CN102613406A - 一种松材线虫人工饲养液的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种松材线虫人工饲养液的制备方法，属于线虫人工饲养技术领域。其特征在于包括以下步骤：1）按照比例称取原料粉碎备用；2）获得浓度较高的松材线虫悬浮液；3）部分粉碎混合物加入水中浸泡过滤除去残渣，得到的滤液中再加入真菌，充分搅拌均匀，26－30℃下静置2-3h，然后再加入松材线虫悬浮液1-2滴，即得松材线虫人工饲养液。上述一种松材线虫人工饲养液的制备方法，以松材疫木上分离得到的松材线虫为培养对象，通过人工饲养，获得研究所需的合格松材线虫，其操作过程简便，长期饲养也不会改变松材线虫原有的生物学特性。其饲养方法简单易行，周期短，线虫产量高，效果好，生产成本低廉，品种优良。

Description

一种松材线虫人工饲养液的制备方法

技术领域

本发明属于线虫人工饲养技术领域，具体为一种松材线虫人工饲养液的制备方法。

背景技术

松材线虫Bursaphelenchus xylophilus属蠕形动物门，线虫纲，垫刃目，滑刃总科，伞刃属。线虫成虫虫体细长，体长约1mm，雌虫尾部近圆锥形，末端圆。雄虫尾部似鸟爪，向腹面弯曲。松材线虫病又称松枯萎病，是一种毁灭性病害。国家林业局在2009年第3号公告,松材线虫病疫区为江苏、浙江、安徽、江西、山东、福建、湖北、湖南、广东、重庆、云南、广西、重庆、四川等15个省、区、市的193个县(市、区)。据统计, 2008年全国松材线虫病发生面积96.42万亩,病死松树106.17万株。不仅直接破坏了自然景观及生态环境,给国民经济造成巨大损失,更对我国松林资源,尤其是对我国南方广泛栽植的330多万hm2松林和重要生态区域构成了严重威胁,同时,也严重地影响着我国外贸出口竞争力。根据植物病理学的经典柯赫氏法则,要对由松材线虫引起的松材线虫病进行研究,获得松材线虫的培养方法是整个研究的关键。因此,要对松材线虫进行研究,首先就要获得大量的线虫。前人对松材线虫的培养方法归纳起来主要有2大类3种方法:①单异活体培养——人工培养基培养松材线虫,又分为2种,一种是用人工培养基先培养真菌,然后利用真菌培养;另一种则利用植物组织培养技术培养松树愈伤组织,然后以松树愈伤组织为食料培养。②无异活体培养——人工合成培养基直接培养松材线虫。目前无菌松材线虫的人工培养方法主要有单异活体培养和无异活体法,但也有学者指出: 这两种方法的主要缺点是操作过程较为繁琐,得到的无菌线虫数量较少,难以满足研究需要,食料真菌培养法其操作过程较为繁杂,易污染,难以排除食料真菌或消毒剂对实验的影响;无异活体培养法其培养周期较长,产量较低,而且长期培养还可能会改变松材线虫原有的生物学特性。在黑松愈伤组织上培养无菌松材线虫既克服了食料真菌法的缺点,又较无异活体培养法所用培养周期短,产量要高;但是几次继代后的线虫体型较小,保藏不方便。所以不管是单异活体培养还是无异活体法,建立一套科学完整的松材线虫人工饲养体系,是以后松材线虫人工培养的研究方向和关键。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种松材线虫人工饲养液的制备方法的技术方案，具有饲养成本低，操作简便，应用范围广，线虫产量高，同时不会改变松材线虫原有的生物学特性。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）按照松木屑15-20%、黄瓜15-20%、香蕉15-20%、苹果15-20%、豌豆15-20%、麦芽糖15-20%的比例称取上述物质，均粉碎至150-200目，备用；

2）将松木屑粉碎物用三层纱布包好放入盛满清水的漏斗中，漏斗下接一段8-15 cm长的橡皮管，橡皮管上装一个截流弹簧夹，13-17h后打开弹簧夹，用离心管接取橡皮管中水样；静置15-30 min，然后在转速1500-2000r/min下离心2-5 min，除去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的松材线虫悬浮液，备用；

3）将黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖粉碎混合物加入水中浸泡3-5h，按照粉碎混合物1g加水量4-7ml的比例加水，用两层纱布过滤除去残渣，得到的滤液中再加入真菌，真菌的加入重量为粉碎混合物重量的0.08-0.2倍，充分搅拌均匀，26－30℃下静置2-3h，然后取步骤1）中的松材线虫悬浮液1-2滴，接种到上述饲养液中，即得松材线虫人工饲养液。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤1）中：松木屑的含量为16-18%，黄瓜的含量为16-18%，香蕉的含量为16-18%，苹果的含量为16-18%，豌豆的含量为16-18%，麦芽糖的含量为16-18%。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤2）中：橡皮管的长度为10-12 cm，截流弹簧夹夹住的时间为14-16h，静置时间20-25 min，转速1600-1800r/min，离心时间3-4 min。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤3）中：黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖粉碎混合物在水中浸泡时间3.5-4.5h。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤3）中：静置温度27－29℃，时间为2.2-2.8h。

所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤3）中所述的真菌为长喙壳菌、酵母菌、毛壳菌、镰刀菌、灰葡萄胞菌中的一种或一种以上混合物。

上述一种松材线虫人工饲养液的制备方法，以松材疫木上分离得到的松材线虫为培养对象，通过人工饲养，获得研究所需的合格松材线虫，其操作过程简便，长期饲养也不会改变松材线虫原有的生物学特性。其饲养方法简单易行，周期短，线虫产量高，效果好，生产成本低廉，品种优良，能显著提高松材线虫饲养的存活率和繁殖率。

本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，其它的均为纯物质的重量百分含量。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，并结合试验进一步说明本发明的有益效果。

实施例1 

称取松木屑、黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖各20g，均粉碎至200目，然后加入100ml的水浸泡5h，用两层纱布过滤除去残渣，得到的滤液中再加入长喙壳菌2g，充分搅拌均匀，30℃下静置3h，然后取松材线虫悬浮液2滴，接种到上述饲养液中，最后置于温度为26℃，湿度为85%的恒温恒湿箱中正常饲养。

实施例2

称取松木屑、黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖各15g，均粉碎至170目，然后加入100ml的水浸泡4h，用两层纱布过滤除去残渣，得到的滤液中再加入酵母菌2g，充分搅拌均匀，30℃下静置2.4h，然后取松材线虫悬浮液1滴，接种到上述饲养液中，最后置于温度为24℃，湿度为79%的恒温恒湿箱中正常饲养。

实施例3

称取松木屑、黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖各16g，均粉碎至190目，然后加入100ml的水浸泡3.5h，用两层纱布过滤除去残渣，得到的滤液中再加入长喙壳菌0.4g、酵母菌0.4g、毛壳菌0.4g、镰刀菌0.4g、灰葡萄胞菌0.4g，充分搅拌均匀，29℃下静置2.8h，然后取松材线虫悬浮液2滴，接种到上述饲养液中，最后置于温度为26℃，湿度为85%的恒温恒湿箱中正常饲养。

实施例4

称取松木屑、黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖各17g，均粉碎至160目，然后加入100ml的水浸泡4.5h，用两层纱布过滤除去残渣，得到的滤液中再加入毛壳菌2g，充分搅拌均匀，28℃下静置2.5h，然后取松材线虫悬浮液1滴，接种到上述饲养液中，最后置于温度为24℃，湿度为78%的恒温恒湿箱中正常饲养。

实施例5

称取松木屑、黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖各18g，均粉碎至180目，然后加入100ml的水浸泡5h，用两层纱布过滤除去残渣，得到的滤液中再加入镰刀菌、灰葡萄胞菌各1g，充分搅拌均匀，27℃下静置2.2h，然后取松材线虫悬浮液2滴，接种到上述饲养液中，最后置于温度为25℃，湿度为80%的恒温恒湿箱中正常饲养。

实施例6

称取松木屑、黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖各20g，均粉碎至150目，然后加入100ml的水浸泡3h，用两层纱布过滤除去残渣，得到的滤液中再加入酵母菌、灰葡萄胞菌各1g，充分搅拌均匀，26℃下静置2h，然后取松材线虫悬浮液1滴，接种到上述饲养液中，最后置于温度为23℃，湿度为75%的恒温恒湿箱中正常饲养。

以下通过试验说明上述松材线虫饲养方法的良好效果。

表1  实施例1-6对松材线虫在不同饲养天数下存活率的试验结果

处理	饲养天数（d）	松材线虫存活率（%）
			实施例1	7	100
实施例2	12	100
			实施例3	6	100
实施例4	8	100
			实施例5	4	100
实施例6	4	100
			对照（清水）	4	0

表1表明：实施例1-6在不同饲养天数下松材线虫的存活率均较高，实施例1-6在饲养4-12天内存活率均高达100%，未出现死亡现象，显著高于清水对照组。

表2  实施例1-6对松材线虫饲养繁殖的试验结果

处理	接种的松材线虫（条）	饲养天数（d）	饲养繁殖后松材线虫（条）
				实施例1	19	5	3250
实施例2	8	5	1240
				实施例3	23	5	3647
实施例4	10	5	1430
				实施例5	21	5	3520
实施例6	11	5	1563
				对照（清水）	20	5	0

表2表明：松材线虫在实施例1-6条件下饲养后繁殖均较快，实施例1优于实施例2，实施例3优于实施例4，实施例5优于实施例6，均明显高于对照组。

Claims (6)

1.一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）按照松木屑15-20%、黄瓜15-20%、香蕉15-20%、苹果15-20%、豌豆15-20%、麦芽糖15-20%的比例称取上述物质，均粉碎至150-200目，备用；

2）将松木屑粉碎物用三层纱布包好放入盛满清水的漏斗中，漏斗下接一段8-15 cm长的橡皮管，橡皮管上装一个截流弹簧夹，13-17h后打开弹簧夹，用离心管接取橡皮管中水样；静置15-30 min，然后在转速1500-2000r/min下离心2-5 min，除去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的松材线虫悬浮液，备用；

3）将黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖粉碎混合物加入水中浸泡3-5h，按照粉碎混合物1g加水量4-7ml的比例加水，用两层纱布过滤除去残渣，得到的滤液中再加入真菌，真菌的加入重量为粉碎混合物重量的0.08-0.2倍，充分搅拌均匀，26－30℃下静置2-3h，然后取步骤1）中的松材线虫悬浮液1-2滴，接种到上述饲养液中，即得松材线虫人工饲养液。

2.如权利1所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤1）中：松木屑的含量为16-18%，黄瓜的含量为16-18%，香蕉的含量为16-18%，苹果的含量为16-18%，豌豆的含量为16-18%，麦芽糖的含量为16-18%。

3.如权利1所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤2）中：橡皮管的长度为10-12 cm，截流弹簧夹夹住的时间为14-16h，静置时间20-25 min，转速1600-1800r/min，离心时间3-4 min。

4.如权利1所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤3）中：黄瓜、香蕉、苹果、豌豆、麦芽糖粉碎混合物在水中浸泡时间3.5-4.5h。

5.如权利1所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤3）中：静置温度27－29℃，时间为2.2-2.8h。

6.如权利1所述的一种松材线虫人工饲养液的制备方法，其特征在于步骤3）中所述的真菌为长喙壳菌、酵母菌、毛壳菌、镰刀菌、灰葡萄胞菌中的一种或一种以上混合物。