CN102084849B - 一种制备无细菌松材线虫的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备无细菌松材线虫的方法。该制备无细菌松材线虫的方法包括：培养松材线虫；制备纯净松材线虫卵；用15%H2O2浸泡50-60min松材线虫卵；孵化松材线虫；培养松材线虫并进行无细菌鉴定，即制备出无细菌松材线虫。本发明的制备无细菌松材线虫的方法，利用松材线虫卵具有粘附于玻璃器皿上的特性，采用小培养皿进行卵的收集，进而用新配制的15%H2O2进行灭菌处理，获得无菌松材线虫卵，无菌卵孵化并在灰葡萄孢上大量繁殖后获得无细菌的松材线虫。在无菌条件下，用所获得的无细菌松材线虫对赤松无菌组织培养幼苗进行接种试验显示，无细菌松材线虫接种依然能使无菌苗发生萎蔫。表明采用该方法对松材线虫进行无细菌化并未使其失去致病性，是一种简易且成功的方法。
Description
技术领域
本发明涉及无细菌松材线虫，尤其涉及一种制备无细菌松材线虫的方法。
背景技术
松材线虫病[Bursaphelenchu xylophilus (Sleiner&Buhrer) Nickle]，又称为松树萎蔫病，是松树的一种毁灭性病害。鉴于该病的危险性，各国学者对其进行了系统和深入的研究，但致病机理至今尚未完全弄清。关于松材线虫病的病原，目前存在两种观点，一种观点认为松材线虫是惟一病原，另一种观点则认为松材线虫病是松材线虫与其伴生细菌共同参与的复合病，在病原学方面细菌起主导作用。
Kiyohara和Tokushige（1971年）在不同林分用培养在多毛孢上的松材线虫接种14-25年生的黑松和赤松，结果造成这两种松树大量枯死，同时证明只有将线虫接种到木质部，松树才会死亡。Mamiya (1972)用松材线虫接种了黑松和赤松，结果引起这两种松树死亡。Bolla 和Jorden (1982) 将松材线虫经链霉素、青霉素等清毒后，经人工培养基培养，最后得到无菌的松材线虫，其致病性并未丧失。Kuroda 和Shin-ichiro (1992) 研究了松材线虫侵入黑松后的扩散和其他微生物相的变化，发现接种一周后黑松的水分输导受到障碍，但松树体内的微生物相和健康松树的一样，直至接种5周后，蓝变菌Ceratocystis spp.开始出现，细菌才开始增多。因此，认为接种松材线虫能单独引起松树萎蔫，与其他微生物无关。上述研究结果表明松材线虫可单独引起松树萎蔫，为松树萎蔫病的病原。
Oku等人(1980) 最早提出松树萎蔫与松材线虫携带细菌的代谢产物有关。Kawazu和Kaneko（1997）在无菌条件下用无菌松材线虫接种无菌赤松苗，松苗不死亡；而带细菌的松材线虫在同样条件下，可导致无菌松苗萎蔫枯死，因此认为细菌才是松材线虫病的真正病原。洪英娣等（2003）和Han等（2003）用无菌松材线虫或拟松材线虫接种黑松愈伤组织和无菌黑松苗，未能使其褐变和枯萎；而用无菌松材线虫和拟松材线虫与3 种分离自松材线虫体表的细菌分别混合接种均能使黑松无菌苗发生枯萎及愈伤组织严重褐变，因此认为松苗萎蔫与线虫的种类无关，而是由伴生细菌的种类所决定。赵博光等（2004）在无菌条件下用松材线虫体表细菌和无菌松材线虫单独接种无菌黑松苗，都不能使松苗发病，但二者的混合物却可使无菌苗萎蔫，提出松萎蔫病是松材线虫与细菌共同侵染引起的复合侵染病害的假说。
综上所述，目前对松材线虫及其伴生细菌与松树萎蔫病的关系尚存在很多争议。为了准确研究松材线虫及其携带细菌与宿主植物间的相互作用，也为了避免由于使用携带细菌的虫株可能会对研究结果造成影响，对松材线虫病研究中供试线虫提出了更高的要求，即需要使用无细菌松材线虫。
国内外已有不少关于松材线虫无菌化的报道。已有报道中，绝大多数无菌化方法采取直接对松材线虫虫体进行表面灭菌以获得无菌线虫（赵博光等，2000；郭道森等，2002；洪英娣等，2003；池树友等，2006；贲爱玲等，2008）。由于松材线虫体表存在大量细菌（赵博光等，2000；郭道森等，2002），因此难以彻底灭菌，要达到完全无菌，通常需几种试剂进行处理，步骤比较繁琐。如贲爱玲等（2008）报道用H2O2和抗菌素交替并反复处理松材线虫才能获得无菌松材线虫，即用5% H2O2 浸泡5min，无菌水离心换洗3次，加入抗菌素混合液（青霉素、链霉素、庆大霉素液）浸泡60min，离心洗涤，再用抗菌素混合液浸泡60 min，重复3次，最终无菌率达18%（9/50）。
除了上述直接对松材线虫体表进行表面灭菌的方法外，也有少量对卵进行灭菌的报道。Iwahori等（1985）报道了用0.5%硫柳汞和0.5%链霉素混合液处理松材线虫卵20 min获得无菌线虫的方法。但Kawazu等（1997）曾参照Iwahori等的方法进行无菌线虫的制备，发现用0.5%硫柳汞和0.5%链霉素处理松材线虫卵20 min所培养出的线虫并非完全无细菌，随后又反复对虫体进行表面灭菌，即用0.5%硫柳汞、0.1%链霉素分别再15分钟和30分钟，3次处理后的线虫尚未能达到完全无细菌，又用0.5%链霉素处理15分钟，最终获得无菌线虫。赵博光等也曾发明了一种通过对卵进行表面灭菌获得无菌线虫的方法，贲爱玲等曾采用该方法进行无菌线虫的培养，但操作步骤亦比较繁琐，尤其是对卵的挑取极不方便，使其可操作性不强（贲爱玲等，2008）。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的上述不足，本发明的目的是提供一种制备无细菌松材线虫的方法，以实现为松材线虫病相关研究提供一种简易可行的制备无细菌松材线虫材料的方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种制备无细菌松材线虫的方法，包括以下步骤：
（1）制备PDA培养基，接种灰葡萄孢到培养基上，在25℃下经过5-7d培养，灰葡萄孢菌丝铺满平板后将松材线虫接种其中，25℃下培养5-7d，待松材线虫大量繁殖后采用贝尔曼漏斗法分离松材线虫，收集于无菌的离心管中，离心，去上清，再用无菌水清洗，离心，重复3-5次，最终保留2-3 ml松材线虫悬浮液备用；
（2）将松材线虫悬浮液置于无菌的小培养皿中，于25℃下产卵，4-10h后，用无菌水将松材线虫虫体彻底冲洗清除，获得粘附于小培养皿的纯净松材线虫卵；
（3）将粘附有松材线虫卵的小培养皿置于无菌的大培养皿中，加入新配制的15%H2O2（w/v）将其淹没，分别于浸泡50-60min后取出，用无菌水清洗3次后，在小培养皿中加入少量（1-2ml）无菌水至将卵淹没，然后将其置于无菌的大培养皿中，控温25℃，培养30h孵化松材线虫；
（4）将步骤（3）中孵化的松材线虫转移至灰葡萄孢平板，待松材线虫将灰葡萄孢吃尽，于无菌条件下用灭菌的贝尔曼漏斗、止水夹、面巾纸将线虫收集于无菌的离心管中，离心，去上清保留2-3ml，取部分松材线虫液进行无细菌鉴定，即制备出无细菌松材线虫。
步骤（4）中取部分松材线虫液进行无细菌鉴定的方法为：取1 ml线虫液至研钵中，加石英砂研磨后涂布营养琼脂培养基（NA）平板，置于30℃恒温箱中倒置培养；另取0.5 ml线虫悬浮液接种至LB液体培养基中，30℃下进行振荡培养。3天后观察NA平板和LB液体培养基的染菌情况，无细菌污染的为无细菌线虫。
有益效果：本发明的制备无细菌松材线虫的方法，利用松材线虫卵具有粘附于玻璃器皿上的特性，采用小培养皿进行卵的收集，进而用新配制的15%H2O2进行灭菌处理，获得无菌松材线虫卵，无菌卵孵化并在灰葡萄孢上大量繁殖后获得无细菌的松材线虫。在无菌条件下，用所获得的无细菌松材线虫对赤松无菌组织培养幼苗进行接种试验显示，无细菌松材线虫接种依然能使无菌苗发生萎蔫。表明采用该方法对松材线虫进行无细菌化并未使其失去致病性，是一种简易且成功的方法。
附图说明
图1是实施例2中15%H2O2处理时间对获得无细菌松材线虫的影响数据表。表中，＋表示有细菌生长，－表示无细菌生长，N表示缺该处理。
图2是实施例2中15%H2O2处理对松材线虫卵孵化的影响数据表。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的解释。
实施例1
一种制备无细菌松材线虫的方法，包括以下步骤：
（1）制备PDA培养基，接种灰葡萄孢（Botrytis cinerea）到PDA培养基上，控温25℃，经过5-7d培养至菌丝铺满平板。PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18~20g，自来水1000mL。
（2）选取近交系松材线虫AMA3 C2222、2222、2111、2211、2111（简称CF20）及日本松材线虫虫株“宫崎2”接种于步骤（1）中长满灰葡萄孢菌丝的PDA培养基上，控温25℃，培养5-7d，待线虫大量繁殖后采用贝尔曼漏斗法分离线虫，收集于无菌的离心管中，2500 r/min离心3分钟，保留2-3 ml，获得松材线虫悬浮液，备用；
（3）将步骤（2）的松材线虫悬浮液分别置于无菌的直径为2~3cm的小培养皿中，控温25℃，产卵，4-10 h后，用无菌水将松材线虫虫体彻底冲洗清除，获得粘附于小培养皿的纯净松材线虫卵，每虫株各收集卵20余皿，备用；
（4）将步骤（3）粘附有纯净松材线虫卵的小培养皿分别置于无菌的直径为6-9cm的大培养皿中，加入新配制的15%H2O2至其淹没即可，浸泡10-60min后取出，用无菌水清洗3次后，在小培养皿中加入1-2ml无菌水至将卵浸没，然后置于无菌的大培养皿中，控温25℃，培养30h后，小培养皿中的卵孵化成二龄线虫，于无菌条件下用移液器将其转入灰葡萄孢平板中，并培养未经15% H2O2处理的样品为对照。
待线虫将灰葡萄孢吃尽，于无菌条件下用灭菌的贝尔曼漏斗、止水夹、面巾纸将线虫收集于无菌的离心管中，2500 r/min离心3分钟，去上清，保留2-3 ml松材线虫悬浮液。
实施例2
为了检验所培养线虫的无细菌情况，采用2种常用的细菌培养基进行检验。分别从各处理培养获得的线虫悬浮液中取1 ml至研钵中，加石英砂研磨后涂布营养琼脂培养基NA平板置于30℃恒温箱中倒置培养；另取0.5 ml线虫悬浮液接种至LB液体培养基中，30℃下进行振荡培养。3天后观察NA平板和LB液体培养基的染菌情况，统计染菌率。
如图1所示，检验结果表明，15% H2O2处理时间与无菌松材线虫的获得密切相关。15% H2O2处理时间短于50 min，未能彻底杀死松材线虫卵表面的细菌，所孵化的线虫均100%带菌，2个虫株均未能获得无菌线虫；15% H2O2处理时间达50 min，获得了无菌线虫，其中，近交系松材线虫CF20的5个重复中，3个无菌，日本虫株“宫崎2”的4个重复中，1个无菌；处理达60min，获得无菌线虫的概率大大增加，其中，近交系松材线虫CF20的4个重复中，3个完全无菌，“宫崎2”的6个重复中，4个无菌。
试验还以近交系松材线虫CF20的卵为材料，检查了15% H2O2处理时间对松材线虫卵孵化的影响。如图2所示，结果表明，H2O2处理时间过长会影响卵的孵化，因此，15%H2O2处理时间并非越长越好，而应控制在50-60 min。
为了检验所培养无菌松材线虫的致病力，于无菌条件下用无菌CF20和未经无菌化处理的CF20接种无菌赤松组培苗，二者均能使无菌赤松组培苗发病。表明采用该发明进行无菌化处理不会使松材线虫丧失致病性。
综上所述，本发明利用松材线虫卵的黏附特性，通过用小培养皿进行卵的收集，进而对卵进行表面灭菌，克服了直接对线虫体进行灭菌所带来的不便，容易达到松材线虫无菌化的目标。
Claims (1)
1.一种制备无细菌松材线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备PDA培养基平板，接种灰葡萄孢到PDA培养基平板，控温25℃，培养5～7d至菌丝铺满平板，将松材线虫接种其中，控温25℃，培养5-7d，采用贝尔曼漏斗法分离松材线虫，收集松材线虫于无菌的离心管中，离心，去上清，再用无菌水清洗，离心，去上清，重复3-5次，保留2-3ml松材线虫悬浮液备用；
(2)将步骤(1)制备的松材线虫悬浮液置于无菌的小培养皿中，于25℃下产卵，4-10h后，用无菌水将松材线虫虫体彻底冲洗清除，获得粘附于小培养皿的纯净松材线虫卵；
(3)将步骤(2)获得的粘附有松材线虫卵的小培养皿置于无菌的大培养皿中，加入按w/v新配制的15％H2O2至将其淹没，浸泡50-60min后取出，用无菌水清洗3次后，在小培养皿中加入少量无菌水后置于无菌的大培养皿中，控温25℃，培养30h孵化松材线虫；
(4)将步骤(3)中孵化的松材线虫转移至灰葡萄孢平板，待松材线虫将灰葡萄孢吃尽后，于无菌条件下用灭菌的贝尔曼漏斗分离线虫，收集于无菌的离心管中，2500r/min离心3分钟，去上清，保留2-3ml，取部分松材线虫液进行无细菌鉴定，即制备出无细菌松材线虫；
步骤(4)中，取部分松材线虫液进行无细菌鉴定的方法为：取1ml线虫液至研钵中，加石英砂研磨后涂布营养琼脂培养基平板，置于30℃恒温箱中倒置培养；另取0.5ml线虫悬浮液接种至LB液体培养基中，30℃下进行振荡培养；3天后观察NA平板和LB液体培养基的染菌情况，无细菌污染的为无细菌线虫。
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