CN102433295A - 线虫卵活体纯化提取剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
线虫卵活体纯化提取剂及其使用方法。它解决了现有线虫虫卵获取方法存在卵萌发率低、用时长和效率低的问题。线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成；其中试剂A由氯化钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠、次氯酸钠、硫酸镁、氢氧化钾、磷酸二氢钾和蒸馏水组成；试剂B由氯化钾、氯化钠、磷酸钠和蒸馏水组成。方法：一、取同种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂A中，震荡后离心，弃上清液留沉淀；二、向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂B，离心后取沉淀即完成。本发明线虫用量减少了50％，虫卵获取率平均提高30％，线虫虫卵萌发率平均提高了20％以上；本发明虫卵获取率高达自然繁殖的60％；虫卵孵化率达92.6％。
Description
技术领域
本发明涉及提取剂及其使用方法。
背景技术
线虫属于线形动物门(Nematoda)，已知1.5万种，为地球上数量最大的动物类群。线虫生境广布，营养结构复杂，生活史周期短，且分离方法简便高效，并易于分类鉴定，在分子生物学领域被广泛而深入研究，因其具备作为指示生物的优势和潜质可在农学和环境生态学领域被应用为生物标志物。线虫作为模式生物和进行室内模拟试验，要求对目标线虫进行种源维持、继代和同龄化培养。
作为线虫室内研究的基础，获取足量且高质的线虫虫卵以进行控制培养的方法一直在不断探究。线虫虫卵的获取多是利用物理工具或单一化学药品，尚缺乏辅以生物化学试剂的虫卵提取配剂。如植物根结线虫一般用针挑法在线虫附着物上直接获取虫卵；土壤线虫虫卵常用网筛过滤获得；秀丽隐杆线虫虫卵常用高浓度碱液和氧化剂获得，并逐渐应用于其他种属线虫虫卵的获取。
目前，常用线虫虫卵获取方法存在很多不足，首先，针挑法和筛选法虽然可保证线虫虫卵的大量获取，但由于线虫种类繁多生态位相近而不同种属线虫卵差异较小，无法保证纯种线虫虫卵的获取，且线虫虫卵通过针挑或筛触容易受到损伤，难以保证正常发育。因此传统的针挑法和筛选法不能高质量和高效率的获取纯种线虫虫卵；其次，利用秀丽隐杆线虫虫卵提取方法进行其他种类的线虫虫卵获取，当裂解液浓度过高会伤及虫卵，使得获取的虫卵不萌发；而裂解液浓度过低，用时可长达几十个小时，且虫体分解不完全，不能保证足量虫卵的获得，且无法分离的大量残体会影响卵的萌发。
发明内容
本发明目的是为了解决现有线虫虫卵获取方法存在杂种培养、卵萌发率低、残体和杂菌干扰、工作量大、用时长和效率低的问题，而提供线虫卵活体纯化提取剂及其使用方法。
线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成；其中试剂A由0.3～0.4g的氯化钠、1～1.5g的氢氧化钠、0.3～0.5g的磷酸氢二钠、1～1.5g的次氯酸钠、0.005～0.02g的硫酸镁、1～1.5g的氢氧化钾、0.1～0.3g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.3～0.4g的氯化钾、0.2～0.3g的氯化钠、2～3g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成。
线虫卵活体纯化提取剂的使用方法如下：一、取同种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂A中，震荡3～10min，然后以9000～13000r/min的转速离心1～3min，弃上清液留沉淀；二、向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂B，然后以9000～13000r/min的转速离心1～3min，重复离心1～4次后取沉淀，即完成线虫卵活体纯化提取剂的使用；其中步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成；其中试剂A由0.3～0.4g的氯化钠、1～1.5g的氢氧化钠、0.3～0.5g的磷酸氢二钠、1～1.5g的次氯酸钠、0.005～0.02g的硫酸镁、1～1.5g的氢氧化钾、0.1～0.3g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.3～0.4g的氯化钾、0.2～0.3g的氯化钠、2～3g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成；步骤一中试剂A的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫；步骤一中试剂B的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫。
本发明已在科研工作中进行了应用，通过对国家自然科学基金“线虫HSPs对重金属胁迫的响应机制”的研究中进行的实际操作，取得了较好的试验效果。本发明与传统的线虫虫卵获取方法相比，工作效率大幅度提高，线虫用量减少了50％。经过对提取虫卵的统计检验表明，虫卵获取率平均提高30％。线虫虫卵萌发率平均提高了20％以上。
本发明解决了传统的线虫虫卵获取方法中杂种培养、卵萌发率低、残体和杂菌干扰、工作量大、用时长、效率低的问题。本发明中的线虫卵活体纯化提取剂及提取方法以单种甚至单条成熟雌性线虫为裂解对象，短时间内可对成虫进行充分高效的裂解，而不伤及腹内虫卵。
本发明线虫卵活体纯化提取剂中的碱剂、氧化剂和缓冲剂比例适当，对线虫表皮和肌体进行充分裂解而不伤害虫卵，而虫卵获取率高达自然繁殖的60％。在线虫裂解过程中，成虫虫体裂解完全，对后期卵的孵化无干扰，解决了母体残留出现的腐烂、生长杂菌等情况；而对从成虫体内裂解出的虫卵损伤极小，虫卵孵化率达92.6％，与线虫自然产卵孵化率相当。传统方法对线虫的裂解需要过夜，本发明用时短，操作便捷，提高了线虫虫卵的获取效率和质量。
附图说明
图1为具体实施方式十一中每条成熟雌性线虫产卵个数的柱状图；图2为具体实施方式十一中获得线虫卵的萌发率的柱状图；图3为具体实施方式十二中每条成熟雌性线虫产卵个数的柱状图；图4为具体实施方式十二中获得线虫卵的萌发率的柱状图；图5为具体实施方式十三中每条成熟雌性线虫产卵个数的柱状图；图6为具体实施方式十三中获得线虫卵的萌发率的柱状图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成；其中试剂A由0.3～0.4g的氯化钠、1～1.5g的氢氧化钠、0.3～0.5g的磷酸氢二钠、1～1.5g的次氯酸钠、0.005～0.02g的硫酸镁、1～1.5g的氢氧化钾、0.1～0.3g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.3～0.4g的氯化钾、0.2～0.3g的氯化钠、2～3g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成；其中试剂A由0.3g的氯化钠、1g的氢氧化钠、0.3g的磷酸氢二钠、1g的次氯酸钠、0.005g的硫酸镁、1g的氢氧化钾、0.1g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.3g的氯化钾、0.2g的氯化钠、2g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成；其中试剂A由0.4g的氯化钠、1.5g的氢氧化钠、0.5g的磷酸氢二钠、1.5g的次氯酸钠、0.02g的硫酸镁、1.5g的氢氧化钾、0.3g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.4g的氯化钾、0.3g的氯化钠、3g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成；其中试剂A由0.33g的氯化钠、1.10g的氢氧化钠、0.40g的磷酸氢二钠、1.11g的次氯酸钠、0.01g的硫酸镁、1.34g的氢氧化钾、0.20g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.30g的氯化钾、0.25g的氯化钠、2.68g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式线虫卵活体纯化提取剂的使用方法如下：一、取同种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂A中，震荡3～10min，然后以9000～13000r/min的转速离心1～3min，弃上清液留沉淀；二、向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂B，然后以9000～13000r/min的转速离心1～3min，重复离心1～4次后取沉淀，即完成线虫卵活体纯化提取剂的使用；其中步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成，试剂A由0.3～0.4g的氯化钠、1～1.5g的氢氧化钠、0.3～0.5g的磷酸氢二钠、1～1.5g的次氯酸钠、0.005～0.02g的硫酸镁、1～1.5g的氢氧化钾、0.1～0.3g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.3～0.4g的氯化钾、0.2～0.3g的氯化钠、2～3g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成；步骤一中试剂A的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫；步骤一中试剂B的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中震荡3min，然后以9000r/min的转速离心3min。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中震荡10min，然后以13000r/min的转速离心1min。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中震荡4～9min，然后以10000～12000r/min的转速离心1.5～2.5min。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中震荡5min，然后以11000r/min的转速离心2min。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成，试剂A由0.35g的氯化钠、1.3g的氢氧化钠、0.38g的磷酸氢二钠、1.4g的次氯酸钠、0.015g的硫酸镁、1.2g的氢氧化钾、0.2g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.35g的氯化钾、0.25g的氯化钠、2.5g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成。其它与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式线虫卵活体纯化提取剂的使用方法如下：一、取同种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂A中，震荡5min，然后以13000r/min的转速离心2min，弃上清液留沉淀；二、向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂B，然后以13000r/min的转速离心2min，重复离心2次后取沉淀，即完成线虫卵活体纯化提取剂的使用；其中步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成，试剂A由0.33g的氯化钠、1.1g的氢氧化钠、0.4g的磷酸氢二钠、1.11g的次氯酸钠、0.01g的硫酸镁、1.34g的氢氧化钾、0.2g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.3g的氯化钾、0.25g的氯化钠、2.68g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成；步骤一中试剂A的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫；步骤一中试剂B的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫。
本实施方式中结果如图1所示，线虫表皮和肌体充分裂解，虫卵获取率高达自然繁殖的60％；在线虫裂解过程中，成虫虫体裂解完全，对后期卵的孵化无干扰，解决了母体残留出现的腐烂、生长杂菌等情况；而对从成虫体内裂解出的虫卵损伤极小，虫卵孵化率达92.6％，与线虫自然产卵孵化率相当(见图2)。
具体实施方式十二：本实施方式线虫卵活体纯化提取剂的使用方法如下：一、取同种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂A中，震荡10min，然后以13000r/min的转速离心3min，弃上清液留沉淀；二、向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂B，然后以13000r/min的转速离心3min，重复离心4次后取沉淀，即完成线虫卵活体纯化提取剂的使用；其中步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成，试剂A由0.35g的氯化钠、1.2g的氢氧化钠、0.4g的磷酸氢二钠、1.2g的次氯酸钠、0.01g的硫酸镁、1.2g的氢氧化钾、0.2g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.35g的氯化钾、0.25g的氯化钠、2.5g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成；步骤一中试剂A的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫；步骤一中试剂B的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫。
本实施方式中结果如图3所示，线虫表皮和肌体充分裂解，虫卵获取率高达自然繁殖的60％；在线虫裂解过程中，成虫虫体裂解完全，对后期卵的孵化无干扰，解决了母体残留出现的腐烂、生长杂菌等情况；而对从成虫体内裂解出的虫卵损伤极小，虫卵孵化率达92.6％，与线虫自然产卵孵化率相当(见图4)。
具体实施方式十三：本实施方式线虫卵活体纯化提取剂的使用方法如下：一、取同种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂A中，震荡8min，然后以13000r/min的转速离心3min，弃上清液留沉淀；二、向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂B，然后以9000r/min的转速离心3min，重复离心3次后取沉淀，即完成线虫卵活体纯化提取剂的使用；其中步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成，试剂A由0.33g的氯化钠、1.1g的氢氧化钠、0.4g的磷酸氢二钠、1.11g的次氯酸钠、0.01g的硫酸镁、1.34g的氢氧化钾、0.2g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.3g的氯化钾、0.25g的氯化钠、2.68g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成；步骤一中试剂A的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫；步骤一中试剂B的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫。
本实施方式中结果如图5所示，线虫表皮和肌体充分裂解，虫卵获取率高达自然繁殖的60％；在线虫裂解过程中，成虫虫体裂解完全，对后期卵的孵化无干扰，解决了母体残留出现的腐烂、生长杂菌等情况；而对从成虫体内裂解出的虫卵损伤极小，虫卵孵化率达92.6％，与线虫自然产卵孵化率相当(见图6)。
Claims (5)
1.线虫卵活体纯化提取剂，其特征在于线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成；其中试剂A由0.3～0.4g的氯化钠、1～1.5g的氢氧化钠、0.3～0.5g的磷酸氢二钠、1～1.5g的次氯酸钠、0.005～0.02g的硫酸镁、1～1.5g的氢氧化钾、0.1～0.3g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.3～0.4g的氯化钾、0.2～0.3g的氯化钠、2～3g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成。
2.根据权利要求1所述的线虫卵活体纯化提取剂，其特征在于线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成；其中试剂A由0.33g的氯化钠、1.10g的氢氧化钠、0.40g的磷酸氢二钠、1.11g的次氯酸钠、0.01g的硫酸镁、1.34g的氢氧化钾、0.20g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.30g的氯化钾、0.25g的氯化钠、2.68g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成。
3.权利要求1所述的线虫卵活体纯化提取剂的使用方法，其特征在于线虫卵活体纯化提取剂的使用方法如下：一、取同种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂A中，震荡3～10min，然后以9000～13000r/min的转速离心1～3min，弃上清液留沉淀；二、向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂B，然后以9000～13000r/min的转速离心1～3min，重复离心1～4次后取沉淀，即完成线虫卵活体纯化提取剂的使用；其中步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成，试剂A由0.3～0.4g的氯化钠、1～1.5g的氢氧化钠、0.3～0.5g的磷酸氢二钠、1～1.5g的次氯酸钠、0.005～0.02g的硫酸镁、1～1.5g的氢氧化钾、0.1～0.3g的磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成；试剂B由0.3～0.4g的氯化钾、0.2～0.3g的氯化钠、2～3g的磷酸钠和100mL的蒸馏水组成；步骤一中试剂A的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫；步骤一中试剂B的用量为1mL处理100只同种成熟雌性线虫。
4.根据权利要求3所述的线虫卵活体纯化提取剂的使用方法，其特征在于步骤一中震荡4～9min，然后以10000～12000r/min的转速离心1.5～2.5min。
5.根据权利要求3所述的线虫卵活体纯化提取剂的使用方法，其特征在于步骤一中震荡5min，然后以11000r/min的转速离心2min。
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