CN104288236A - 一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，是将功能微生物的二级菌种接种于双黄连组方发酵液中，利用功能微生物的生命活动，在常温、常压下进行液体深层高密度发酵，将双黄连组方中有效成分充分有效地溶出和转化，而制成的双黄连口服液生物制剂。本发明同时也提供了该兽用双黄连口服液制剂的制备方法。本发明筛选了双黄连组方作为中药组方，并利用功能微生物-嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母将双黄连组方中所含的抗菌、抗病毒及解热的活性成分最大限度地提取出来,增强了疗效，同时，嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母能起到维护和调整动物胃肠道菌群平衡的作用。

Description

一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用中药制剂，具体涉及一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，同时涉及制备方法。

背景技术

中草药饲料添加剂是指根据我国传统的中医理论，而在饲料中加入的一些具有益气健脾、消食开胃、补气养血的天然中草药。能够促进动物生长发育，提高生产性能，增强机体免疫机能，提高动物抗应激、抗疾病能力，且具有无残留、不易产生耐药性和毒副作用。

双黄连为纯中药制剂,由黄芩、金银花、连翘三味中药组方而成,方中金银花性甘寒，芳香疏散,善清肺经热邪,为君药；黄芩性苦寒,善清肺火及上焦之的实热；连翘性苦微寒,疏散上焦风热,并有清热解毒功效,为臣药。三药共用,共奏辛凉解表、清热解毒之功效。双黄连制剂己被广泛应用于兽医临床上如犬、猪、鸡、羊治疗各种细菌性、病毒性疾病及感冒发热等,均取得了明显的疗效。连翘苷和黄芩苷作为其主要有效成分之一。

黄芩中抗病毒的活性成分主要是黄酮苷元。金银花、连翘中含有大量的挥发油，对抗病毒有很好的疗效，但是三味中药的提取工艺都是沿用原地方标准的水煮液再沉淀的方法,造成大量挥发性成分以及热不稳定成分的损失。

中药苷类成分因其重要的生理活性越来越受到重视。苷,又称配糖体,是由糖或糖的衍生物的半缩醛羟基与另一非糖物质中的羟基以缩醛键脱水缩合而成的环状缩醛衍生物,水解后能生成糖与非糖化合物,非糖部分称为苷元，苷类药物的药效是由苷元决定的。

苷类成分在肠道内难以吸收、生物利用度低、肠内滞留时间较长,在动物体内难以直接发挥药效作用,因此绝大多数需经肠道微生物分解为苷元而发挥疗效。

微生物有着非常强大的分解转化物质的能力,并能产生丰富的次生代谢产物。微生物能在常温、常压等较为温和的条件下进行苷的转化,可以比一般的物理或化学的炮制手段更大幅度地改变药性，能最大限度保护中药化学成分免遭破坏。同时，有利于环境的保护,降低生产成本。在发酵过程中,植物组织内大多数有效成分也充分有效地溶出和转化,大幅度提高了其含量。

但是，现在抗生素的滥用已经严重损害了动物体内的正常肠道菌群,使肠道菌群失去平衡,不能正常分泌糖苷酶。因此，不能有效地对摄入体内的糖苷进行分解代谢,导致双黄连制剂中主要有效成分苷类物质的难以有效吸收,最终达不到其应有的疗效。

目前也有不少采用微生物对动物的饲料进行处理的文献。例如，专利号为200810151212.4、专利名称为“双黄连口服液的中药生物制剂及其制备方法”的中国专利中，公开了“将EM原露接种到双黄连口服液中，在10-30℃和光照条件下发酵1-5个月，进而对药液进行分离，提取，精制，灭菌，制成各种剂型”。其中，EM原露包含芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌、光和细菌。但是，这种方法的缺陷在于：采用的发酵条件与动物消化系统的环境相差较大，因此，而且EM原露内含有的微生物随试剂进入动物消化系统后，会对其自身的发酵环境带来影响。还有专利申请号为200810230649.7、专利名称为“用多菌种发酵生产畜禽用微生态中药制剂及发酵方法”，以及专利申请号为200610069628.2、专利名称为“饲用酵解中草药制剂的制备方法”的中国专利，也均涉及到了利用微生物对兽用的中药制剂进行发酵。但是，这两种方法主要是针对兽用的中药制剂进行，其中的中药制剂含有多味中草药，但是，本领域的技术人员应该知晓，像上述两种中药制剂，一方面是成本极高，另一方面微生物在发酵时，除了产生某些有益成分，同时也会产生一些不利于动物自身消化系统的成分，例如决明子中就主要含有大黄酚、大黄素等化合物，长期服用可引起肠道病变；同时，以上两种方法都是利用一级微生物菌种对中药材进行发酵后直接饲养动物，一级微生物菌种对动物消化系统自身菌落的破坏力极强，很容易导致动物消化系统自身菌群失衡。

因此，很有必要从中药材、菌种的筛选、菌种的培养方面入手，创造性的开发一种在保持并增强原有双黄连口服液药效的基础上兼有维护和调整动物胃肠道菌群平衡作用的方法，以解决传统方法的缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂及其制备方法，其在保持并增强原有双黄连口服液药效的基础上兼有维护和调整动物胃肠道菌群平衡的作用，从而消除上述背景技术中缺陷。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，是将功能微生物的二级菌种接种于双黄连组方发酵液中，利用功能微生物的生命活动，在常温、常压下进行液体深层高密度发酵，将双黄连组方中有效成分充分有效地溶出和转化，而制成的双黄连口服液生物制剂。

作为一种优选的技术方案，所述双黄连组方由重量比为(1-2):(1-2):(2-4)的黄芩、金银花、连翘组成。

作为一种更优选的技术方案，所述双黄连组方由重量比为1:1:2的黄芩、金银花、连翘组成。

作为一种优选的技术方案，所述每1000ml双黄连组方发酵液中含有黄芩25g、金银花25g、连翘50g。

作为一种优选的技术方案，所述功能微生物是嗜酸乳杆菌ACCC00160和产朊假丝酵母ACCC20060，均来源于中国农业微生物菌种保藏中心。

以下提及的嗜酸乳杆菌和产朊假丝酵母均优选上述两种。

所述兽用双黄连口服液制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)双黄连中药粉制备：黄芩、金银花、连翘按双黄连组方重量比混合均匀，粉碎过筛；

(2)嗜酸乳杆菌一级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基高温高压灭菌；冷却后在无菌条件下接种嗜酸乳杆菌菌种，于摇床中培养，即得嗜酸乳杆菌一级菌种；

(3)产朊假丝酵母一级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基高温高压灭菌；冷却至后在无菌条件下接种产朊假丝酵母菌种，于摇床中培养，即得产朊假丝酵母一级菌种；

(4)嗜酸乳杆菌二级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基高温高压灭菌；冷却后在无菌条件下接种步骤(2)得到的嗜酸乳杆菌一级菌种，于摇床中培养，即得嗜酸乳杆菌二级菌种；

(5)产朊假丝酵母二级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基高温高压灭菌；冷却至后在无菌条件下接种步骤(3)得到的产朊假丝酵母一级菌种，于摇床中培养，即得产朊假丝酵母二级菌种；

(6)益生菌炮制双黄连复合液体生物中药制剂制备：向步骤(1)制备的双黄连中药粉中注入过滤除菌后的洁净温水，制成双黄连组方发酵液，并向所述双黄连组方发酵液中分别接种步骤(4)制备的嗜酸乳杆菌二级菌种和步骤(5)制备的产朊假丝酵母二级菌种，培养后，即得到利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂。

作为一种优选的技术方案，所述兽用双黄连口服液制剂的制备方法，详细步骤如下：

(1)双黄连中药粉制备：黄芩、金银花、连翘按重量比(1-2):(1-2):(2-4)混合均匀，粉碎过40-80目筛；

(2)嗜酸乳杆菌一级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基装入容器中，并在120-125℃、7.84-8.8MPa灭菌15-25min，冷却至35-45℃后无菌条件下接种筛选的嗜酸乳杆菌试管菌种，于摇床在35-45℃、100-120r/min的条件下培养45-52h，即得嗜酸乳杆菌一级菌种；

(3)产朊假丝酵母一级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基装入容器中，并在120-125℃、7.84-8.8MPa下灭菌15-25min，冷却至25-35℃后无菌条件下接种筛选的产朊假丝酵母试管菌种，于摇床在25-33℃、100-120r/min的条件下，培养45-53h，即得产朊假丝酵母一级菌种；

(4)嗜酸乳杆菌二级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基装入容器中，并在120-125℃、7.84-8.8MPa灭菌15-25min，冷却至40-50℃后无菌条件下接种步骤(2)得到的嗜酸乳杆菌一级菌种，于摇床在35-45℃、100-120r/min的条件下培养35-37h，即得嗜酸乳杆菌二级菌种；

(5)产朊假丝酵母二级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基装入容器中，并在120-125℃、7.84-8.8MPa灭菌15-25min，冷却至28-32℃后无菌条件下接种步骤(3)得到的产朊假丝酵母一级菌种，于摇床在28-30℃、100-120r/min的条件下培养35-37h，即得产朊假丝酵母二级菌种；

(6)益生菌炮制双黄连复合液体生物中药制剂制备：向步骤(1)制备的双黄连中药粉中注入过滤除菌后的洁净温水，制成双黄连组方发酵液，保证每1000ml双黄连组方发酵液中含有黄芩25g、金银花25g、连翘50g，并向所述双黄连组方发酵液中分别接种步骤(4)制备的嗜酸乳杆菌二级菌种和步骤(5)制备的产朊假丝酵母二级菌种，保证双黄连组方发酵液、嗜酸乳杆菌二级菌种和产朊假丝酵母二级菌种的体积比为(33-30)：1：1，在32-38℃下培养100-150天，即得到利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，再将得到的兽用双黄连口服液制剂过滤后灌装。

上述制备方法，作为一种优选的技术方案，所述嗜酸乳杆菌液体菌种培养基中，含双黄连中药粉10-15g/L、柠檬酸二铵1-3g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、Tween801-3g/L、三水乙酸钠3-8g/L。

上述制备方法，作为一种优选的技术方案，所述产朊假丝酵母液体菌种培养基中，含双黄连中药粉3-5g/L、玉米粉2-4g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸镁1-1.5g/L。

作为一种更优选的技术方案，所述兽用双黄连口服液制剂的制备方法，详细步骤如下：

(1)双黄连中药粉制备：黄芩、金银花、连翘按重量比1:1:2混合均匀，粉碎过60目筛；

(2)嗜酸乳杆菌液体菌种培养基：双黄连中药粉10g/L、柠檬酸二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、Tween80 2g/L、三水乙酸钠5g/L；

(3)嗜酸乳杆菌一级菌种制备：500ml三角瓶装入嗜酸乳杆菌液体菌种培养基300ml，121℃8.0MPa灭菌20min；冷却至40℃后无菌条件下接种筛选保存的嗜酸乳杆菌试管菌种，于摇床40℃、110r/min培养48h，即得嗜酸乳杆菌一级菌种；

(4)产朊假丝酵母液体菌种培养基：双黄连中药粉4g/L、玉米粉3g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁1g/L；

(5)产朊假丝酵母一级菌种制备：500ml三角瓶装入产朊假丝酵母液体菌种培养基300ml，121℃8.0MPa灭菌20min；冷却至30℃后无菌条件下接种筛选保存的产朊假丝酵母试管菌种，于摇床29℃、110r/min培养48h即得产朊假丝酵母一级菌种；

(6)嗜酸乳杆菌二级菌种制备：500ml三角瓶装入嗜酸乳杆菌液体菌种培养基300ml，121℃8.0MPa灭菌20min；冷却至45℃后无菌条件下接种步骤(3)得到的嗜酸乳杆菌一级菌种，于摇床40℃，110r/min，培养36h，即得嗜酸乳杆菌二级菌种；

(7)产朊假丝酵母二级菌种制备：500ml三角瓶装入产朊假丝酵母液体菌种培养基300ml，121℃8.0MPa灭菌20min；冷却至30℃后无菌条件下接种步骤(5)得到的产朊假丝酵母一级菌种，于摇床29℃，110r/min，培养36h即得产朊假丝酵母二级菌种；

(8)益生菌炮制双黄连复合液体生物中药制剂制备：1000L全自动液体发酵罐中加入步骤(1)制备的双黄连中药粉，注入940L过滤除菌后的洁净温水，保证每1000ml双黄连组方发酵液中含有黄芩25g、金银花25g、连翘50g，然后分别接种嗜酸乳杆菌二级菌种30L、产朊假丝酵母二级菌种30L,35℃培养120天，即得到利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂；

(9)将得到的兽用双黄连口服液制剂过滤后灌装，得到每ml液体含以下成分分别不低于：黄芩苷6.72mg、黄芩素0.82mg、汉黄芩素0.56mg、连翘苷0.27mg、绿原酸0.69mg的兽用双黄连口服液制剂。

本发明中，采用的中药组方为双黄连组方，其中，

金银花中含有忍冬花含绿原酸、异绿原酸、白果醇、β-谷甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇-D-葡萄糖甙、豆甾醇-D-葡萄糖甙等成分，主要的药理作用如下：1.抗病原微生物作用：体外实验表明，花和藤对多种致病菌如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌等均有一定抑制作用，对肺炎球菌、脑膜炎双球菌、绿脓杆菌，结核杆菌亦有效。水浸剂比煎剂作用强，叶煎剂比花煎剂作用强。若和连翘合用，抗菌范围还可互补；与青霉素合用，能加强青霉素对耐药金黄色葡萄球菌的抗菌作用，这可能是在抑制细菌体内蛋白质合成上有协同的作用。有人认为绿原酸和异绿原酸是金银花主要的抗菌有效成分。另有实验证明木犀草素也有较强的抗菌作用。本品水浸剂在体外对铁锈色小芽胞癣菌、星形奴卡氏菌等皮肤真菌有不同程度的抑制作用。金银花水煎剂(1：20)在人胚肾原单层上皮细胞组织培养上，对流感病毒、孤儿病毒、疱疹病毒有抑制作用。藤的水溶液也有延缓孤儿病毒所致的细胞致病的作用。试管实验表明金银花及其藤的煎剂，对钩端螺旋体均有抑制作用。用忍冬藤和千里光配伍，作腹腔注射和皮下注射，据称有治疗兔和预防钩藤螺旋体病的效果。腹腔注射金银花注射液7.5g/kg，能使接受LD90的绿脓杆菌内毒素或绿脓杆菌的小鼠存活半数以上。静脉注射金银花蒸馏液6g/kg，对绿脓杆菌内毒素中毒的兔有治疗作用。未治疗的动物体温和白细胞总数明显下降，白细胞有核左移现象而给药组动物体温略有升高，白细胞虽有增加但分类没有明显变化，且静脉注射给予金黄注射液(金银花黄芩等量制成)7.5g/kg，对家兔绿脓杆菌内毒素中毒也有一定对抗作用，可减轻中毒症状和死亡数。2.抗炎和解热作用：腹腔注射金银花提取液0.25g/kg，能抑制大鼠角叉菜胶性脚肿。另有报道金银花注射液30-40g/kg能减轻蛋清性脚肿程度。腹腔注射金银花提取液8g/kg，2次/天，连续6天，对大鼠巴豆油性肉芽囊，也有明显抗渗出和抗增生的作用。早期报道金银花具有明显的解热作用，但用霍乱菌苗、马铃薯杆菌、枯草浸液等给家兔耳静脉注射，致热，未证实金银花煎剂5g/kg灌胃有退热作用，认为这可能和使用的金银花制剂、剂量或家兔的耐受性不同有关。3.加强防御机能作用：金银花煎剂稀释至1：1280的浓度，仍能促进白细胞的吞噬功能。小鼠腹腔注射金银花注射液，也有明显促进炎性细胞吞噬功能的作用。4.中枢兴奋作用：经电休克、转笼等多种实验方法证明口服绿原酸后，可引起大鼠、小鼠等动物中枢神经系统兴奋，其作用强度为咖啡因的1/6，二者合用无相加及增强作用。5.降血脂作用：大鼠灌胃金银花2.5g/kg能减少肠内胆固醇吸收，降低血浆中胆固醇含量。体外实验也发现金银花可和胆固醇相结合，但四妙勇安汤(金银花、玄参、当归、甘草)治疗家兔实验性动脉粥样硬化。未观察到有降血脂和主动脉壁胆固醇含量的作用。6.抗内毒素：用鲎试验法测定内毒素含量，300％金银花(忍冬)注射液以1：2-1：64稀释，体外试验无论用凹片法或试管法，均明显降低试液中的内毒素含量，其中1：2-1：8的稀释管与阴性对照管一样呈液态，阳性对照呈凝胶状。金银花(忍冬)蒸馏液6g/kg静脉注射，对绿脓杆菌内毒互2.8mg/kg静脉注射引起的兔体温下降及白细胞数下降有对抗作用，金银花(忍冬)蒸馏液7.5g/kg或注射液2.5g/kg腹腔注射，对绿脓杆菌内毒素65mg/kg腹腔注射的小鼠有保护作用，减少小鼠死亡率。

黄芩中含有黄芩素、黄芩新素、黄芩甙、汉黄芩素、汉黄芩甙、木蝴蝶素A等，主要有以下药理作用：1.抗菌作用：黄芩煎剂100％浓度，平板法试验，对痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、溶血性琏球菌(a，B)、肺炎双球菌、白喉杆菌等有抑制作用。黄芩煎剂试管法试验1：1280浓度可抑制伤寒杆菌、溶血性链球菌a，1：640浓度抑制溶血性链球菌B，肺炎双球菌及福氏痢疾杆菌、人结核杆菌H37，1：320浓度可抑制霍乱弧菌、志贺氏痢疾杆菌；1：80浓度时宋内氏痢疾杆菌有抑制作用。黄芩醇浸液0.5g/ml或0.05g/ml，用琼脂斜面培养，药液与培养基1：1混合，对绿脓杆菌有抑制作用。黄芩醇浸液2g/ml浓度，平皿法试验对大肠杆菌、桔草杆菌、金黄色葡萄球菌有抑制作用。黄芩煎剂、醇提剂1g/ml浓度，用平板法试验时对脑膜炎球菌均有抑作用。2.抗真菌作用：黄芩煎液，试管斜面法试验4％浓度抑制狗小牙胞菌及堇色毛癣菌，8％浓度抑制许兰氏黄癣菌，10％浓度抑制许兰氏黄癣菌蒙古变种，15％浓度抑制共心性毛癣菌及铁锈色毛癣菌。黄芩水浸剂1：3浓度在试管内对堇色毛癣菌、同心性毛癣菌，许兰氏黄癣菌、奥杜盎氏小芽胞癣菌、羊毛样小芽胞癣菌、红色表皮癣菌、K、W、氏表皮癣菌、星形奴卡氏菌等有不同程度抑菌作用。3.抗病毒作用：黄芩煎剂25-100％浓度，体外试验对乙型肝炎病毒DNA复制有抑制作用。4.抗炎抗变态反应：黄芩70％乙醇提取物200，500mg/kg灌胃黄芩素、黄芩甙、汉黄芩素50，100mg/kg灌胃，可抑制醋酸引起的小鼠腹腔渗出增加，对48/80(一种化合物名称，Sigma生产)引起的大鼠足肿也有抑制作用，黄芩70％乙醇提取物500mg/kg灌胃，黄芩素、黄芩甙及汉黄芩素100mg/kg灌胃对大鼠佐剂性关节炎有抑制作用。黄芩水提物100，200mg/kg灌胃，对大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)有抑制作用，但对氯化苦引起的小鼠接触皮炎(耳肿胀)无明显影响。黄芩抑制被动皮肤过敏反应(PCA)的有效成分为黄芩甙及黄芩素。黄芩甙、黄芩素对实验性气喘有效，黄芩甙10-4g/ml浓度可抑制豚鼠气管Schultz-Dale反应38％，并有抗组胺，抗胆碱及罂粟碱样作用。黄芩素不溶于水，其两个水溶性衍生物黄芩素-6-磷酸二钠(BPS)及黄芩素-6-硫酸二钠(BSS)于抗原攻击前5mg/kg静脉注射，对大鼠PCA有抑制作用；10mg/kg静脉注射于抗原攻击前10分钟给药，对豚鼠过敏性气喘有抑制作用；BPS及BSS于10-4g/ml浓度对离体豚鼠肠管及气管chultz-Dale反应均有抑制作用；BPS及BSS 5mg/kg静脉注射，对大鼠反向皮肤过敏反应(RCA)有抑制作用；5-10mg/kg静脉注射也抑制Forssman皮肤血管炎，但对Arthus反应无明显影响。黄芩素及BPS结构上与抗过敏药色甘酸二钠(DSCG)相类似，但DSCG为双色酮类，黄芩素及BPS为单色酮类，DSCG对反应素(Reagin)抗体介导的过敏反应有高度特异性，而对非反应素(IgG)抗体介导的过敏反应几无作用，PBS则不仅抑制反应素抗体介导的过敏反应，如PBS10-6-10-4g/ml抑制抗原引起的猴肺介质释放，PBS 200mg/kg腹腔注射抑制大鼠同种PCA，10-4g/ml抑制反应素抗体介导的大鼠肥大细胞脱颗粒等，也抑制非反应素抗体介导的反应，如BPS10-4g/ml可抑制卵白蛋白致敏豚鼠肺释放介质及抑制抗IgE抗体引起的人肺释放过敏介质，认为DSCG分子中两个色酮核间有一定距离，可结合于反应素抗体功能位置上，而不适合于非反应素抗体，但单色酮的黄芩素或BPS可以两个分子结合于这两种抗体上。黄芩素对大鼠血小板花生四烯酸代谢中环氧酶与脂氧酶均有抑制作用，对脂氧酶更具选择性，其IC50为0.12μm，而对环氧的IC50为6917倍于脂氧酶。黄芩素对大鼠白细胞可抑制花生四烯酸代谢，抑制脂氧酶代谢产物5-羟基二十碳四烯酸(5-HETE)及环氧酶代谢产物12-羟基十七碳三烯酸(HHT)的生成，其IC50分别为7.13±0.767μm及5.53±16.9μm；黄芩甙对白细胞5-HETE形成也抑制，但不抑制HHT的形成；汉黄芩素抑制HHT的形成，IC50为14.6±3.51μm黄芩成分对化合物48/80刺激大鼠腹腔肥大细胞释放组胺的抑制作用，黄芩素的IC50为52.1μm，黄芩甙IC50为＞200μm，汉黄芩素的IC50为40.0μm，汉黄芩素-7-O-D葡萄糖醛酸的IC50为140.0mol/l，(25)2'，5，6'，7-四羟黄烷酮的IC50为17.7μm，(2R，3R)-2'，3，5，6'，7-五羟黄烷酮的IC50为15.5μm，白杨素(Chrysin)的IC50＞200μm，黄芩新素Ⅱ(Skullcapflavon Ⅱ)的IC50为15.0μm。黄芩甙10，100mg/ml，对钙离子载体A23187诱导的大鼠腹腔巨噬细胞产生PGE2及TXA2均有明显抑制作用。5.对中枢神经系统的作用：黄芩煎剂4g/kg腹腔注射，对小鼠防御性条件反射可使阳性反射时延长，而对非条件反射及分化无影响，说明黄芩可加强皮层抑制过程。黄芩煎剂2g/kg，对伤寒混合疫苗致热家兔有解热作用。但也有报道黄芩水煎剂或酒浸剂5-9g/只灌胃，或2g/只im，均不能证明黄芩对伤寒疫苗致热家兔有解热作用。6.对心血管的作用：黄芩醇提液1g/kg静脉注射，可使麻醉犬血压下降。黄芩煎剂0.06g/kg静脉注射，对麻醉犬有明显降压作用。黄芩素20mg/kg静脉注射，可使麻醉犬血压下降40-50％。黄芩浸剂灌胃/kg灌胃，3次/天，连续4周，使慢性肾性高血压犬血压下降，心率变慢。黄芩甙2×10^(-4)mol/l，在豚鼠离体主动脉条、肺动脉条、气管条及右心房均有竞争性的拮抗肾上腺素，去甲肾上腺素及多巴胺引起的收缩作用，也拮抗异丙肾上腺素舒张气管和增加右心房自发频率作用，提示黄芩甙对a，B1，B2受体均有阻断作用。7.抗血小板聚集及抗凝：黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、黄芩黄酮Ⅱ及白杨素(chrysin)于浓度1.0mM时，均可抑制胶原诱导的大鼠血小板聚集，白杨素对ADP诱导的血小板聚集也有抑制作用，黄芩素及汉黄芩素对花生四烯酸诱导的血小板聚集也有抑制作用，黄芩素及黄芩甙对凝血酶诱导的纤维蛋白原转化为纤维蛋白也抑制；黄芩素及黄芩甙20，50mg/kg灌胃，对内毒素诱导的大鼠弥漫性血管内凝血，可以防止血小板及纤维蛋白原含量的降低。8.降血脂作用：黄芩水浸液10％2ml/只灌胃，连续给药7周，可使胆固醇喂饲的家兔血清胆固醇含量下降。黄芩素、黄芩甙100mg/kg灌胃，可降低实验性高血脂大鼠玉米油-胆固醇-胆酸喂饲血清游离脂肪酸、甘油三酯及肝甘油三酯的含量，黄芩黄酮Ⅱ100mg/kg灌胃，可降低血清总胆固醇及肝甘油三酯的含量，增加血清高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-ch)的含量，汉黄芩素100mg/kg灌胃，可防止肝甘油三酯的沉积并增加血清HDL-ch的含量。黄芩素、黄芩甙100mg/kg灌胃，对乙醇引起的高血脂大鼠，可降低肝总胆固醇、游离胆固醇及甘油三酯含量，汉黄芩素能降低血清甘油三酯的水平，黄芩素能增加血清HDL-ch含量。9.保肝、利胆、抗氧化：黄芩甲醇提取物1000mg/kg腹腔注射，对异硫氰酸萘酯(ANIT)引起的大鼠肝损害有抑制作用，可抑制血清胆红素的增加。黄芩醇提物50，100mg/kg，黄芩甙50，100mg/kg灌胃，对家兔有利胆作用。汉黄芩素10^(-4)-10^(-6)mol/l浓度体外试验，对大鼠肝微粒体脂质过氧化有抑制作用，使丙二醛(MDA)含量下降。黄芩素及黄芩甙2.5×10^(-4)mol/l，1.0×10^(-4)mol/l，汉黄芩素2.5×10^(-4)mol/l，黄芩黄酮Ⅱ2.5×10^(-4)mol/l，汉黄芩素-7-O-D葡萄糖醛酸2.5×10^(-4)mol/l，1.0×10^(-4)mol/l，对FeC1₂维生素C-ADP混合物诱导的大鼠肝匀浆脂质过氧化有抑制作用，使肝MDA的形成显着下降，对NADPH-ADP引起的脂质过氧化也抑制。

连翘中含有连翘甙、连翘甙元、右旋松脂酚、右旋松脂醇葡萄糖甙等，主要的药理作用为：1.抗菌、抗病毒作用1.1.抗细菌作用：将连翘种子挥发油乳剂以试管倍量稀释法进行抗菌试验，结果显示该药除对绿脓杆菌作用稍低外，对其它10株革兰氏阳性和阴性细菌均有较强的抗菌作用。其中对金黄色葡萄球菌的作用最强(抗菌效价为1/1.024)；其次为肺炎球菌；甲、乙型链球菌；卡他奈氏球菌；福氏痢疾杆菌；甲型副伤寒杆菌；(抗菌效价均为1/512)和大肠杆菌(抗菌效价为1/256)，对肺炎杆菌、普通变形杆菌抗菌效价均为1/28。选取对所试菌有抗菌作用之试验液，进行再传代培养试验，结果显示连翘种子挥发油对所试细菌的抗菌作用较为彻底而且稳定。连翘浓缩煎剂在体外有抗菌作用，可抑制伤寒杆菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、白喉杆菌及霍乱弧菌、葡萄球菌、链球菌等。连翘在体外的抑菌作用与金银花大体相似；为银翘散中抗菌之主要成分。金银花对沙门氏菌属，特别是伤寒杆菌以及溶血性链球菌的抑制作用似超过连翘，而对痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌之抑制则以连翘似较好。二者联合使用，在试管中并无协同作用，与黄连、黄芩组成的复方，体外抑菌作用比单用连翘时据云更强。连翘中抗菌的有效成分研究不多，连翘酚在试营中对金黄色葡萄球菌的抑菌浓度为1：5120；对痢疾杆菌为1：1280；对白喉杆菌及副伤寒(甲)杆菌为1：640，可能力抗菌有效成分。花对小鼠实验性结核病有一定疗效，对豚鼠则无效。此外，还报告过它在试管中及临床上的抗结核杆菌的作用。连翘的醇提取物在体外有抗钩端螺旋体作用，其强度不及黄连、荔枝草或金银花、黄芩，而与黄柏、蚤休相似。连翘水浸剂(1：5)在试管内对星形奴卡氏菌有些抑制作用。1.2.抗真菌作用：将连翘种子挥发油乳剂以试管倍量稀释法进行抗白色和热带念珠菌的试验，结果显示该药对所试的二个菌株均有较明显的抗菌作用，其抗菌效价分别为1/1.024和1/512。1.3.抗病毒作用将连翘种子挥发油乳剂以鸡胚内法(药物浓度为1/32)和鸡胚外法进行抗亚洲甲型流感病毒和I型副流感病毒作用试验。可见连翘种子挥发油对京科68-1珠病毒在感染同时给药能显示作用，仙台株病毒在感染同时给药和感染前给药能显示作用。可以看出连翘种子挥发油乳剂在鸡胚外对京科68-1株和仙台株病毒均有显着的抗病毒作用。对所试两种病毒的抗病毒效价均为1/65，536。用斑点杂交法试验，连翘煎剂25％-100％浓度，有降低乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)含量的作用。2.对心血管系统的影响2.1.连翘注射液对中毒性休克时在体猫心的影响：实验用猫3只，腹腔麻醉，颈动脉插管测量血压，气管插管，连电动人工呼吸机，打开胸腔及心包，暴露心脏，用丝线将心尖联于微拉力传感仪，用三笔记录仪描记心脏舒缩曲线。实验前，先描记一段心肌舒缩波及血压曲线作为正常对照，然后静脉注射伤寒菌苗0.8-2.5ml/kg待出现较明显损害的心肌曲线(心肌舒缩波高低不齐，节律不整)，血压下降。静脉注射连翘注射液8g/kg后，心律变齐其中2只猫心肌舒缩波振幅增大，血压在30分钟后上升约40mmHg。提示有强心及升压作用。2.2.对毛细血管通透性的影响选健康小鼠雌雄不拘，体重18-22g，分为实验组和对照组，实验组7只动物，由尾静脉或皮下注射连翘注射液(60g/kg)，对照组9只动物，用生理盐水代替药物(0.4ml/只)。10分钟后经尾静脉注入0.5％伊文氏蓝液0.2ml/只。30分钟后，腹腔注射0.4％醋酸0.4ml/只。再30分钟后将小鼠脱血处死，打开腹腔用生理盐水冲洗腹腔渗出液，将洗出液置于5ml刻度试管至刻度，以2000转/分离心10分钟，取上清液测定其伊文氏蓝浓度。结果对照组腹腔渗出液伊文氏蓝浓度(μg％)为368.47±28.55(平均值±标准差，下同)，而实验组为160.12±28.37(P＜0.01)。表明连翘注射液对醋酸所致的毛细血管通透性有明显抑制作用。3.对离体小肠的抑制作用实验用豚鼠，按Magnur法作离体肠标本。离体小肠置于12×l0-2连翘营养液中，共做10次试验，结果4次表现为肠张力降低，6次先升后降。收缩振幅8次减弱，2次无变化。等容量生理盐水对离体肠无影响。提示连翘对豚鼠离体小肠有抑制作用。4.抑制弹性蛋白酶活力作用：连翘等稀释成每1ml含1.5g、0.75g及0.375g，3种浓度。猪胰弹性蛋白酶(PPE)稀释成19u/0.5mg·ml及9.5u/0.25mg·ml两种浓度。将19u/0.5mg·ml的酶液与上述不同浓度的药物分别等量混匀后，各取10μl，分别滴入琼脂板孔内，每一皿内均留两孔各滴10μl、9.5u/0.25mg.ml的酶液作酶溶解平行对照，37℃温育24小时后测量溶解环直径。(酶活力与溶解环直径成线性关系)。连翘抑制弹性蛋白酶活力的作用见表5。可见三种浓度的连翘均可显着抑制0.095u的PPE的酶活力(P＜0.001)，其中在7.5mg浓度时完全抑制PPE酶活力。连翘水溶性粗提物10^-3g/ml、10^-4g/ml对磷酸二脂酶有抑制作用。

另外，本发明采用的功能微生物是经过大量反复的试验，然后筛选出来的。其中，乳酸菌属于厌氧或兼性厌氧菌，是动物消化道尤其是家禽肠道的优势菌群。乳酸菌可利用糖类发酵产生大量乳酸,乳酸菌通过自身以及代谢产物与其他微生物之间的相互作用,调整菌群之间的关系。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属，嗜酸乳杆菌不仅在胃中，它还是人体小肠内的主要益生菌。嗜酸乳杆菌在肠道内发酵后，还可产生乳酸，能提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收，产生维生素K及维生素B，还可以减少胆固醇的吸收，提高动物的免疫力。产朊假丝酵母为兼性厌氧菌，在动物体内生长繁殖，能消耗肠道内的氧气形成厌氧环境，并代谢产生乳酸等有机酸，有利于乳酸菌等有益菌的生长，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长，从而改善胃肠道环境和菌群结构，促进胃肠对营养物质的消化、吸收和利用。

与传统双黄连的口服液不同的是,本发明利用有益微生物在常温、常压等较为温和的条件下将植物组织内大多数有效成分也充分有效地溶出和转化，大幅度提高了其含量。在保持并增强原有双黄连口服液药效的基础上兼有维护和调整动物胃肠道菌群平衡的作用，这种是通过促进有益菌的增殖和抑制有害菌的繁殖入侵两条途径来实现的,而抗生素则是直接通过抑菌杀菌来实现预防和治疗的,包括对有益菌的抑制杀灭。本发明利用功能微生物将三味中药中所含的抗菌、抗病毒及解热的活性成分最大限度地提取出来,增加产品中抗菌和抗病毒的成分,提高对细菌性和病毒性感染的疗效,本发明还利用微生物的生长代谢和生命活动,模仿肠道微生物转化苷的过程,建立体外微生物炮制模型，在体外把双黄连口服液制剂中主要药效成分—苷,转化为能被畜禽迅速吸收的有效成分—苷元。在体外实现苷类成分的转化,提高了双黄连制剂中苷元含量,增强了疗效。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、传统的炮制工艺中需要大量辅料才能成型，而且也造成了造成大量挥发性成分以及热不稳定成分的损失，中药有效利用率低。本发明利用微生物强大的分解能力，在常温、常压下可以将植物组织内大多数有效成分充分有效地溶出和转化,大幅度提高了其含量。比一般的物理或化学的炮制手段更大幅度地改变药性，能最大限度保护中药化学成分免遭破坏。同时，有利于环境的保护,降低生产成本。

2、苷类成分在肠道内难以吸收、生物利用度低、肠内滞留时间较长,在动物体内难以直接发挥药效作用。本发明利用微生物的生长代谢和生命活动,模仿肠道微生物转化苷的过程,建立体外微生物炮制模型，在体外把双黄连口服液制剂中主要药效成分—苷,转化为能被畜禽迅速吸收的有效成分—苷元。在体外实现苷类成分的转化,提高了双黄连制剂中苷元含量,增强了疗效。

3、本发明选用的有益微生物在以黄芩、金银花、连翘为底物的发酵过程中不仅有效的溶出和转化双黄连口服液的中的有效成分，嗜酸乳杆菌和产朊假丝酵母两种有益菌也得到大量增殖。嗜酸乳杆菌在肠道内定植，与肠粘膜细胞相互作用，密切结合构成了生物学屏障，阻止了致病菌的的侵入和定植，相当于自然免疫。

4.嗜酸乳杆菌在繁殖过程中不断产生乳酸，使发酵液中的pH值不断降低，最终达到pH3左右，可以有效阻止其它微生物侵入发酵液中，不加任何防腐剂即可有效保存2年以上时间。

综上所述，本发明筛选了双黄连组方作为中药组方，并利用功能微生物-嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母将双黄连组方中所含的抗菌、抗病毒及解热的活性成分最大限度地提取出来,增强了疗效，同时，嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母能起到维护和调整动物胃肠道菌群平衡的作用。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，是将功能微生物的二级菌种接种于双黄连组方发酵液中，利用功能微生物的生命活动，在常温、常压下进行液体深层高密度发酵，将双黄连组方中有效成分充分有效地溶出和转化，而制成的双黄连口服液生物制剂。

其中，所述功能微生物是嗜酸乳杆菌ACCC00160和产朊假丝酵母ACCC20060，均来源于中国农业微生物菌种保藏中心。

上述双黄连口服液制剂的制备方法如以下若干实施例。

实施例1

上述兽用双黄连口服液制剂的制备方法，步骤包括以下：

(1)双黄连中药粉制备：黄芩、金银花、连翘按重量比1:2:4混合均匀，粉碎过40目筛；

(2)嗜酸乳杆菌一级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基装入容器中，并在120℃、7.84MPa灭菌15min，冷却至35℃后无菌条件下接种筛选的嗜酸乳杆菌试管菌种，于摇床在35℃、100r/min的条件下培养45h，即得嗜酸乳杆菌一级菌种；

(3)产朊假丝酵母一级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基装入容器中，并在120℃、7.84MPa灭菌15min，冷却至25℃后无菌条件下接种筛选的产朊假丝酵母试管菌种，于摇床在25℃、100r/min的条件下，培养45h，即得产朊假丝酵母一级菌种；

(4)嗜酸乳杆菌二级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基装入容器中，并在120℃、8.8MPa灭菌15min，冷却至40℃后无菌条件下接种步骤(2)得到的嗜酸乳杆菌一级菌种，于摇床在35℃、100r/min的条件下培养35h，即得嗜酸乳杆菌二级菌种；

(5)产朊假丝酵母二级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基装入容器中，并在120℃、7.9MPa灭菌15min，冷却至28℃后无菌条件下接种步骤(3)得到的产朊假丝酵母一级菌种，于摇床在28℃、100r/min的条件下培养35h，即得产朊假丝酵母二级菌种；

(6)益生菌炮制双黄连复合液体生物中药制剂制备：向步骤(1)制备的双黄连中药粉中注入过滤除菌后的洁净温水，制成双黄连组方发酵液，保证每1000ml双黄连组方发酵液中含有黄芩25g、金银花50g、连翘100g，并向所述双黄连组方发酵液中分别接种步骤(4)制备的嗜酸乳杆菌二级菌种和步骤(5)制备的产朊假丝酵母二级菌种，保证双黄连组方发酵液、嗜酸乳杆菌二级菌种和产朊假丝酵母二级菌种的体积比为33：1：1，在32℃下培养100天，即得到利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，再将得到的兽用双黄连口服液制剂过滤后灌装。

上述制备方法，所述嗜酸乳杆菌液体菌种培养基中，含双黄连中药粉10g/L、柠檬酸二铵1g/L、磷酸氢二钾1g/L、Tween80 1g/L、三水乙酸钠3g/L。所述产朊假丝酵母液体菌种培养基中，含双黄连中药粉3g/L、玉米粉2g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁1g/L。

将得到的兽用双黄连口服液制剂过滤后灌装，得到每ml液体含以下成分分别不低于：黄芩苷6.72mg、黄芩素0.82mg、汉黄芩素0.56mg、连翘苷0.27mg、绿原酸0.69mg的兽用双黄连口服液制剂。

实施例2

兽用双黄连口服液制剂的制备方法，详细步骤如下：

(1)双黄连中药粉制备：黄芩、金银花、连翘按重量比1:1:2混合均匀，粉碎过60目筛；

(2)嗜酸乳杆菌液体菌种培养基：双黄连中药粉10g/L、柠檬酸二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、Tween802g/L、三水乙酸钠5g/L；

(3)嗜酸乳杆菌一级菌种制备：500ml三角瓶装入嗜酸乳杆菌液体菌种培养基300ml，121℃、8.0MPa灭菌20min；冷却至40℃后无菌条件下接种筛选保存的嗜酸乳杆菌试管菌种，于摇床40℃、110r/min培养48h，即得嗜酸乳杆菌一级菌种；

(4)产朊假丝酵母液体菌种培养基：双黄连中药粉4g/L、玉米粉3g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁1g/L；

(5)产朊假丝酵母一级菌种制备：500ml三角瓶装入产朊假丝酵母液体菌种培养基300ml，121℃、8.0MPa灭菌20min；冷却至30℃后无菌条件下接种筛选保存的产朊假丝酵母试管菌种，于摇床29℃、110r/min培养48h即得产朊假丝酵母一级菌种；

(6)嗜酸乳杆菌二级菌种制备：500ml三角瓶装入嗜酸乳杆菌液体菌种培养基300ml，121℃8.0MPa灭菌20min；冷却至45℃后无菌条件下接种步骤(3)得到的嗜酸乳杆菌一级菌种，于摇床40℃，110r/min，培养36h，即得嗜酸乳杆菌二级菌种；

(7)产朊假丝酵母二级菌种制备：500ml三角瓶装入产朊假丝酵母液体菌种培养基300ml，121℃8.0MPa灭菌20min；冷却至30℃后无菌条件下接种步骤(5)得到的产朊假丝酵母一级菌种，于摇床29℃，110r/min，培养36h即得产朊假丝酵母二级菌种；

(8)益生菌炮制双黄连复合液体生物中药制剂制备：1000L全自动液体发酵罐中加入步骤(1)制备的双黄连中药粉，注入940L过滤除菌后的洁净温水，保证每1000ml双黄连组方发酵液中含有黄芩25g、金银花25g、连翘50g，然后分别接种嗜酸乳杆菌二级菌种30L、产朊假丝酵母二级菌种30L,35℃培养120天，即得到利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂；

(9)将得到的兽用双黄连口服液制剂过滤后灌装，得到每ml液体含以下成分分别不低于：黄芩苷6.72mg、黄芩素0.82mg、汉黄芩素0.56mg、连翘苷0.27mg、绿原酸0.69mg的兽用双黄连口服液制剂。

实施例3

兽用双黄连口服液制剂的制备方法，步骤包括以下：

(1)双黄连中药粉制备：黄芩、金银花、连翘按重量比2:1:3混合均匀，粉碎过80目筛；

(2)嗜酸乳杆菌一级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基装入容器中，并在125℃、8.8MPa灭菌25min，冷却至45℃后无菌条件下接种筛选的嗜酸乳杆菌试管菌种，于摇床在45℃、120r/min的条件下培养52h，即得嗜酸乳杆菌一级菌种；

(3)产朊假丝酵母一级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基装入容器中，并在125℃、8.8MPa灭菌25min，冷却至35℃后无菌条件下接种筛选的产朊假丝酵母试管菌种，于摇床在33℃、120r/min的条件下，培养53h，即得产朊假丝酵母一级菌种；

(4)嗜酸乳杆菌二级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基装入容器中，并在125℃、7.84MPa灭菌25min，冷却至50℃后无菌条件下接种步骤(2)得到的嗜酸乳杆菌一级菌种，于摇床在45℃、120r/min的条件下培养37h，即得嗜酸乳杆菌二级菌种；

(5)产朊假丝酵母二级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基装入容器中，并在125℃、8.8MPa灭菌25min，冷却至32℃后无菌条件下接种步骤(3)得到的产朊假丝酵母一级菌种，于摇床在30℃、120r/min的条件下培养37h，即得产朊假丝酵母二级菌种；

(6)益生菌炮制双黄连复合液体生物中药制剂制备：向步骤(1)制备的双黄连中药粉中注入过滤除菌后的洁净温水，制成双黄连组方发酵液，保证每1000ml双黄连组方发酵液中含有黄芩50g、金银花25g、连翘75g，并向所述双黄连组方发酵液中分别接种步骤(4)制备的嗜酸乳杆菌二级菌种和步骤(5)制备的产朊假丝酵母二级菌种，保证双黄连组方发酵液、嗜酸乳杆菌二级菌种和产朊假丝酵母二级菌种的体积比为30：1：1，在38℃下培养150天，即得到利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，再将得到的兽用双黄连口服液制剂过滤后灌装。

上述制备方法，所述嗜酸乳杆菌液体菌种培养基中，含双黄连中药粉15g/L、柠檬酸二铵3g/L、磷酸氢二钾3g/L、Tween803g/L、三水乙酸钠8g/L，所述产朊假丝酵母液体菌种培养基中，含双黄连中药粉5g/L、玉米粉4g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸镁1.5g/L。

将得到的兽用双黄连口服液制剂过滤后灌装，得到每ml液体含以下成分分别不低于：黄芩苷6.72mg、黄芩素0.82mg、汉黄芩素0.56mg、连翘苷0.27mg、绿原酸0.69mg的兽用双黄连口服液制剂。

实施例4

化学成分研究。

利用HPLC(高效液相色谱法)对以下液体制剂的成分进行检测，检测范围主要是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷和绿原酸等对动物有显著疗效的成分，检测结果如下表。

下表中，制剂A为本发明技术方案制备的双黄连口服液制剂,制剂B为传统意义上的双黄连组方液体制剂，制剂C为单纯利用嗜酸乳杆菌ACCC00160处理的双黄连口服液制剂，制剂D为单纯利用产朊假丝酵母ACCC20060处理的双黄连口服液制剂，制剂E为采用EM原露处理的双黄连口服液制剂，制剂F为采用嗜酸乳杆菌(非ACCC00160)、产朊假丝酵母(非ACCC20060)处理的双黄连口服液制剂。

从上表中可以明显看到，采用本发明技术方案制备的双黄连口服液制剂，其黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷和绿原酸等对动物有显著疗效的成分含量大大高于(高10％左右)其他液体制剂，这也是发明人在此之前没有预料到的。

由此，也可以说明，当嗜酸乳杆菌ACCC00160、产朊假丝酵母ACCC20060联合对双黄连口服液制剂进行处理时，能够起到非常显著的协同作用，将双黄连组方中的成分有效释放。

实施例5

应用于肉鸡前期预防。

将进雏0—3天的肉鸡随机分成七组，每组100只，在饲养中加入液体制剂。

用法用量：混饮，本品1L兑水400kg，一日一次集中适用，连续3-5天。

针对肉鸡的前期受寒、大肠杆菌感染、感冒、采食量、整齐度情况进行对比统计。

其中，制剂A为本发明技术方案制备的双黄连口服液制剂,制剂B为传统意义上的双黄连组方液体制剂，制剂C为单纯利用嗜酸乳杆菌ACCC00160处理的双黄连口服液制剂，制剂D为单纯利用产朊假丝酵母ACCC20060处理的双黄连口服液制剂，制剂E为采用EM原露处理的双黄连口服液制剂，制剂F为采用嗜酸乳杆菌(非ACCC00160)、产朊假丝酵母(非ACCC20060)处理的双黄连口服液制剂，制剂G为采用嗜酸乳杆菌一级菌种、产朊假丝酵母一级菌种处理的双黄连口服液制剂。

结论：

采用本方法所处理的双黄连口服液，在育雏期到转群期，在抵抗大肠杆菌感染和抗寒方面均优于其他几种方法所制取的制剂，可保证试验鸡群的个体采食量和整齐度保持在同一水平，保证肉鸡整群质量。

实施例6

将肉鸡随机分成七组，每组100只，在饲养中加入液体制剂。

用法用量：混饮，本品1L兑水400kg，一日一次集中适用，连续3-5天。

针对肉鸡的呼吸道啰音、鸡白痢、鸡支原体病、鸡曲霉菌病、鸡新城疫情况进行对比统计。

其中，制剂A为本发明技术方案制备的双黄连口服液制剂,制剂B为传统意义上的双黄连组方液体制剂，制剂C为单纯利用嗜酸乳杆菌ACCC00160处理的双黄连口服液制剂，制剂D为单纯利用产朊假丝酵母ACCC20060处理的双黄连口服液制剂，制剂E为采用EM原露处理的双黄连口服液制剂，制剂F为采用嗜酸乳杆菌(非ACCC00160)、产朊假丝酵母(非ACCC20060)处理的双黄连口服液制剂，制剂G为采用嗜酸乳杆菌一级菌种、产朊假丝酵母一级菌种处理的双黄连口服液制剂。

另外，在治疗已有症状的肉鸡时发现，治疗2周后，呼吸道啰音消失率为65％，而其他制剂治疗的对照组没见啰音消失。利用本发明的双黄连生物制剂的抑菌杀菌作用及调节肠道微生物菌群平衡的作用，还可以对鸡的肠道鸡病进行治疗。通过临床试验，双黄连制剂对鸡白痢治愈率为94.2％，总有效率为100％，疗效显著，应用前景广阔。

本发明不局限于上述具体实施方式，一切基于本发明的技术构思，所作出的结构上的改进，均落入本发明的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，其特征在于：是将功能微生物的二级菌种接种于双黄连组方发酵液中，利用功能微生物的生命活动，在常温、常压下进行液体深层高密度发酵，将双黄连组方中有效成分充分有效地溶出和转化，而制成的双黄连口服液生物制剂。

2.如权利要求1所述的一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，其特征在于：所述双黄连组方由重量比为(1-2):(1-2):(2-4)的黄芩、金银花、连翘组成。

3.如权利要求2所述的一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，其特征在于：所述双黄连组方由重量比为1:1:2的黄芩、金银花、连翘组成。

4.如权利要求3所述的一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，其特征在于：所述每1000ml双黄连组方发酵液中含有黄芩25g、金银花25g、连翘50g。

5.如权利要求1-4任一项所述的一种利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，其特征在于：所述功能微生物是嗜酸乳杆菌ACCC00160和产朊假丝酵母ACCC20060，均来源于中国农业微生物菌种保藏中心。

6.一种制备如权利要求5所述制剂的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)双黄连中药粉制备：黄芩、金银花、连翘按双黄连组方重量比混合均匀，粉碎过筛；

(2)嗜酸乳杆菌一级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基高温高压灭菌；冷却后在无菌条件下接种嗜酸乳杆菌菌种，于摇床中培养，即得嗜酸乳杆菌一级菌种；

(3)产朊假丝酵母一级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基高温高压灭菌；冷却至后在无菌条件下接种产朊假丝酵母菌种，于摇床中培养，即得产朊假丝酵母一级菌种；

(4)嗜酸乳杆菌二级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基高温高压灭菌；冷却后在无菌条件下接种步骤(2)得到的嗜酸乳杆菌一级菌种，于摇床中培养，即得嗜酸乳杆菌二级菌种；

(5)产朊假丝酵母二级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基高温高压灭菌；冷却至后在无菌条件下接种步骤(3)得到的产朊假丝酵母一级菌种，于摇床中培养，即得产朊假丝酵母二级菌种；

(6)益生菌炮制双黄连复合液体生物中药制剂制备：向步骤(1)制备的双黄连中药粉中注入过滤除菌后的洁净温水，制成双黄连组方发酵液，并向所述双黄连组方发酵液中分别接种步骤(4)制备的嗜酸乳杆菌二级菌种和步骤(5)制备的产朊假丝酵母二级菌种，培养后，即得到利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂。

7.一种如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)双黄连中药粉制备：黄芩、金银花、连翘按重量比(1-2):(1-2):(2-4)混合均匀，粉碎过40-80目筛；

(2)嗜酸乳杆菌一级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基装入容器中，并在120-125℃、7.84-8.8MPa灭菌15-25min，冷却至35-45℃后无菌条件下接种筛选的嗜酸乳杆菌试管菌种，于摇床在35-45℃、100-120r/min的条件下培养45-52h，即得嗜酸乳杆菌一级菌种；

(3)产朊假丝酵母一级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基装入容器中，并在120-125℃、7.84-8.8MPa下灭菌15-25min，冷却至25-35℃后无菌条件下接种筛选的产朊假丝酵母试管菌种，于摇床在25-33℃、100-120r/min的条件下，培养45-53h，即得产朊假丝酵母一级菌种；

(4)嗜酸乳杆菌二级菌种制备：将嗜酸乳杆菌液体菌种培养基装入容器中，并在120-125℃、7.84-8.8MPa灭菌15-25min，冷却至40-50℃后无菌条件下接种步骤(2)得到的嗜酸乳杆菌一级菌种，于摇床在35-45℃、100-120r/min的条件下培养35-37h，即得嗜酸乳杆菌二级菌种；

(5)产朊假丝酵母二级菌种制备：将产朊假丝酵母液体菌种培养基装入容器中，并在120-125℃、7.84-8.8MPa灭菌15-25min，冷却至28-32℃后无菌条件下接种步骤(3)得到的产朊假丝酵母一级菌种，于摇床在28-30℃、100-120r/min的条件下培养35-37h，即得产朊假丝酵母二级菌种；

(6)益生菌炮制双黄连复合液体生物中药制剂制备：向步骤(1)制备的双黄连中药粉中注入过滤除菌后的洁净温水，制成双黄连组方发酵液，保证每1000ml双黄连组方发酵液中含有黄芩25g、金银花25g、连翘50g，并向所述双黄连组方发酵液中分别接种步骤(4)制备的嗜酸乳杆菌二级菌种和步骤(5)制备的产朊假丝酵母二级菌种，保证双黄连组方发酵液、嗜酸乳杆菌二级菌种和产朊假丝酵母二级菌种的体积比为(33-30)：1：1，在32-38℃下培养100-150天，即得到利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂，再将得到的兽用双黄连口服液制剂过滤后灌装。

8.一种如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤如下：所述嗜酸乳杆菌液体菌种培养基中，含双黄连中药粉10-15g/L、柠檬酸二铵1-3g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、Tween801-3g/L、三水乙酸钠3-8g/L。

9.一种如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤如下：所述产朊假丝酵母液体菌种培养基中，含双黄连中药粉3-5g/L、玉米粉2-4g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸镁1-1.5g/L。

10.一种如权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)双黄连中药粉制备：黄芩、金银花、连翘按重量比1:1:2混合均匀，粉碎过60目筛；

(2)嗜酸乳杆菌液体菌种培养基：双黄连中药粉10g/L、柠檬酸二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、Tween802g/L、三水乙酸钠5g/L；

(3)嗜酸乳杆菌一级菌种制备：500ml三角瓶装入嗜酸乳杆菌液体菌种培养基300ml，121℃、8.0MPa灭菌20min；冷却至40℃后无菌条件下接种筛选保存的嗜酸乳杆菌试管菌种，于摇床40℃、110r/min培养48h，即得嗜酸乳杆菌一级菌种；

(4)产朊假丝酵母液体菌种培养基：双黄连中药粉4g/L、玉米粉3g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁1g/L；

(5)产朊假丝酵母一级菌种制备：500ml三角瓶装入产朊假丝酵母液体菌种培养基300ml，121℃、8.0MPa灭菌20min；冷却至30℃后无菌条件下接种筛选保存的产朊假丝酵母试管菌种，于摇床29℃、110r/min培养48h即得产朊假丝酵母一级菌种；

(6)嗜酸乳杆菌二级菌种制备：500ml三角瓶装入嗜酸乳杆菌液体菌种培养基300ml，121℃、8.0MPa灭菌20min；冷却至45℃后无菌条件下接种步骤(3)得到的嗜酸乳杆菌一级菌种，于摇床40℃，110r/min，培养36h，即得嗜酸乳杆菌二级菌种；

(7)产朊假丝酵母二级菌种制备：500ml三角瓶装入产朊假丝酵母液体菌种培养基300ml，121℃、8.0MPa灭菌20min；冷却至30℃后无菌条件下接种步骤(5)得到的产朊假丝酵母一级菌种，于摇床29℃，110r/min，培养36h即得产朊假丝酵母二级菌种；

(8)益生菌炮制双黄连复合液体生物中药制剂制备：1000L全自动液体发酵罐中加入步骤(1)制备的双黄连中药粉，注入940L过滤除菌后的洁净温水，保证每1000ml双黄连组方发酵液中含有黄芩25g、金银花25g、连翘50g，然后分别接种嗜酸乳杆菌二级菌种30L、产朊假丝酵母二级菌种30L,35℃培养120天，即得到利用益生菌炮制的兽用双黄连口服液制剂；

(9)将得到的兽用双黄连口服液制剂过滤后灌装，得到每ml液体含以下成分分别不低于：黄芩苷6.72mg、黄芩素0.82mg、汉黄芩素0.56mg、连翘苷0.27mg、绿原酸0.69mg的兽用双黄连口服液制剂。