CN112315971A - 一种黄芪多糖在制备治疗肾损伤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种黄芪多糖在制备治疗肾损伤药物中的应用，通过体外研究探讨黄芪多糖对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞损伤，以及对细胞内p38MAPK、ERK1/2和维生素D等的影响研究，并探讨了黄芪多糖改善庆大霉素肾毒性的作用机制，为黄芪多糖治疗庆大霉素肾毒性奠定研究基础，并为临床寻找有效防治肾损伤药物提供理论和实验基础。

Description

一种黄芪多糖在制备治疗肾损伤药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种黄芪多糖在制备治疗肾损伤药物中的应用。
背景技术
急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是指由于各种因素导致肾功能短期内急剧下降致使机体内代谢产物潴留，水、电解质、酸碱平衡紊乱的临床综合征。近年来，AKI的发病率呈逐年上升的趋势。据调查显示，重症监护室中成年AKI发病率在16％～67％之间，并且AKI一旦发生，其病死率高达50％以上。目前，随着医药产品的迅猛发展，临床上不断出现新药，药物诱导AKI已呈上升趋势，在重症AKI患者中，超过20％是药物性损害。药物因素已成为AKI发病的重要病因，其中联合使用或大剂量使用抗生素所致AKI问题最为突出。以庆大霉素为代表的氨基糖苷类抗生素是所有抗生素中最易导致肾损伤的一类药物，其肾毒性的发生率高达11％～26％。
庆大霉素为氨基糖苷类抗生素，具有抗菌谱广、疗效可靠、价格低廉等特点，但由于庆大霉素具有肾脏毒性，严重限制其临床使用范围。庆大霉素肾毒性临床症状主要为急性肾损伤和急性肾小球坏死，表现为组织及功能上的近端小管毒性损伤，其机制复杂，主要与细胞坏死与凋亡、炎症反应等密切相关。庆大霉素进入体内，可积聚于肾小管上皮细胞中，并损害线粒体等胞内结构，使细胞变性、坏死，同时庆大霉素还可使肾脏近端小管上皮细胞出现凋亡。
研究表明，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成员细胞外信号调节激酶(extracellular signa1-regulated kinase1/2,ERK1/2)、p38MAPK与肾脏疾病关系密切，并且p38MAPK可能参与庆大霉素损伤肾脏的过程。众多研究均发现抑制ERK1/2、p38MAPK激活可缓解药物导致的肾损伤。而作为类固醇激素的维生素D(Vitamin D，维生素D)则具有保护肾脏的作用。研究发现，维生素D可通过作用于肾小管上皮细胞、抑制炎症细胞因子如巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等起肾脏保护作用，其也可调节ERK1/2、p38MAPK发挥抑制肿瘤生长和抗炎活性的作用。
中药黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有补气升阳、托毒生肌、利水退肿、补益肾气等功效。研究显示，黄芪可扩张血管，增加肾血流量，反馈性抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统，具有保护肾小管上皮细胞、改善肾功能等作用。
黄芪多糖为黄芪的主要活性成分，也具有改善肾脏病变患者肾功能、有效保护糖尿病肾病及肾间质纤维化大鼠肾脏的作用。目前黄芪多糖可有效治疗肾脏相关病变，但具体机制尚不明确。因此，本发明通过体外研究探讨黄芪多糖对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞损伤，以及对细胞内p38MAPK、ERK1/2和维生素D的影响等研究，为黄芪多糖治疗庆大霉素肾毒性奠定研究基础，并探讨黄芪多糖改善庆大霉素肾毒性的作用机制。
发明内容
本发明的目的是研究一种黄芪多糖在制备治疗肾损伤药物中的应用，初步探讨黄芪多糖改善庆大霉素诱导AKI的作用机制，为临床寻找有效制备治疗肾损伤药物提供理论和实验基础。
本发明所述黄芪多糖在制备治疗肾损伤药物中的应用，优选的，黄芪多糖在制备治疗庆大霉素致肾损伤药物中的应用。
进一步优选的，所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素致急性肾损伤药物中的应用。
进一步优选的，所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素诱导肾小管上皮细胞存活率药物中的应用。
进一步优选的，所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素诱导肾小管上皮细胞维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达水平药物中的应用。
进一步优选的，所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素对急性肾损伤肾脏病理学改变药物中的应用。
进一步优选的，所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素对急性肾损伤血清25(OH)D3、Cr、BUN、iNOS、MCP-1水平药物中的应用。
进一步优选的，所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素对急性肾损伤肾脏维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1mRNA表达药物中的应用。
进一步优选的，所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素致肾损伤或急性肾损伤药物制剂中的应用。
进一步优选的，所述制剂为加入药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的制剂。
更进一步优选的，所述制剂为胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、片剂、注射制剂、冻干粉针剂。
本发明所述的辅料没有限制，符合药学要求即可。
有益效果：
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、初步探讨黄芪多糖改善庆大霉素诱导AKI的作用机制，为临床寻找有效制备治疗肾损伤药物提供理论和实验基础。
2、本发明研究了黄芪多糖是通过调节维生素D的表达而影响p38MAPK与ERK1/2信号通路以实现对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用，为黄芪多糖有效改善庆大霉素诱导的肾毒性提供了更多的治疗方向。
3、本发明通过对黄芪多糖对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞存活率的影响试验证实，与正常组比较，模型组肾小管上皮细胞存活率显著降低(P<0.01)，且在24h、36h、48h时细胞存活率随着造模时间的延长而降低；黄芪多糖高、低剂量组及维生素D组在造模24h时均可在显著提高肾小管上皮细胞存活率(P<0.01)，在造模48h时以黄芪多糖高剂量组及维生素D组较为显著(P<0.01)。
4、本发明通过黄芪多糖对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达水平的影响试验证实，与正常组比较，模型组肾小管上皮细胞维生素VDR、CYP27B1蛋白表达量显著下降(P<0.01)，CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖高剂量组及维生素D组均可显著提高维生素VDR、CYP27B1蛋白表达量(P<0.01)，同时二者均可不同程度降低CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达量，且黄芪多糖高剂量组对CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白作用更为显著(P<0.01)，维生素D组对CYP24A1、p-ERK1/2蛋白作用较为显著(P<0.05)。
5、本发明通过黄芪多糖对AKI豚鼠肾脏病理学改变的影响试验证实黄芪多糖组、维生素D组肾脏组织形态较模型组均有一定改善。
6、本发明通过黄芪多糖对AKI豚鼠血清25(OH)D3、Cr、BUN、iNOS、MCP-1水平的影响实验证实，与正常组比较，模型组豚鼠血清Cr、BUN、MCP-1、iNOS含量显著升高(P<0.01)，血清25(OH)D3含量显著下降(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖组及维生素D组均可显著提高豚鼠血清25(OH)D3含量(P<0.01)，同时二者均可不同程度降低豚鼠血清Cr、BUN、MCP-1、iNOS含量(P<0.05)。
7、本发明通过黄芪多糖对AKI豚鼠肾脏维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1mRNA表达的影响实验证实，与正常组比较，模型组豚鼠肾脏维生素VDR、CYP27B1mRNA表达量显著下降(P<0.01)，CYP24A1表达量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖组及维生素D组均可显著提高豚鼠肾脏维生素VDR mRNA表达量(P<0.01)、降低CYP24A1mRNA表达量(P<0.01)；同时二者均可不同程度提高豚鼠肾脏CYP27B1mRNA表达量，以黄芪多糖组较为显著(P<0.05)。
8、本发明通过黄芪多糖对AKI豚鼠肾脏维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响实验证实，与正常组比较，模型组豚鼠肾脏维生素VDR、CYP27B1蛋白表达量显著下降(P<0.01)，CYP24A1、p-P38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖组及维生素D组均可显著提高豚鼠肾脏维生素VDR、CYP27B1蛋白表达量(P<0.01)，同时二者均可不同程度降低CYP24A1、p-P38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达量(P<0.05)，黄芪多糖组对CYP24A1、p-P38MAPK蛋白作用更为显著(P<0.01)，维生素D组对p-ERK1/2蛋白作用更为显著(P<0.01)。
附图说明
图1黄芪多糖对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、pERK1/2蛋白表达条带图。(Control：正常组，Model：模型组，黄芪多糖-L：黄芪多糖低剂量组，黄芪多糖-H：黄芪多糖高剂量组，维生素D：维生素D组)。
图2黄芪多糖黄对庆大霉素致AKI豚鼠肾脏病理变化的影响(HE染色，×200)，A:正常组；B:模型组；C:黄芪多糖；D:维生素D)。
图3黄芪多糖对AKI豚鼠肾脏中维生素VDR，CYP27B1，CYP24A1，p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表达的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1
黄芪多糖对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞存活率的影响。
黄芪多糖对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达水平的影响。
1.材料与方法
1.1试剂与仪器
维生素D(康诺生化制药厂，批号:19214)；黄芪多糖(爱迪森生物科技有限公司，批号:1808026)；庆大霉素(天津药业焦作有限公司,批号:19070602)；DMEM培养基(美国，Gibco)；胎牛血清(美国，Gibco)；二甲亚砜(DMSO，美国，Amresco)；磷酸盐缓冲液(中国，北京中杉)；胰蛋白酶(中国，碧云天)；MTT试剂盒(中国，碧云天)；维生素D受体(维生素VDR)兔抗(ABclonal公司，货号：A2194)；CYP27B1兔抗(ABclonal公司，货号：A1716)；CYP24A1兔抗(ABcam公司，货号：ab203308)；p38MAPK兔抗(ABclonal公司，货号：A5521)；pERK1/2兔抗(CST公司，货号：4370T)；二氧化碳培养箱(日本，Sanyo)；倒置显微镜(日本，OLYMPUS)；流式细胞检测仪(美国，BD)；台式冷冻高速离心机(美国，Thermo)；-80℃超低温冰箱(美国，Thermo)；垂直蛋白电泳仪(美国，Bio-Rad)核酸蛋白凝胶成像仪(美国，Bio-Rad)；多功能酶标仪(美国，Thermo)。
1.2细胞培养
肾小管上皮细胞(HK-2)购自中国科学院上海细胞库，用含10％胎牛血清培养基，37℃，5％CO2及饱和湿度的恒温培养箱中培养，2～3d换液一次，倒置显微镜观察细胞生长情况，传代培养取对数生长期的细胞用于实验。
1.3 MTT法检测细胞存活率
取对数生长期的细胞，调整每孔细胞密度为1×105(100μL)，分别接种于3块96孔培养板，设立正常对照组(加入等体积的细胞培养液)、模型组(庆大霉素2mg·mL-1)、黄芪多糖低剂量组(庆大霉素2mg·mL-1+黄芪多糖0.8mmol·L-1)、黄芪多糖高剂量组(庆大霉素2mg·mL-1+黄芪多糖1.6mmol·L-1)、维生素D组(庆大霉素2mg·mL-1+维生素D10-8mol·L-1)，每组6个复孔，3块板分别培养24、36、48h后各取出1块培养板，加入MTT溶液(5mg·mL-1)20μL，37℃继续培养4h以上，终止培养，弃上清液。每孔加入150μL DMSO，室温振荡10min，于酶标仪490nm波长处测定各孔光密度(OD值)，计算细胞存活率。实验重复三次，计算平均值。
1.4 Western blot蛋白印迹法检测维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、pERK1/2蛋白表达水平
细胞按上述分组给药处理，用细胞裂解液将细胞裂解，取上清，BCA法测定蛋白浓度并配平至浓度体积一致的样品。按4：1上样缓冲液加入样本蛋白，于沸水中煮5min使蛋白变性，电泳后转膜。TBST中清洗1分钟，然后用5％脱脂牛奶封闭液室温封闭1h，加入相应一抗，密封，4℃孵育过夜。用TBST清洗3次，每次10min，用封闭液将二抗(1：1000)稀释成一定的浓度，然后室温温育1h，再用用TBST清洗。将ECL曝光液按A液:B液1:1混匀后均匀覆盖在整片膜上，反应1min放入曝光仪曝光检测。
1.5数据统计
采用SPSS25.0统计软件，实验中各计量参数均以均数±标准差
Figure BDA0002787875400000062
Figure BDA0002787875400000063
形式表示，多组间数据使用单因素方差分析比较。
2.结果
2.1黄芪多糖对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞存活率的影响
与正常组比较，模型组肾小管上皮细胞存活率显著降低(P<0.01)，且在24h、36h、48h时细胞存活率随着造模时间的延长而降低；黄芪多糖高、低剂量组及维生素D组在造模24h时均可在显著提高肾小管上皮细胞存活率(P<0.01)，在造模48h时以黄芪多糖高剂量组及维生素D组较为显著(P<0.01)。见表1。
表1黄芪多糖对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞存活率的影响
Figure BDA0002787875400000061
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
Control：正常组，Model：模型组，APS-L：黄芪多糖低剂量组，APS-H：黄芪多糖高剂量组，VD：维生素D组.
2.2黄芪多糖对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达水平的影响
与正常组比较，模型组肾小管上皮细胞维生素VDR、CYP27B1蛋白表达量显著下降(P<0.01)，CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖高剂量组及维生素D组均可显著提高维生素VDR、CYP27B1蛋白表达量(P<0.01)，同时二者均可不同程度降低CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达量，且黄芪多糖高剂量组对CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白作用更为显著(P<0.01)，维生素D组对CYP24A1、p-ERK1/2蛋白作用较为显著(P<0.05)。(表2、图1)
表2黄芪多糖对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、pERK1/2蛋白表达水平的影响
Figure BDA0002787875400000071
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
Control：正常组，Model：模型组，APS-L：黄芪多糖低剂量组，APS-H：黄芪多糖高剂量组，VD：维生素D组.
3.总结
近年研究发现，药物诱导肾损伤发生呈上升趋势，药物因素已成为急性肾损伤发病的重要病因。由于大量药物选择性积聚于肾小管上皮细胞中，使其出现不同程度的损伤，最终导致肾功能功能异常，引发一系列肾脏病变。现临床已证实，大量使用庆大霉素可导致急性肾损伤，严重时还可诱导肾衰甚至危及生命。本实验通过研究黄芪多糖对庆大霉素诱导的肾毒性肾小管上皮细胞的影响，结果显示：黄芪多糖与维生素D可显著提高肾小管上皮细胞的存活率，说明黄芪多糖与维生素D可有效改善庆大霉素诱导肾小管上皮细胞的坏死、凋亡。
MAPK广泛存在于哺乳动物细胞内，具有传导胞外信号至细胞核的作用。p38MAPK、ERK1/2信号通路复杂，也与多种细胞反应、生物学过程密切相关，如：介导炎症反应、影响细胞因子合成、参与细胞增殖、分化和凋亡等。细胞实验发现，p38蛋白在肾小管上皮细胞凋亡中起重要作用，p38MAPK可能参与庆大霉素损伤肾脏的过程。动物实验显示，黄芪甲苷可抑制急性肾损伤动物模型p38MAPK磷酸化、减少肾小管上皮细胞凋亡；并且在庆大霉素诱导急性肾损伤的过程中p38MAPK磷酸化水平上升，而利用药物抑制p38MAPK的表达可缓解庆大霉素导致的肾损伤。ERK活化后可迅速穿过细胞膜进入细胞核，磷酸化和活化一系列转录因子，从而参与基因转录的调控。研究发现，ERK磷酸化水平与肾损伤关系密切，高糖可促进多种肾脏细胞ERK磷酸化，并且在脂多糖与缺血再灌注诱导急性肾损伤后ERK1/2磷酸化水平也迅速升高，而抑制ERK1/2信号通路可改善顺铂导致的肾小管上皮细胞凋亡。本实验发现，黄芪多糖与维生素D可抑制p38MAPK蛋白的表达，并降低ERK1/2的磷酸化水平。结果提示：黄芪多糖与维生素D可能通过调节p38MAPK的表达与ERK1/2的磷酸化保护庆大霉素对肾小管上皮细胞的损害。
维生素D多经阳光刺激合成，进入体内由1α-羟化酶(CYP27B1)等酶的作用后与维生素D受体(维生素VDR)结合发挥相应的生物学效应，再经24-羟化酶(CYP24A1)的作用将其灭活，其中参与维生素D代谢的关键酶CYP27B1、CYP24A1位于肾脏且维生素VDR也广泛分布于肾脏组织内。1,25(OH)2D3是维生素D在体内的活性形式，其与肾脏疾病进展关系密切，在慢性肾脏疾病患者中普遍存在维生素D缺乏现象，实验也显示急性肾损伤患者较健康人群维生素D水平出现明显下降，长期维生素D缺乏可能提高肾损伤风险。维生素D可通过抑制系膜细胞增殖、减轻足细胞损伤、调节炎性因子分泌等多种途径发挥保护肾脏的作用。研究发现，选择性维生素VDR激动剂在急性肾损伤模型中具有保护肾损伤的作用，并且1,25(OH)2D3可能通过抑制高糖诱导的ERK磷酸化来降低肾小管上皮细胞肾素的高表达，达到保护肾脏的作用。此外，1,25(OH)2D3还可抑制p38MAPK的表达从而改善糖尿病肾病的肾间质纤维化程度，保护肾功能。本实验结果显示：模型组维生素VDR、CYP27B1蛋白表达量显著下降，CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达量显著升高，维生素D可降低p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达量，提示维生素D可能通过调节p38MAPK、ERK1/2信号通路改善庆大霉素对肾小管上皮细胞的损伤。
现代药理学研究显示，黄芪多糖具有免疫调节、保护肝肾、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤等作用。黄芪多糖可改善慢性肾衰模型的脂质过氧化导致的应激状态发挥保护肾功能的作用，并且其还可调控p38MAPK信号通路抑制缺氧复氧诱导肾小管上皮细胞的炎性反应。在本研究中，我们给予造模肾小管上皮细胞黄芪多糖，结果发现黄芪多糖高、低剂量组均可显著提高细胞存活率，表明黄芪多糖对庆大霉素诱导的细胞损伤具有保护作用。进一步研究发现，黄芪多糖高剂量组维生素VDR、CYP27B1蛋白表达量显著高于模型组，CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达量显著低于模型组，提示黄芪多糖对庆大霉素对肾小管上皮细胞的保护作用可能通过调节维生素D与影响p38MAPK、ERK1/2信号通路有关。
综上所述，黄芪多糖与维生素D均可改善庆大霉素对肾小管上皮细胞的损伤，其中维生素D可能是通过调节p38MAPK、ERK1/2发挥作用，而黄芪多糖不仅可抑制p38MAPK、ERK1/2信号通路，还可调节维生素D，故推测黄芪多糖可能是通过调节维生素D的表达而影响p38MAPK与ERK1/2信号通路以实现对庆大霉素诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用，为黄芪多糖有效改善庆大霉素诱导的肾毒性提供了更多的治疗方向。
实施例2
APS对AKI豚鼠肾脏病理学改变的影响。
APS对AKI豚鼠血清25(OH)D3、Cr、BUN、iNOS、MCP-1水平的影响。
APS对AKI豚鼠肾脏VDR、CYP27B1、CYP24A1mRNA表达的影响。
APS对AKI豚鼠肾脏肾脏VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响。
1材料
1.1动物
成年健康豚鼠32只，雌雄各半，体重(275±25g)，购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号:SCXK(湘)2014-0010。
1.2药品与试剂
庆大霉素(开封制药集团有限公司，批号：18012201)；黄芪多糖(合肥中龙神力动物药业有限公司，批号：20170916)；骨化三醇(青岛正大海尔制药有限公司，批号：1709251)；25(OH)D3ELISA试剂盒(批号：201901)购自上海泛柯实业有限公司；肌酐(Cr)ELISA试剂盒(批号：20190108)、尿素氮(BUN)ELISA试剂盒(批号：20190107)、iNOS ELISA试剂盒(批号：20181228)、MCP-1ELISA试剂盒(批号：20190710)均购自南京建成有限公司；Trizol总RNA提取试剂(Aidlab公司，Lot:252250AX)；HiScript Reverse Transcriptase(VAZYME公司，批号：R101-01/02)；Ribonuclease Inhibitor(TRANS公司，Lot:J11202)；兔多抗GAPDH(杭州贤至生物有限公司，批号：AB-P-R001)；兔多抗维生素VDR(Abcam公司，批号：Ab3508)；兔单抗CYP27B1(Abcam公司，批号：Ab206655)；山羊多抗CYP24A1(NovUS公司，批号：NBP1-52111)；兔单抗p-p38MAPK(Cell Signaling Technology公司，批号：4511)；兔单抗P-ERK(Cell Signaling Technology公司，批号：4370)；HRP标记羊抗兔二抗(批号：BA1054)、HRP标记兔抗羊二抗(批号：BA1060)、HRP标记羊抗小鼠二抗(批号：BA1051)，武汉博士德生物工程有限公司。
1.3主要仪器
BX53型生物显微镜(奥林巴斯公司)、RM2016轮转式切片机(德国Leica)、MK-3酶标仪(Thermo公司)；QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪(ABI公司)；Nano-100微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)；蛋白印迹电泳系统(北京六一仪器厂)。
2.方法
2.1动物分组与实验方案
豚鼠32只，适应性饲养1周后，随机分为4组，每组8只，分别为：正常对照组、模型组、黄芪多糖组、维生素D组。正常对照组每天给予腹腔注射生理盐水；模型组，每天均给予腹腔注射硫酸庆大霉素注射液，80mg·kg-1·d-1，连续21天；黄芪多糖组每日灌胃黄芪多糖200mg·kg-1，每天1次，一个小时后腹腔注射庆大霉素，剂量同模型组，连续使用21天；维生素D组每日灌胃骨化三醇30ng·kg-1，每天1次，一个小时后腹腔注射庆大霉素，剂量同模型组，连续使用21天；每天对实验动物进行称重，以调整药物用量。
2.2样本采集
最后一次给药后，禁食禁水24小时，麻醉豚鼠，右心室取血，离心收集血清后置-80℃冰箱冻存。摘取肾脏，部分-80℃保存，部分4％多聚甲醛固定常温保存。
2.3 HE染色观察肾脏组织病理结构变化
取肾组织4％多聚甲醛固定、乙醇梯度脱水、石蜡包埋、切片及苏木素－伊红染色，在光学显微镜下观察正常对照组、模型组及给药组之间肾脏病理学变化。
2.4 ELISA检测豚鼠血清25(OH)D3、Cr、BUN、iNOS、MCP-1水平
根据试剂盒说明书操作，在酶标仪450nm处读取吸光值并计算标准曲线回归方程式，求得样品浓度。
2.5 RT-PCR法检测肾脏VDR、CYP27B1、CYP24A1mRNA的表达
使用TRizol试剂提取肾脏总RNA，并进行逆转录反应。扩增引物由武汉擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表3。实时荧光定量PCR扩增条件为：50℃预反应2min，95℃10min，95℃30sec，60℃30sec，40次循环。每个样品设置3个复孔，绘制溶解曲线，以2-△△Ct进行分析样本的相对定量值。
表3靶基因的引物序列
Figure BDA0002787875400000111
2.6 Western blot检测肾脏VDR、CYP27B1、CYP24A1、p-p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达
提取肾脏组织总蛋白，分装-20℃保存。根据标准蛋白浓度和相应的OD值计算直线回归方程，求出样品蛋白浓度。制胶、电泳、转膜，用含5％脱脂奶粉的TBST室温摇床封闭2h，加入一抗，4℃孵育过夜，清洗后加入二抗，37℃摇床孵育2h，清洗多余二抗，ECL显色，用BandScan分析胶片灰度值。
2.7数据统计
采用SPSS 19.0统计软件,实验中各计量参数均以均数±标准差
Figure BDA0002787875400000112
Figure BDA0002787875400000113
形式表示,多组间数据使用单因素方差分析比较。
3.结果
3.1黄芪多糖对AKI豚鼠肾脏病理学改变的影响
如图2所示，正常对照组肾小管清晰可见上皮细胞刷状内缘，上皮细胞排列整齐，肾小球血管网结构清晰。模型组肾小管上皮细胞刷状内缘全部消失，上皮细胞肿胀坏死，空泡变性，近曲小管管腔扩张，不成形，肾小球血管网结构不清晰。黄芪多糖组、维生素D组肾脏组织形态较模型组均有一定改善。
3.2黄芪多糖对AKI豚鼠血清25(OH)D3、Cr、BUN、iNOS、MCP-1水平的影响
与正常组比较，模型组豚鼠血清Cr、BUN、MCP-1、iNOS含量显著升高(P<0.01)，血清25(OH)D3含量显著下降(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖组及维生素D组均可显著提高豚鼠血清25(OH)D3含量(P<0.01)，同时二者均可不同程度降低豚鼠血清Cr、BUN、MCP-1、iNOS含量(P<0.05)。(表4)
表4黄芪多糖对AKI豚鼠血清25(OH)D3，Cr，BUN，MCP-1和iNOS的影响(
Figure BDA0002787875400000121
n＝8)
Figure BDA0002787875400000122
*P<0.05vs正常组,**P<0.01vs正常组；#P<0.05,##P<0.01vs模型组
3.3黄芪多糖对AKI豚鼠肾脏维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1mRNA表达的影响
与正常组比较，模型组豚鼠肾脏维生素VDR、CYP27B1mRNA表达量显著下降(P<0.01)，CYP24A1表达量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖组及维生素D组均可显著提高豚鼠肾脏维生素VDR mRNA表达量(P<0.01)、降低CYP24A1mRNA表达量(P<0.01)；同时二者均可不同程度提高豚鼠肾脏CYP27B1mRNA表达量，以黄芪多糖组较为显著(P<0.05)。(表5)
表5黄芪多糖对AKI豚鼠肾脏中维生素VDR，CYP27B1，CYP24A1mRNA表达的影响(
Figure BDA0002787875400000123
n＝8)
Figure BDA0002787875400000131
*P<0.05vs正常组,**P<0.01vs正常组；#P<0.05,##P<0.01vs模型组
3.4黄芪多糖对AKI豚鼠肾脏肾脏维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组豚鼠肾脏维生素VDR、CYP27B1蛋白表达量显著下降(P<0.01)，CYP24A1、p-P38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖组及维生素D组均可显著提高豚鼠肾脏维生素VDR、CYP27B1蛋白表达量(P<0.01)，同时二者均可不同程度降低CYP24A1、p-P38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达量(P<0.05)，黄芪多糖组对CYP24A1、p-P38MAPK蛋白作用更为显著(P<0.01)，维生素D组对p-ERK1/2蛋白作用更为显著(P<0.01)。(表6；图3)
表6黄芪多糖对AKI豚鼠肾脏中维生素VDR，CYP27B1，CYP24A1，p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表达的影响(
Figure BDA0002787875400000132
n＝8)
Figure BDA0002787875400000133
*P<0.05vs正常组,**P<0.01vs正常组；#P<0.05,##P<0.01vs模型组
4.总结
庆大霉素为抗菌谱广、疗效可靠、价格低廉且临床应用广泛的抗生素，但因具有肾脏毒性，严重限制其使用范围。虽庆大霉素引起肾毒性早已明确，但其具体的产生机制还有待进一步阐明。庆大霉素对肾脏的毒性作用主要表现为近端肾小管损害，继而导致肾小球滤过功能失常、肾小管上皮细胞坏死等。研究发现，炎症反应可能是庆大霉素致AKI的重要因素，庆大霉素可增加炎症因子的分泌，促使白细胞浸润和影响MCP-1的表达，引起功能和结构损伤。此外，iNOS为体内重要的促炎性酶，被激活可产生大量的NO破坏肾脏细胞。本实验结果表明，黄芪多糖与维生素D均具有降低AKI豚鼠血清Cr、BUN、MCP-1、iNOS水平并减轻肾脏结构损伤的作用，说明黄芪多糖与维生素D能够通过减轻炎症、抑制大量NO的生成对肾脏细胞的破坏保护庆大霉素诱导的AKI。
MAPK是一组细胞内广泛分布的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究显示，MAPK信号途径参与多种细胞生理过程，如：增殖、分化、凋亡及炎症反应等，与众多疾病的发生发展密切相关。p38MAPK是介导炎症反应的重要细胞内信号传导途径，可被细胞因子与氧化应激激活，使致炎性细胞因子基因的表达上调。研究也发现，p38MAPK与庆大霉素、顺铂等具有肾脏毒性药物引起的AKI关系密切。实验证实，在庆大霉素致AKI的过程中p-p38MAPK的表达水平上升，且使用药物通过抑制p38MAPK与核转录因子kappaB的表达可改善庆大霉素引起的肾损伤。ERK1/2信号通路在细胞增殖、分化、凋亡等过程中起重要作用，ERK的磷酸化级联过程调节多种炎症蛋白基因的表达。通过抑制ERK1/2信号通路可保护H2O2与顺铂导致的肾小管上皮细胞凋亡，并且p-ERK1/2表达水平在缺血再灌注与脂多糖致急性肾损伤后出现迅速升高。本研究显示，黄芪多糖组与维生素D组均在一定程度上可下调庆大霉素致AKI豚鼠p-p38MAPK、p-ERK1/2的表达水平，提示黄芪多糖与维生素D对庆大霉素诱导豚鼠肾损伤的保护作用与调节p38MAPK、ERK1/2信号通路有关。
研究表明维生素D为脂溶性物质，是存在于人体的一种类固醇类激素，维生素D前体在肝脏经27-羟化酶羟基化后转化为25(OH)D3，再经肾脏1α-羟化酶(CYP27B1)作用转化为1，25(OH)2D3并与维生素D受体(维生素VDR)结合发挥其生物学效应，24-羟化酶(CYP24A1)为维生素D限速酶，可使循环中各种形式的维生素D灭活。虽然维生素D的活性成分是1，25(OH)2D3，但目前研究认为25(OH)D3更能准确反应体内维生素D水平，是评价机体维生素D的可靠指标。近年来，诸多研究发现维生素D在各类肾脏疾病发生发展过程中起重要作用，可通过抗炎性反应、抑制肾素-血管紧张素系统、改善肾小管与肾小球间质纤维化等途径达到对肾脏的保护作用。离体实验发现，1，25(OH)2D3可下调肾小管上皮细胞MCP-1的转录。在体实验也显示，利用维生素D类似物帕立骨化醇干预链脲霉素诱导的糖尿病模型小鼠后，可抑制MCP-1的表达、降低MCP-1活性，从而改善肾小球硬化程度。并且在AKI实验模型中，选择性维生素VDR激动剂已被证实对肾损伤具有保护作用。此外，一项针对不同肾损害患者的研究显示，患者尿MCP-1浓度和巨噬细胞浸润程度与1，25(OH)2D3成负相关，临床观察也发现AKI患者体内维生素D水平较正常人明显降低。本研究结果显示，模型组血清25(OH)D3显著降低，维生素VDR、CYP27B1mRNA与蛋白表达量显著下降，CYP24A1mRNA与蛋白表达量显著升高，提示维生素D水平的降低与庆大霉素致AKI具有一定关系。
现代药理学研究显示，黄芪多糖具有免疫调节、保护肝肾、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤等作用。此外，黄芪多糖不仅可通过调控p38MAPK信号通路，减轻缺氧复氧肾小管上皮细胞炎症反应，还可通过调节Toll受体4/核转录因子kappaB信号通路，保护缺血再灌注导致的AKI。前期研究也证实黄芪多糖还可调节小鼠MC-3T3-E1成骨细胞维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1mRNA及蛋白的表达。
综上，本实验结果显示：黄芪多糖可调节庆大霉素诱导AKI豚鼠模型血清25(OH)D3、肾脏维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1mRNA及蛋白的表达水平。因此推测，黄芪多糖可能是通过调节维生素D的表达而影响p38MAPK与ERK1/2信号通路以实现对庆大霉素诱导AKI的保护作用，但其具体分子作用机制需后续进一步展开研究。
实施例3
取黄芪多糖为原料药，加入1/20的淀粉，制粒，得颗粒剂。
实施例4
取黄芪多糖为原料药，加入1/18的淀粉，混匀，制粉，装入胶囊，得胶囊剂。
实施例5
取黄芪多糖为原料药，加入及1/19的糊精混合均匀，干燥，制成丸剂。
实施例6
取黄芪多糖为原料药，加入1/17的淀粉，制粒，压片，制成片剂。
实施例7
取黄芪多糖为原料药，加入8倍量的注射用水，灭菌，得注射剂。
实施例8
取黄芪多糖为原料药，冻干，得冻干粉剂。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 贵州中医药大学
<120> 一种黄芪多糖在制备治疗肾损伤药物中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 Rat GAPDH(Artificial Sequence)
<400> 1
acagcaacag ggtggtggac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 Rat GAPDH(Artificial Sequence)
<400> 2
tttgagggtg cagcgaactt 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 Rat VDR(Artificial Sequence)
<400> 3
aggaccgcct atccaaca 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 Rat VDR(Artificial Sequence)
<400> 4
tctcattgcc gaacacct 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 Rat CYP27b1(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaagttcct cccgacac 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 Rat CYP27b1(Artificial Sequence)
<400> 6
atcctcctca ggctttcc 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 Rat CYP24a1(Artificial Sequence)
<400> 7
tttgggaaga tgatggtga 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 Rat CYP24a1(Artificial Sequence)
<400> 8
gcagggtttg actgatttg 19

Claims (10)

1.一种黄芪多糖在制备治疗肾损伤药物中的应用，其特征在于，所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素致肾损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素致急性肾损伤药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素诱导肾小管上皮细胞存活率药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素诱导肾小管上皮细胞维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表达水平药物中的应用。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素对急性肾损伤肾脏病理学改变药物中的应用。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素对急性肾损伤血清25(OH)D3、Cr、BUN、iNOS、MCP-1水平药物中的应用。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素对急性肾损伤肾脏维生素VDR、CYP27B1、CYP24A1 mRNA表达药物中的应用。
8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述黄芪多糖在制备治疗庆大霉素致肾损伤或急性肾损伤药物制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述制剂为加入药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的制剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述制剂为胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、片剂、注射制剂、冻干粉针剂。
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