差(mm)
活愈伤组织 20 0.028255±0.0022004a
活细菌 20 0.033005±0.0053815b
死细菌 20 0.034675±0.0021396b
死细菌加死愈伤组织 20 0.040115±0.00038162c
死细菌加活愈伤组织 20 0.041232±0.00039002c
从表10可以看出，用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雌虫体直径的平均值最大，但其个体间体直径差异较大；然后依次是死细菌、活细菌、活愈伤组织，其中加活细菌培养的雌线虫体直径个体差异较加死细菌培养的雌虫体直径个体差异大；活愈伤组织组内体直径个体差异也最小。由显著性检验结果可知：死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体直径与其它三种介质培养的松材线虫雌虫体直径均有明显差异；活细菌与死细菌两种介质培养的松材线虫雌虫体直径之间没有明显差异，但两者均与用活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体直径有明显差异。以上结果说明用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雌虫体直径的增长。
表11不同培养介质对松材线虫雌成虫体积的影响
培养介质 N 体积平均值±标准差(mm3)
活愈伤组织 20 0.00015407±0.000031141a
活细菌 20 0.00025349±0.000090026b
死细菌 20 0.00027461±0.000040206b
死细菌加死愈伤组织 20 0.00037834±0.000071672c
死细菌加活愈伤组织 20 0.00038258±0.000073289c
从表11可以看出：用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雌虫体积的平均值最大，然后依次是死细菌、活细菌、活愈伤组织。就组内个体体积差异而言，死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织与活细菌三种介质较大，死细菌与活愈伤组织两种培养介质较小。由显著性检验结果可知：死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体积与其它三种介质培养的松材线虫雌虫体积均有明显差异；活细菌与死细菌两种介质培养的松材线虫雌虫体积之间没有明显差异，但两者均与用活愈伤组织培养的松材线虫雌虫体积有明显差异。以上结果说明用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雌虫体积的增大。
综合以上体长、体直径和体积的结果可以看出：用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雌虫的体长、体直径和体积的平均值都是最大的，而且与其它三种介质培养的松材线虫雌虫体长、体直径和体积均有明显差异，说明用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雌虫的生长发育。
表12不同培养介质对松材线虫雄成虫体长的影响
培养介质 N 体长平均值±标准差(mm)
活愈伤组织 20 0.631300±0.0380264a
活细菌 20 0.656300±0.0282398b
死细菌 20 0.676500±0.0327197c
死细菌加死愈伤组织 20 0.686650±0.0235468c
死细菌加活愈伤组织 20 0.693385±0.0233442c
从表12可以看出：各种不同培养介质培养的松材线虫雄虫在各组内个体间体长上的差异都不是很大，其中用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体长组内差异是最小的；其中用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的雄松材线虫的体长的平均值是最大的，然后依次是死细菌、活细菌、活愈伤组织。由显著性检验结果可见：用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体长与用死细菌培养的松材线虫雄虫体长之间没有明显差异，但前三者均与用活细菌、活愈伤组织两种介质培养的松材线雄虫体长之间有明显差异。用活细菌培养的松材线虫雄虫体长与用活愈伤组织培养的松材线虫雄虫体长之间差异也显著。以上结果说明用死细菌、死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织三种培养介质较用活愈伤组织、活细菌培养更能促进松材线虫雄虫体长的增长。
表13不同培养介质对松材线虫雄成虫体直径的影响
培养介质 N 体直径平均值±标准差
活愈伤组织 20 0.024525±0.0027493a
活细菌 20 0.026895±0.0028153b
死细菌 20 0.028975±0.0021584c
死细菌加死愈伤组织 20 0.031010±0.0027493d
死细菌加活愈伤组织 20 0.033221±0.0028474d
由表13可知：各种不同培养介质培养的第二代松材线虫雄虫在各组内个体间体直径的差异不大，其中用活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体直径组内差异最小。用死细菌加死愈伤组织培养的雄松材线虫的体直径的平均值最大，然后依次是死细菌、活细菌，用活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体直径平均值最小。从显著性检验结果看出：用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体直径与其它三种介质培养的松材线虫雄虫体直径均有明显差异。以上结果说明用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养松材线虫较其它三种培养介质更能促进松材线虫雄虫体直径的增长。
表14不同培养介质对松材线虫雄成虫体积的影响
培养介质 N 体积平均值±标准差(mm3)
活愈伤组织 20 0.00010222±0.000032505a
活细菌 20 0.00012657±0.000032311b
死细菌 20 0.00015041±0.000030316c
死细菌加死愈伤组织 20 0.00017493±0.000037205d
死细菌加活愈伤组织 20 0.00018987±0.000038026d
由表14可知：用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体积的平均值最大，然后依次是用死细菌和用活细菌培养的松材线虫雄虫用活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体积的平均值最小。从显著性检验结果可以看出：用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体积与其它三种介质培养的松材线虫雄虫体积均有明显差异；说明用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雄虫体积的增大。
综合以上体长、体直径和体积的结果可以看出：用死细菌加活愈伤组织、死细菌加死愈伤组织培养的松材线虫雄虫的体长、体直径和体积的平均值都是最大的，而且与其它三种介质培养的松材线虫雄虫体长、体直径和体积均有明显差异，说明用死细菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养松材线虫较其它三种介质更能促进松材线虫雄虫的生长发育。
综合以上各实验结果可见，
从黑松愈伤组织对松材线虫产卵量的影响的研究结果来看，无论是经冷冻处理失活的黑松愈伤组织或活黑松愈伤组织，与无菌水相比，两者都能明显地促进松材线虫的产卵；但用两者培养的松材线虫的产卵量之间没有明显差异，说明黑松愈伤组织是否失活对松材线虫的产卵量没有显著影响。
用经三氯甲烷处理后的死荧光假单胞菌GcM5-1A与活荧光假单胞菌GcM5-1A分别培养的松材线虫的产卵量都与用无菌水培养的松材线虫产卵量有显著差异，说明两者都对松材线虫的产卵量有显著的促进作用；但分别用两者培养的松材线虫的产卵量之间没有显著差异，说明荧光假单胞菌GcM5-1A是否死亡对松材线虫的产卵量没有显著影响。
从分别单独用死黑松愈伤组织、单独用死荧光假单胞菌、死荧光假单胞菌加死愈伤组织、活愈伤组织加活荧光假单胞菌、死愈伤组织加活荧光假单胞菌以及活愈伤组织(培养有菌松材线虫卵)等几种不同介质培养的松材线虫的产卵量情况可以看出：和无菌水相比较，以上所有的培养介质都能明显促进松材线虫的产卵；其中用死荧光假单胞菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织、活愈伤组织加活荧光假单胞菌以及活愈伤组织(加有菌卵)四种培养介质培养的松材线虫的产卵量之间没有明显差异，而四者培养松材线虫的产卵量都较单独用死荧光假单胞菌培养松材线虫的产卵量要大，不过差异不明显，但四者培养松材线虫的产卵量均明显大于单独用死黑松愈伤组织培养的松材线虫产卵量。以上结果表明，在松材虫的产卵过程中，荧光假单胞菌的作用较黑松愈伤组织的作用大；用死荧光假单胞菌加死黑松愈伤组织可能比单独用黑松愈伤组织培养无菌松材线虫更能促进无菌松材线虫的产卵。
对分别用活黑松愈伤组织、死荧光假单胞菌、活荧光假单胞菌以及死荧光假单胞菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织五种介质培养的第一代和第二代的松材线虫雌雄成虫体长、体直径及体积进行观察测定，结果表明，无论是第一代还是第二代，用死荧光假单胞菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养的松材线虫雌雄成虫的体长、体直径和体积都明显大于用其它三种介质培养的松材线虫雌雄成虫的体长、体直径和体积，说明与其它三种介质相比，死荧光假单胞菌加死愈伤组织、死细菌加活愈伤组织能明显促进松材线虫的生长发育。
从实验的研究结果可以看出，用死荧光假单胞菌加死黑松愈伤组织、死细菌加活愈伤组织培养无菌松材线虫较单独用活黑松愈伤组织培养无菌松材线虫更能促进松材线虫的产卵量和其生长发育，是一种比单独用活黑松愈伤组织更好的培养无菌松材线虫的方法。该方法比单独用黑松愈伤组织培养无菌松材线虫在线虫产卵量及生长繁殖方面更好。
(四)具体实施方式：
以下通过具体的实施例对本发明作进一步描述
实施例1
1、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A菌株的培养及处理：(1)NA斜面培养基的制备：称32g营养琼脂粉(NA)溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，分装于试管中，后在121℃，1.05kg/cm2的灭菌锅中灭菌15min，倒斜面，备用。(2)菌种活化：将在4℃冰箱中保存的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A菌株，无菌条件下接到斜面培养基上，放在27℃恒温培养箱中培养2d，后放入4℃冰箱中冷藏保存，备用。(3)细菌的培养：将在4℃冰箱中保存的荧光假单胞菌GcM5-1A菌株，在无菌操作室中用接种环取1环，接入NA斜面培养基50ml中，置于30℃恒温振荡器(128r/min)上培养48h。(4)死荧光假单胞菌的制备
a.在无菌室内，用灭过菌的脱脂棉浸适量三氯甲烷(浸透但不滴下)塞入试管口，后塞上棉塞；置于无菌室内约2h；
b.2h后，用无菌镊子取出浸有三氯甲烷脱脂棉，将试管口敞开，在无菌室内放置2-4h，待试管中的三氯甲烷挥发尽后，用接种环取1环菌苔，接入已制备好的NA斜面培养基上，置于28℃的恒温培养箱中培养48h；
c.48h后观察上述NA斜面培养基上是否有细菌生长，若没有，则表明细
菌已被三氯甲烷杀死，死细菌可备用；否则放弃本次实验并重新进行。
2、培养黑松愈伤组织
(1)培养基的配制
采用1/2MS培养基为基本培养基，附加KT 4.0mg/L，BA 4.0mg/L，蔗糖30g/L，用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH调节pH值为5.86，再加入琼脂粉6.5g/L，加热溶解后分装于100mL的三角瓶中，于121℃，1.05kg/cm2灭菌15min，得到黑松愈伤组织诱导的培养基。
采用1/2MS培养基为基本培养基，附加NAA 0.5mg/L，IBA 0.1mg/L，GA31.0mg/L，2，4-D 1.0mg/L，LH 100mg/L，蔗糖30g/L，用1mol/L的HCl和1mol/LNaOH的调节pH值为5.86，再加入琼脂粉6.5g/L，加热溶解后分装于100mL的三角瓶中，于121℃，1.05kg/cm2灭菌15min，得到黑松愈伤组织继代培养用的培养基。若调节pH值后不添加琼脂粉，分装灭菌后得到黑松单细胞振荡培养用的液体培养基。
(2)黑松愈伤组织的诱导
将黑松种子分别装在50mL的小烧杯中，加入少量洗洁精，用纱布封紧杯口，在流水下冲洗干净。去壳后以无菌水冲洗3次，75％的乙醇溶液表面消毒3次，每次40s，再用无菌水冲洗3次，之后用0.1％升汞溶液处理4min，无菌水冲洗5次。在超净工作台上，用灭过菌的镊子在灭过菌的培养皿中剥除胚乳，取出成熟胚，将其接入愈伤组织诱导培养基，每瓶接4-6个，置于27℃培养箱内黑暗培养。经过10d左右，将生长良好，即未被污染和未发生褐变的个体转移到继代培养基中保持和增殖。
(3)黑松愈伤组织的继代培养
在无菌操作室中，将愈伤组织切成黄豆大小的组织块，接入继代培养基上，每个三角瓶中接入3-4块，置于27℃恒温箱中暗培养，每隔20-30d继代培养一次。
3.松材线虫的无异培养
(1)无菌松材线虫卵的制备
a.分离松材线虫：将在灰葡萄孢(Botryis cinerea)上培养的松材线虫用贝曼漏斗法分离。把分离到的松材线虫离心，鉴定，备用；
b.将上述离心，鉴定后的松材线虫加在事先制备好的2％的平板琼脂培养基上，用封口膜封好培养皿，置入27℃的恒温培养箱中培养6-24h；
c.在培养期间，观察松材线虫的产卵情况；当线虫产卵量达到实验所需要求时，在无菌条件下，用灭过菌的吸管吸适量无菌水将琼脂培养基上的松材线虫及其中的卵全部洗到灭过菌的离心管中，滴入30％的H2O2(与卵悬液的体积比为1∶1)，在15℃下静置10min，在显微镜下观察线虫的死亡情况；
d.待线虫大部分死亡，用无菌水冲洗3-5遍，每次加无菌水后，摇匀后放在离心机上离心3-4min，待冲净离心管中双氧水后，用无菌的200目不锈钢过滤筛过滤，重复过滤4-6次，直至将大部分线虫过滤掉为止；
e.用事先制备好的NA斜面培养基检查线虫卵有无细菌；如果出现细菌，则放弃本次实验而重新进行。
(2)制备培养液
f.无菌条件下，称取10mg上述愈伤组织和0.1mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。
(3)松材线虫的培养
g.用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵
h.将上述培养液置于40℃下，暗培养20d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例2
1、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A菌株的培养及处理：(1)NB液体培养基的制备：称取96g营养肉汤(NB)溶于3000ml蒸馏水中，煮沸，分装于三角瓶中；在121℃，1.05kg/cm2的灭菌锅中灭菌15min，备用。(2)菌种活化。方法同实施例1。(3)细菌的培养：在无菌条件下，将活化的荧光假单胞GcM5-1A菌株接入NB液体培养基中，按每50ml NB液体培养基中接入1ml活化菌株，置于30℃恒温振荡器(128r/min)上培养4d。(4)死细菌的获得：将步骤(3)得到的细菌，在无菌条件下，置于-40℃下12h低温冷冻干燥，取出后置室温下解冻，进行冷冻干燥，得无菌干燥的死细菌。备用
2、培养黑松愈伤组织
以与实施例1相同的方法培养黑松愈伤组织，然后，
将以上步骤得到的黑松愈伤组织，在无菌条件下，置于-40℃下12h低温冷冻干燥，取出后置室温下解冻，进行冷冻干燥，得无菌干燥死的的愈伤组织。备用
3.松材线虫的无异培养
(1)无菌松材线虫卵的制备，方法同实施例1。(2)制备培养液：无菌条件下，称取10mg上述死愈伤组织和0.1mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养：用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵。将上述培养液置于15℃下，暗培养20d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例3
1、荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的培养及处理，方法同实施例1
2、培养黑松愈伤组织，方法同实施例1
3.松材线虫的无异培养：(1)无菌松材线虫卵的制备，方法同实施例1。(2)制备培养液：无菌条件下，称取200mg上述活愈伤组织和0.1mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养：用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵。将上述培养液置于23℃下，暗培养10d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例4
1、荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的培养及处理，方法同实施例1
2、培养黑松愈伤组织，方法同实施例1
3.松材线虫的无异培养：(1)无菌松材线虫卵的制备，方法同实施例1。
(2)制备培养液：无菌条件下，称取40mg上述活愈伤组织和0.1mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养：用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵。将上述培养液置于31℃下，暗培养10d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例5
1、荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的培养及处理，方法同实施例2
2、培养黑松愈伤组织，方法同实施例1
3.松材线虫的无异培养：(1)无菌松材线虫卵的制备，方法同实施例1。(2)制备培养液：无菌条件下，称取150mg上述活愈伤组织和0.1mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养：用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵。将上述培养液置于25℃下，暗培养4d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例6
1、荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的培养及处理，方法同实施例2
2、培养黑松愈伤组织，方法同实施例1
3.松材线虫的无异培养：(1)无菌松材线虫卵的制备，方法同实施例1。(2)制备培养液：无菌条件下，称取80mg上述活愈伤组织和0.1mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养：用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵。将上述培养液置于28℃下，暗培养4d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例7
1、荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的培养及处理，方法同实施例2
2、培养黑松愈伤组织，方法同实施例1
3.松材线虫的无异培养：(1)无菌松材线虫卵的制备，方法同实施例1。(2)制备培养液：无菌条件下，称取120mg上述活愈伤组织和0.1mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养：用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵。将上述培养液置于15℃下，暗培养20d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例8
1、荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的培养及处理，方法同实施例1
2、培养并获得死的黑松愈伤组织，方法同实施例2
3.松材线虫的无异培养：(1)无菌松材线虫卵的制备，方法同实施例1(2)制备培养液：无菌条件下，称取0.5mg上述死愈伤组织和0.1mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵。将上述培养液置于40℃下，暗培养20d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例9
1、荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的培养及处理，方法同实施例2
2、培养并获得死的黑松愈伤组织，方法同实施例1，得到黑松愈伤组织后，冷冻干燥，得无菌干燥的愈伤组织。
3.松材线虫的无异培养：(1)无菌松材线虫卵的制备，方法同实施例1。(2)制备培养液：无菌条件下，称取2mg上述干燥的死愈伤组织和0.1mg上述死荧光假单胞菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养：用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵。将上述培养液置于23℃下，暗培养10d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例10
1、荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的培养及处理，方法同实施例1
2、培养并获得死的黑松愈伤组织，方法同实施例2。得到黑松愈伤组织后，冷冻干燥，得无菌干燥的死愈伤组织。
3.松材线虫的无异培养：(1)无菌松材线虫卵的制备，方法同实施例1。(2)制备培养液：无菌条件下，称取7.5mg上述干燥的死愈伤组织和0.1mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养：用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵。将上述培养液置于31℃下，暗培养10d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例11：
1、荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的培养及处理，方法同实施例1。
2、培养并获得死的黑松愈伤组织，方法同实施例2。得到黑松愈伤组织后，冷冻干燥，得无菌干燥的愈伤组织。
3.松材线虫的无异培养：无菌松材线虫卵的制备，方法同实施例1。(2)制备培养液：无菌条件下，称取4mg上述干燥的死愈伤组织和0.1mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养：用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵。将上述培养液置于25℃下，暗培养4d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例12
1、荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的培养及处理，方法同实施例1。
2、培养并获得死的黑松愈伤组织，方法同实施例2。得到黑松愈伤组织后，冷冻干燥，得无菌干燥的愈伤组织。
3.松材线虫的无异培养：(1)无菌松材线虫卵的制备，方法同实施例2。(2)制备培养液：无菌条件下，称取6mg上述干燥的死愈伤组织和0.1mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养：用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵。将上述培养液置于28℃下，暗培养4d后，得所需的无菌松材线虫。
实施例13
1、荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的培养及处理，方法同实施例1
2、培养并获得死的黑松愈伤组织：同实施例1步骤得到黑松愈伤组织后，将新鲜的无菌愈伤组织在无菌条件下，通过溴乙烷对步骤4中获得的黑松愈伤组织进行处理(方法同实施例1)，得无菌的死愈伤组织。干燥，得无菌干燥的死愈伤组织，备用。
3.松材线虫的无异培养：(1)无菌松材线虫卵的制备，采用已知的方法培养松材线虫，待其产卵，采用升汞分离获得无菌卵。其具体方法是：将线虫卵在75％的乙醇中浸30s，移入0.1％HgCI2溶液表面消毒1min，灭菌水换洗3次。得无菌松材线虫卵。(2)制备培养液：无菌条件下，称取10mg上述干燥的死愈伤组织和0.01mg上述死细菌，加入2ml无菌水，或按上述比例配制培养液。(3)松材线虫的培养：用无菌吸管向上述培养液中加入已制备好的无菌松材线虫卵，将上述培养液置于26℃下，暗培养5d后，得所需的无菌松材线虫。
当然，在本发明的发明构思下，本发明有多种实施形式，如，本领域技术人员阅读本说明书后毋需付出创造性劳动即可再现出，在此就不详述了。
在此还需指出的是，沿用本发明的发明构思，以本发明技术解决方案中步骤4获得的活愈伤组织或步骤5所获得的死愈伤组织与步骤1所获得的活细菌按与步骤6中的相同比例配制的培养液带菌的松材线虫，相对于现有培养带菌的松材线虫技术而言，同样更有效，其个体大小、繁殖率、产量和质量都较
现有技术更高。
Claims (10)
1、一种无菌松材线虫的培养方法，包括下列的步骤：
(1)以常规培养细菌方法培养培养荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)GcM5-1A CCTCC No：M 204065获得细菌活菌体细胞，并对其进行灭活处理从而获得死细胞，备用；
(2)制备无菌松材线虫卵，备用；
(3)培养黑松愈伤组织，备用；
(4)无菌条件下，以步骤1、3获得的各备用材料混合并按下列比例与适量的无菌水配制成不同的培养液：
黑松愈伤组织∶死细菌(质量比)为100~2000∶1
(5)向步骤5获得的任一培养液中加入步骤2中制备好的无菌松材线虫卵，置于温度：15-40℃，暗培养4-20d后，得所需的无菌松材线虫。
2、一种无菌松材线虫的培养方法，包括下列的步骤：
(1)以常规培养细菌方法培养荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A CCTCC No：M 204065获得细菌活菌体细胞，并对其进行灭活处理从而获得死细胞，备用；
(2)制备无菌松材线虫卵，备用；
(3)培养黑松愈伤组织；
(4)将上述获得黑松愈伤组织进行灭活处理从而获得无菌干燥的死黑松愈伤组织，备用；
(5)无菌条件下，以步骤1、4获得的各备用材料按下列比例混合并与适量的无菌水配制成不同的培养液：
死愈伤组织∶死细菌(质量比)为5~100∶1
(6)向步骤5获得的任一培养液中加入步骤2中制备好的无菌松材线虫卵，置于温度：15-40℃，暗培养4-20d后，得所需的无菌松材线虫。
3、根据权利要求1或2任一所述的无菌松材线虫的培养方法，其特征在于：所述步骤1中采用化学方法中的三氯甲烷法对所获得的细菌活菌体细胞进行灭活处理从而获得死细胞，具体做法如下：
a.将培养得到的菌体细胞置于试管或烧瓶中，用灭过菌的脱脂棉浸适量三氯甲烷(浸透但不滴下)塞入试管或烧瓶口，后塞上棉塞；置于无菌室内约2-4h；
b.2h后，用无菌镊子取出浸有三氯甲烷脱脂棉，将试管口或烧瓶口敞开，在无菌室内放置2-4h，待试管中的三氯甲烷挥发尽后，用接种环取1环菌苔，接入已制备好的NA斜面培养基上，置于28℃的恒温培养箱中培养48h；
c.48h后观察上述NA斜面培养基上是否有细菌生长，若没有，则表明细菌已被三氯甲烷杀死，死细菌可备用；否则重新灭菌。
4、根据权利要求1或2任一所述的无菌松材线虫的培养方法，其特征在于：步骤2中采用H2O2杀死线虫并分离从而获得虫卵，具体做法如下：
a.分离松材线虫：将在灰葡萄孢(Botryis cinerea)上培养的松材线虫分离，把分离到的松材线虫离心，鉴定，备用；
b.将上述离心，鉴定后的松材线虫加在事先制备好的2％的平板琼脂培养基上，用封口膜封好培养皿，置入27℃的恒温培养箱中培养6-24h；
c.在培养期间，观察松材线虫的产卵情况；当线虫产卵量达到实验所需要求时，在无菌条件下，用灭过菌的吸管吸适量无菌水将琼脂培养基上的松材线虫及其中的卵全部洗到灭过菌的离心管中，滴入30％的H2O2(与卵悬液的体积比为1∶1)，在15℃下静置10min，在显微镜下观察线虫的死亡情况；
d.待线虫大部分死亡，用无菌水冲洗3-5遍，每次加无菌水后，摇匀后放在离心机上离心3-4min，待冲净离心管中双氧水后，用无菌的200目不锈钢过滤筛过滤，重复过滤4-6次，直至将大部分线虫过滤掉为止；
e.用事先制备好的NA斜面培养基检查线虫卵有无细菌；如果出现细菌，则放弃本次实验而重新进行。
5、根据权利要求1或2任一所述的无菌松材线虫的培养方法，其特征在于：所述方法的最后一个步骤中的培养温度为23-31℃，暗培养时间为4-10d。
6、根据权利要求1或2任一所述的无菌松材线虫的培养方法，其特征在于：所述方法的最后一个步骤中的培养温度为25-28℃，暗培养时间为4-5d。
7、根据权利要求1所述的无菌松材线虫的培养方法，其特征在于：所述培养液的制备步骤中，愈伤组织与死细菌的质量比为400～1500∶1。
8、根据权利要求1所述的无菌松材线虫的培养方法，其特征在于：所述培养液的制备步骤中，愈伤组织与死细菌的质量比为800～1200∶1。
9、根据权利要求2所述的无菌松材线虫的培养方法，其特征在于：所述培养液的制备步骤中，无菌干燥的死愈伤组织与死细菌的质量比为20～75∶1。
10、根据权利要求2所述的无菌松材线虫的培养方法，其特征在于：所述培养液的制备步骤中，无菌干燥的死愈伤组织与死细菌的质量比为40～60∶1。
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