CN101334363B - 一种基于荧光假单胞菌鞭毛蛋白检测松材线虫病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于松材线虫携带的荧光假单胞菌鞭毛蛋白检测松材线虫病的方法。首先在体外培养松材线虫携带的荧光假单胞菌菌株GcM5-1A(保藏编号为CCTCC No：M204065)，从该菌株发酵液中分离纯化鞭毛蛋白，以此为抗原，免疫家兔制备兔抗鞭毛蛋白的抗血清；然后用十二烷基硫酸钠溶液分别提取健康黑松和感染松材线虫病的黑松组织的全蛋白，将少量的提取液点样于聚偏氟乙烯膜上，用兔抗鞭毛蛋白的抗血清制备的按照Western blot的方法检测黑松的组织蛋白，感染松材线虫的黑松中提取的蛋白样品呈阳性，健康黑松组织的提取物呈阴性。该方法检测速度快，检测成本低，适合大规模的松材线虫病的调查，是对现有松材线虫病检测方法的有益补充。
Description
技术领域：
本发明涉及一种基于松材线虫携带的荧光假单胞菌鞭毛蛋白检测松材线虫病的方法，属于林业生物技术领域。
背景技术：
松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)是松属树种的一种毁灭性病害，主要由松褐天牛(Monochamus alternatus)传播，可危害黑松(Pinus thunbergii)、马尾松(P.massoniana)等多种松树。目前，该病在日本、美国、加拿大、中国、韩国、尼日利亚、葡萄牙等国家都有发生，其中以日本和中国受害最为严重。我国自1982年秋在南京中山陵风景区首次发现松材线虫病以来，目前该病害已在江苏、安徽、浙江、山东、广东、湖北、台湾和香港七省一地区发生，并且疫区有继续扩大的趋势。松材线虫病使得黑松植株大量死亡，流行成灾，它已给我国的林业生产造成了严重的威胁。目前比较有效的办法是尽早发现并铲除感染松材线虫的病株，从而控制松材线虫病在林区的蔓延。因此，建立一种快速有效的松材线虫病的检测方法就显得特别重要。
潘沧桑在其专利说明书(专利号：02129944.7)中阐述了一种松材线虫病的检测方法，该法是在固体或液体霉菌培养基上接种盘多毛或其它微生物真菌，在待测的松树树干上凿出或钻出圆孔，然后将装有菌体的试管插入树干上的圆孔，3～5天取出试管用显微镜观察、鉴定。
赵立荣等(赵立荣，廖金铃，钟国强.松材线虫和拟松材线虫的PCR快速检测.华南农业大学学报，2005，26(2)：59-61)利用PCR技术对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)与拟松材线虫(B.mucronatus)的rDNA的ITS1区和5.8S区核甘酸序列扩增。根据松材线虫与拟松材线虫的ITS1序列区别，分别设计出松材线虫和拟松材线虫的特异性引物，实现了单条活的或甲醛固定松材线虫和拟松材线虫的快速检测。
张奇等(张奇，马洪周，杨文博等.松材线虫纤维素酶的分离纯化及免疫学检测方法的研究.南开大学学报：自然科学版，2006，39(1)：95-99)通过松材线虫分泌的纤维素酶的鉴定以及初步纯化，得到了一种纤维素酶抗原，具有良好的抗原性。以该纤维素酶为指标，建立了一种选择性抗体酶联免疫分析法(SAEIA)，该方法显示了较好的特异性.利用该方法可以检测出疫木中存在的纤维素酶，为松材线虫的检测及松材线虫病的研究提供了一种新的手段。
曹宇等(曹宇，李海燕，马洪周等.免疫磁性捕获ELISA技术在松材线虫检测中的应用.林业科学研究，2005，18(5)：285-589)采用种子聚合法合成聚苯乙烯磁性微球，并以兔抗松材线虫IgG致敏，制备出能特异性地捕获松材线虫蛋白抗原的免疫磁性微球。以生物素标记抗体为示踪抗体，并结合酶标亲和素检测系统，用于疫木样品的分析。
这些已有的技术在松材线虫病的检测过程中发挥了一定作用，但又存在一定局限性。有的方法费时，有的方法成本高，且需要贵重设备。
Zhao等(Zhao BG，Wang HL，Han SF，et al.Distribution and pathogenicity ofbacteria species carried by Bursaphelenchus xylophilus in China.Nematoiogy，2003，6：899-906)在进行中国松材线虫病的调查时发现，松材线虫体表普遍携带着细菌，共鉴定出24种，这些细菌主要为假单胞属类细菌，其中一优势菌株对黑松有很强的致病性，被鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A菌株。在对该菌株致病毒素的分离时，我们从其培养液中分离纯化了一种分子量为50kDa(千道尔顿)的蛋白，经N-末端序列分析表明，该蛋白为细菌的鞭毛蛋白。健康松树体内无细菌存在，且为酸性环境，细菌无法生存，因此，本发明的检测方法利用该荧光假单胞菌的鞭毛蛋白制备了抗体，利用点杂交技术可检测感染了松材线虫的疫木。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种基于松材线虫携带的荧光假单胞菌鞭毛蛋白的松材线虫病的检测方法。利用该方法可以快速、简便、有效地区分感染松材线虫病的松树与健康松树。
为了实现上述发明目的，首先在体外培养松材线虫携带的荧光假单胞菌菌株(Pseudomo-nas fluorescens)GcM5-1A，该菌株已于2004年9月5日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No：M 204065。从该菌株发酵液中分离纯化鞭毛蛋白，以此为抗原，免疫家兔制备兔抗鞭毛蛋白的抗血清。然后用SDS溶液分别提取健康黑松和感染松材线虫病的黑松组织的全蛋白，将少量的提取液点样于PVDF(聚偏氟乙烯)膜上，用兔抗鞭毛蛋白的抗血清制备的按照Western blot的方法检测黑松的组织蛋白，结果表明，感染松材线虫的黑松中提取的蛋白样品呈阳性，而健康黑松组织的提取物呈阴性。
本发明的检测方法按照如下步骤操作：
步骤一，松材线虫携带荧光假单胞菌的培养与鞭毛蛋白的纯化：
取斜面培养的荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的菌苔两环接种于LB液体培养基中，30℃培养24小时，转接于大容量LB培养基中，同样的条件下继续培养24小时；
将细菌培养液离心，取上清进行硫酸铵分级沉淀，取20％饱和度的沉淀用TE溶液(20mMTris-Cl，pH8.0，5mM EDTA)溶解，对TE溶液透析过夜后，用超滤浓缩管(5kDa)浓缩，取浓缩液上Superdex-75凝胶过滤柱进行分子筛层析，洗脱液为TE溶液，分步收集，各步用SDS-PAGE分析检测，合并含50kD蛋白的洗脱液；将该洗脱液上DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析，用含0-1000mM NaCl的TE缓冲溶液洗脱，分步收集，SDS-PAGE检测，得到了电泳纯的蛋白，合并含50kD蛋白的洗脱液，对蒸馏水透析过夜，得到纯化的分子量为50kD的荧光假单胞菌鞭毛蛋白；
步骤二，兔抗鞭毛蛋白的抗血清的制备：
将荧光假单胞菌鞭毛蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，免疫接种雄性日本家兔，三周后用鞭毛蛋白加强免疫一次，十天后，静脉取血，离心，获得兔抗鞭毛蛋白的抗血清；
步骤三，利用抗血清对黑松疫木检测：
分别取感染松材线虫病的黑松组织和健康黑松组织，粉碎，加入0.5％～1.0％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，50～80℃浸提20～30min，离心，取少量上清点在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5分钟后，1～25℃将PVDF膜浸在封闭液(20mM Tris-Cl，pH7.5，0.45％KCl，1.0％脱脂奶粉的混合液)中30分钟，按照1∶1000的体积比加入兔抗鞭毛蛋白的抗血清，混匀，25℃温育30分钟，用20mM Tris-Cl(pH7.5)洗膜3次，每次5分钟，加入封闭液，并按照1∶2000体积比加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，25℃温育30分钟，用20mM Tris-Cl(pH7.5)洗膜3次，每次5分钟，最后将PVDF膜浸于显色缓冲液(20mM Tris-Cl，pH8.0，0.03％ NiCl2，0.01％二氨基联苯胺，0.3％H2O2的混合液)中显色，自来水冲洗终止反应，结果显示，来源于感染松材线虫病的样品呈现褐色斑点，而健康黑松组织的样品不显色。
该方法检测速度快，检测成本低，适合大规模的松材线虫病的调查，是对现有松材线虫病检测方法的有益补充。
附图说明：
图1为松材线虫携带的荧光假单胞菌鞭毛蛋白的纯化图。
图2为点杂交对感染松材线虫病的黑松组织提取物的分析图。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明方法做进一步的说明。
实施例1：
1、松材线虫携带荧光假单胞菌的培养与鞭毛蛋白的纯化
取斜面培养的荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的菌苔两环接种于30mL LB液体培养基中，30℃培养24h，转接于1L LB培养基中，同样的条件下继续培养24h。
细菌培养液4℃、15，000rpm离心20min，取上清进行硫酸铵分级沉淀，取20％饱和度的沉淀用20mi TE(20mM Tris-Cl，pH8.0，5mM EDTA)溶解，对2LTE溶液透析过夜后，用AmiconUltra超滤浓缩管(5kDa)浓缩，取3mL浓缩液上Superdex-75凝胶过滤柱(1.6×60cm)进行分子筛层析，洗脱液为TE溶液，流速1.0mL/min，分步收集，各步用SDS-PAGE分析检测，合并含50kD蛋白的洗脱液。将该洗脱液上DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析，洗脱液为含0-1000mM NaCl的TE缓冲溶液，分步收集，SDS-PAGE检测，得到了电泳纯的蛋白，结果如图1所示，1为中分子量的标准蛋白，2为20％饱和度的硫酸铵沉淀的蛋白，3为经过Superdex-75凝胶过滤柱层析所得蛋白，分子量为50kD，4为DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析所得蛋白。合并含50kD蛋白的洗脱液，对2L蒸馏水透析过夜，用Folin-酚法测定蛋白含量。用ABI氨基酸末端序列分析仪测定其N-端序列为：ALSVNTNITS，证实所纯化的分子量为50kD的蛋白为鞭毛蛋白。
2、兔抗鞭毛蛋白的抗血清的制备
将200μg荧光假单胞菌鞭毛蛋白与等体积的弗氏完全佐剂(轻质石蜡油50ml，羊毛脂25ml，灭活结核杆菌60mg，生理盐水25ml)混合，免疫接种一只雄性日本家兔，三周后用100μg鞭毛蛋白加强免疫一次，十天后，耳缘静脉取血，1000rpm离心10min，获得兔抗鞭毛蛋白的抗血清，效价分析表明，所制得的抗血清效价为1∶3000。
3、利用抗血清对黑松疫木的检测
分别取感染松材线虫病的黑松组织和健康黑松组织各1g，用粉碎机打碎后，加入2mL0.5％～1.0％SDS溶液，50～80℃浸提20～30min，10，000rpm离心10min，取上清5～10μL点在PVDF(PALL公司)上，5min后，1～25℃将PVDF膜浸在20mL封闭液(20mM Tris-Cl，pH7.5，0.45％KCl，1.0％脱脂奶粉)中30min，按照1∶1000的体积比加入兔抗鞭毛蛋白的抗血清，混匀，25℃温育30min，用20mM Tris-Cl(pH7.5)洗膜3次，每次5min，加入20mL封闭液，并按照1∶2000的体积比加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，25℃温育30min，用20mMTris-Cl(pH7.5)洗膜3次，每次5min，最后将PVDF膜浸于显色缓冲液(20mM Tris-Cl，pH8.0，0.03％NiCl2，0.01％二氨基联苯胺，0.3％H2O2)中显色，自来水冲洗终止反应。图2中1为健康黑松样品，2为感染了松材线虫病的黑松样品，结果显示，来源于感染松材线虫病的样品呈现褐色斑点，而健康黑松组织的样品不显色。
Claims (5)
1.一种基于荧光假单胞菌鞭毛蛋白检测松材线虫病的方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，取斜面培养的保藏编号为CCTCC No：M 204065的荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的菌苔两环接种子LB液体培养基中，30℃培养24小时，转接于大容量LB培养基中，同样条件下继续培养24小时；将细菌培养液离心，取上清进行硫酸铵分级沉淀，取20％饱和度的沉淀用TE溶液溶解，对TE溶液透析过夜后，用超滤浓缩管浓缩，取浓缩液上Superdex-75凝胶过滤柱进行分子筛层析，洗脱液为TE溶液，分步收集，各步用SDS-PAGE分析检测，合并含50kD蛋白的洗脱液；将该洗脱液上DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析，用含0-1000mM NaCl的TE缓冲溶液洗脱，分步收集，SDS-PAGE检测，得到了电泳纯的蛋白，合并含50kD蛋白的洗脱液，对蒸馏水透析过夜，得到纯化的分子量为50kD的荧光假单胞菌鞭毛蛋白；第二步，将荧光假单胞菌鞭毛蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，免疫接种雄性日本家兔，三周后用鞭毛蛋白加强免疫一次，十天后，静脉取血，离心，获得兔抗鞭毛蛋白的抗血清；第三步，分别取感染松材线虫病的黑松组织和健康黑松组织，粉碎，加入0.5％～1.0％十二烷基硫酸钠溶液，50～80℃浸提20～30min，离心，取少量上清点在聚偏氟乙烯膜上，5分钟后，1～25℃将聚偏氟乙烯膜浸在封闭液中30分钟，按照1∶1000的体积比加入兔抗鞭毛蛋白的抗血清，混匀，25℃温育30分钟，用20mM，pH7.5的Tris-Cl洗膜3次，加入封闭液，并按照1∶2000的体积比加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，25℃温育30分钟，用20mM，pH7.5的Tris-Cl洗膜3次，最后将聚偏氟乙烯膜浸于显色缓冲液中显色，自来水冲洗终止反应，来源于感染松材线虫病的样品呈现褐色斑点，健康黑松组织的样品不显色。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光假单胞菌鞭毛蛋白检测松材线虫病的方法，其特征在于第一步中所用的TE溶液是20mM Tris-Cl，pH8.0，5mM EDTA。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光假单胞菌鞭毛蛋白检测松材线虫病的方法，其特征在于第二步中所用的弗氏完全佐剂是按照轻质石蜡油50ml，羊毛脂25ml，灭活结核杆菌60mg，生理盐水25ml配制。
4.根据权利要求1所述的一种基于荧光假单胞菌鞭毛蛋白检测松材线虫病的方法，其特征在于第三步中所用的封闭液是20mM Tris-Cl，pH7.5，0.45％KCl，1.0％脱脂奶粉的混合液。
5.根据权利要求1所述的一种基于荧光假单胞菌鞭毛蛋白检测松材线虫病的方法，其特征在于第三步中所用的显色缓冲液是20mM Tris-Cl，pH8.0，0.03％NiCl2，0.01％二氨基联苯胺，0.3％H2O2的混合液。
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