KR102618071B1 - 무순 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

무순 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 개선, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 무순 추출물은 염증성 사이토카인 생성을 억제하고, 장내 마이크로바이옴 개선 효과가 있어 대장염 조직의 위축 및 염증을 억제하여 대장염 개선, 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

무순 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 개선, 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for improvement, prevention or treatment of colitis comprising extract of radish sprouts as an active ingredient}
본 발명은 무순 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
대장염(colitis)은 대장에 염증이 발생하는 질환으로, 다양한 원인에 의해 발생하고, 테네스무스(tenesmus, 시원치 않음), 복부팽만감, 하복부통, 설사 등이 주요 증상으로 나타나고, 분변 중에 점액, 고름이나 혈액이 섞이는 경우도 있다. 대장염의 일반적인 임상증상으로는 비정상적인 통증, 구토, 설사, 직장출혈, 체중 감소를 수반하며 조직병리학적인 관점에서는 염증, 직장길이 감소, 상처 부위에 염증세포의 침윤을 보인다. 대장염은 원인에 따라 크게 감염성 대장염과 비감염성 대장염으로 구분될 수도 있고, 발병 기간에 따라 급성 대장염과 만성 대장염으로 구분될 수도 있다. 급성 대장염에는 아메바성이질, 세균성이질, 살모넬라나 항생물질에 의한 위막성 대장염(pseudomembranous enteritis) 등이 있고 만성 대장염에는 궤양성 대장염, 크론병, 결핵, 매독, X선 등에 의한 것이 있다.
또한, 대장염은 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD) 뿐만 아니라 과민성 대장염 증후군(irritable bowel syndrome, IBS)등을 포함한다. 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD) 중 대표적인 질환인 궤양성 대장염(ulcerative colitis; UC)과 크론병(Crohn's disease; CD)은 아직 원인이 명확히 밝혀져 있지 않고 있으며, 복통과 더불어 심한 만성 설사와 혈성 설사를 일으킬 수 있으며, 완치가 힘들고 호전과 악화를 반복하는 특성이 있다. 궤양성 대장염은 대장의 점막에 진무름(미란)이나 궤양이 연속적으로 형성되는 질환으로, 혈변, 점혈변, 설사, 복통이 일어나고, 중증인 경우에는 발열, 체중감소, 빈혈 등의 전신성의 증상이 나타난다. 또한, 궤양성 대장염은 위장관 어느 부위에서도 발생할 수 있다. 크론병은 입에서 항문에 이르는 소화관의 임의의 부위에 궤양 등의 병변이 비연속적으로 발생하는 질환으로서, 복통, 설사, 혈변과 더불어, 중증의 경우에는 발열, 하혈, 체중감소, 전신권태감, 빈혈 등의 증상이 나타난다. 궤양성 대장염과 크론병은 병변과 염증 증상에 있어서 차이가 있지만 여러 면에서 유사한 양상을 보이기 때문에 두 질환의 구분이 서로 명확하지 않은 경우가 흔하다.
종래, 궤양성 대장염 및 크론병의 발생율은 서양인에게 높다고 알려져 있었지만, 최근, 식습관 등의 생활습관의 변화로 인해 우리나라 등 동양에서도 환자수가 급증하고 있다. 대장염의 치료는 보통 식사를 제한하고 5-aminosalicylic acid (5-ASA)와 같은 항염증제를 투여하는 방법이 있지만 효과가 크지 않고 소화불량, 식욕저하, 구토, 수면방해 등 다양한 부작용이 보고되고 있다. 또한 프레드니솔론과 같은 부신피질스테로이제는 위궤양이나 장기간 복용 시 대퇴골두 괴사 등의 부작용이 있다. 이러한 약물 치료제는 효과적인 치료를 위해 오랜 기간 약물을 복용해야 하나 부작용 혹은 효과의 미비함으로 환자의 최대 60%가 처방된 약을 복용하지 않는다고 보고되었다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위해선 일상적으로 매일 섭취가 가능하며 부작용이 적은 천연유래 물질 혹은 식품소재 안에서 기능성 물질의 발굴이 필요한 실정이다.
특히 인체 면역체계는 장내 미생물과 긴밀한 관계를 유지하고 있으며 적절한 미생물의 종류와 수는 면역 항상성을 유지하는데 매우 중요하다. 대장염은 정상적인 장내 미생물의 생태계가 파괴되어 특정 위해 미생물의 수가 증가되어 있는 상태이다. 대장염은 장내 미생물 생태계의 교란으로 인체 장내세포의 면역체계를 자극하거나, 외부 유해요소로 염증상태의 장내세포가 상주하고 있는 장내미생물의 환경에 영향을 주는 2가지의 원인으로 추정할 수 있다. 어떤 원인이든 정상적인 장내미생물 생태계의 교란은 대장염 상태의 보고이며, 국내외 많은 연구에서 교란된 장내미생물의 생태계가 회복될 시 대장염도 개선되었음을 보고하고 있다. 이러한 염증 상태의 장내미생물 생태계는 우리가 섭취하는 식물 추출물에 포함되어 있는 유효성분으로 회복 혹은 개선될 수 있음이 수많은 연구로 시사되는 바 많은 연구자들이 유용소재의 발굴에 힘쓰고 있다.
무순(radish sprouts)은 새싹채소의 한 가지로, 무의 싹을 말하며 '무순이'라고도 한다. 메틸메르캡탄(Methylmercaptan)과 배당체 시니그린(Sinigrin)의 분해로 생긴 머스터드 오일(Mustard oil)로 인하여 특유의 톡 쏘는 듯한 매운맛과 향기가 있는 특징이 있으며, 영양성분으로 비타민 A와 C, 칼슘, 카로틴 등이 풍부하게 함유되어 있다. 또한, 무순은 열을 제거하고 몸의 부기를 가라앉히며, 폐의 활동을 활발하게 해주는 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
대한민국 특허등록 제 10-1897770 호에는 무순 추출물이 혈중 총 콜레스테롤, LDL(Low density lipoprotein) 콜레스테롤 및 트리글리세라이드(Triglyceride)의 양을 유의하게 저하시키고, HDL(High density lipoprotein) 콜레스테롤의 양을 유의하게 증가시켜 이상지질혈증의 예방 및 치료에 우수한 효능을 가짐을 개시하고 있다.
또한, 대한민국 특허등록 제 10-1735242 호에는 테스테로스테론 감소 억제, 고환 크기 감소 억제, 정자 감소 억제, 항안드로겐 작용 및 전립선 특이항원 억제 효과 등을 통해서 남성 생식기 관련 질환의 개선, 예방 및 치료에 현저한 효과를 가지는 무순 추출물에 대해 개시하고 있다.
또한, 무순 추출물은 농도 의존적으로 항산화 활성을 증가시키고, 지방세포의 분화과정에서 무순 추출물의 처리 따라 지방세포의 지방축적 및 ROS 생성을 억제한다(Lee et al. 2014, Antioxidant and anti-adipogenic effects of Kohlrabi and Radish sprout extracts, KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL, Vol. 46, No. 5, pp. 531 ~ 537).
또한, 일본 무순은 정상 및 당뇨병 쥐 모두에서 저혈당 활성을 보이고 정상 쥐에서 부분적으로 지질대사를 개선하였으며, 일본 무순이 당뇨병이 있는 경우에 고혈당증을 완화하고 당뇨병의 1차 예방에 기여할 수 있는 잠재력을 가짐을 확인하였으나(Taniguchi et al. 2006, Effect of japanese radish (Raphanus sativus) sprout(Kaiware-daikon) on carbohydrate and lipid metabolisms in normal and strptozotocin-induced diabetic rats, Phytother. Res, 20, 274 - 278), 무순 추출물의 대장염의 개선, 예방 또는 치료효과에 대해서는 구체적으로 연구된 바는 없다.
한편, 본 발명자들은 대장염에 효과적인 천연물 소재에 관한 연구를 계속하던 중, 무순 추출물의 대장염 개선, 예방 또는 치료 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 무순 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 무순 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 무순 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다
본 발명에 의한 무순 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 개선, 예방 또는 치료용 조성물은 장염증으로 감소된 체중 및 대장의 길이가 회복되고, 대장 점막의 위축 및 염증 상태와, 혈중 및 조직세포의 사이토카인 생성을 억제하며, 장내 미생물총(마이크로바이옴)을 염증상태 전과 유사하게 회복시키므로, 대장염과 관련된 질병의 예방, 개선 또는 치료 효과를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 무순 추출물 처리에 따른 대장염 동물모델의 체중변화를 나타낸 결과이다.
도 2는 무순 추출물 처리에 따른 대장염 동물모델의 장길이 회복 효과를 나타낸 결과이다.
도 3은 무순 추출물 처리에 따른 점막의 위축 및 염증 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 4a는 무순 추출물 처리에 따른 대식세포에서 염증성 사이토카인 생성량을 나타낸 결과이고, 도 4b는 염증 관련 단백질 생성량을, 도 4c는 염증 관련 mRNA 생성량을 나타낸 결과이다.
도 5는 실험 동물에서 무순 추출물 처리에 따른 사이토카인, MPO(Myeleoperoxiase) 활성 및 PGE2(Prostaglandin E2) 변화를 나타낸 결과이다.
도 6은 무순 추출물 처리에 따른 미생물 다양성 지수 비교 분석 및 PCoA 분석을 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 무순 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
대장염(colitis)은 호전과 악화를 반복하며 6개월 이상 만성적으로 소화기관에 염증을 일으키는 질환으로 아직까지 정확한 발병 원인이나 발병의 기전이 밝혀지지 않았다. 일반적으로 DSS로 유발시킨 대장염 동물 모델의 경우, 초기에는 혈변, 체중감소, 대장의 축소 및 점막 궤양 등이 생기며 이러한 양상은 사람의 대장염과 흡사한 부분이 많아 대장염 연구에 많이 활용되고 있다.
현재까지 밝혀진 대장염의 유력한 발병원인 중 한 가지는 염증매개물질(proinflammatory mediator)의 과도한 생성으로 인해 장내 항상성이 파괴되어 일어나는 것으로 생각되고 있다. 대장염에서는 면역 반응을 유발하는 요인이 없어진 상황에서도 면역 조절기능의 결함으로 인하여 염증을 일으키는 세포가 병이 있는 부위로 계속 모이게 된다. 이들이 염증을 매개하는 인자들을 분비하는 반면 염증을 가라앉히는 항염증 작용은 약화되므로 염증 반응이 계속되어 증폭되는 것으로 설명할 수 있다. 따라서, 대장염 환자의 대장 조직에는 다양한 염증매개인자들의 발현양이 증가되어 있으며, 새로운 생물학적 치료법의 개발은 염증 매개인자의 생성을 차단하는데 집중되고 있다. 특히, iNOS와 COX-2는 전염증 효소로서, nuclear factor interleukin-6, fos/jun(AP-1), CCAAT/enhancer-binding protein(C/EBP), nuclear factor-kappa B(NF-κB)같은 전사인자에 의해 조절된다. 대장염에서는 NF-kB 활성으로 인하여 iNOS와 COX-2의 생성이 증가하고 이로 인해 심각한 염증을 유발한다. 섬유모세포와 대식세포 등에서 발현되는 COX-2는 성장인자와 mitogen에 유도되어 류마티스성 관절염, Crohn's disease, 궤양성 대장염과 같은 다양한 만성 염증성 질환을 유발한다. 따라서, 대장 내 염증성 사이토카인, COX-2 및 iNOS 생성을 조절하는 물질은 대장염 치료제 개발에 중요한 단서를 제공할 수 있을 것이라고 생각된다.
MPO는 HOCL 산화제 등 세포 독성물질의 생성 시 필요한 효소 촉매로써 마우스 대장염 모델에서 나타난 과립구 침윤현상을 평가하는 지표로 많이 사용된다. 호중구 침윤은 대장 점막 염증의 첫 단계로서 조직 손상, 점막 궤양 등의 임상증상을 나타내게 된다. 또한, 염증 반응을 유도하는 아라키돈산 대사로 생성된 중요한 염증 요소인 PGE2의 함량이 증가하면 조직 순환의 장애를 일으켜 염증반응을 악화시킬 수 있다. 따라서, MPO 및 PGE2의 생성량을 억제함으로써 대장염을 개선할 수 있다.
사람 장점막 표면에 정착하고 있는 장내 미생물총(enteric microbiota)은 장관 내부 생태계(ecosystem)를 구성하면서 숙주 면역반응을 조절하는 역할을 한다. 그런데 병원균(pathogen)에 의한 숙주반응에 대해서는 비교적 잘 알려진 반면, 장내 미생물총과 숙주와의 관계에 대해서는 연구가 미약하다. 또한 아직까지 정상적인 장내 미생물총 구성이 명확하게 확립되어 있지 않다. 그럼에도 불구하고 장내 미생물총의 조성 변화와 대장염이 깊은 관련이 있을 것이라 여겨지고 있다. 대장염의 병인은 아직까지 명확하게 밝혀지지 않고 있으나, 다양한 환경 요인들이 장점막의 면역반응을 왜곡시킴으로써 초래되는데, 이때 유전적인 감수성이 있는 개체에서 질병 발현이 높아진다는 것이 일반적인 개념으로 정립되고 있다. 환경 요인의 대표적인 예로 장내 미생물총의 조성 변화를 들 수 있다. 즉, 대장염에서는 장내 미생물총의 조성이 변화되어 있고 장점막에 부착된 균수가 증가되어 있다. 면역학적인 관점에서 볼 때, 크론병(Crohn’s disease)은 interferon (IFN)-γ와 tumor necrosis factor (TNF)-α 및 조직에 침윤한 T helper 17 (Th17) 세포의 증가를 특징으로 하는 Th1과 유사한 면역반응(Th1-like immune response)을 보이는 반면, 궤양성 대장염(ulcerative colitis)은 Th17 세포의 발현 증가뿐만 아니라 비정상적인 IL-13의 증가와 같은 Th2와 유사한 면역반응을 보이고 있다. 즉, 이같은 비정상적인 면역 반응은 장내 미생물총의 조성이 왜곡되어 유발된다는 이론이 대두되고 있다. 예를 들어 크론병 환자에서 회장(ileum) 절제 후 수술 말단부위로부터 대변의 이동경로를 전환시키면 대장염의 재발이 차단되는 반면, 제거한 회장에 있는 장내용물(intestinal contents)을 다시 주입(infusion)시키면 수술 후 재발(postoperative recurrence) 현상이 관찰된다. 이와 같은 연구들은 장내 미생물총이 대장염 발현의 근본 원인은 아닐지라도 대장염과 밀접하게 관련되어 있음을 시사해 주고 있다.
무는 겨자과에 속하는 1년생 또는 월년생 초본으로 삼국시대 때부터 중국에서 도입되어 각 지방에 토착한 재래종이 많다. 무의 성분은 수분이 약 93%, 조단백질이 1%, 당질은 주로 글루코스로 3% 정도, 비타민 C의 함량은
19∼39 mg%를 함유하고 있다. 무의 조직에는 섬유소와 펙틴질, 각종 무기질과 소화효소인 아밀라아제(amylase)등이 있고, 메틸 메르캅탄(methyl mercaptane)이나 머스타드 오일(mustard oil)과 같은 특유의 방향성분을 가지고 있다.
상기 무순(radish sprouts)은 싹채소로 무의 씨앗에서 발아하는 새순을 지칭하며, 십자화과(Brassicaceae)에 속하는 식물이다. 비타민 A와 C, 칼슘, 카로틴 등이 풍부하게 함유되어 있으며, 열을 제거하고 몸의 부기를 가라 앉히며 폐의 활동을 활발하게 해주는 효능이 있다. 파종 후 수확하는 기간이 대략 6 ~ 7일이므로 대량생산에 적합한 장점이 있다. 또한, 무순은 심혈관 질환예방효과를 갖는 알리신, 소화작용을 원활하게 하는 디아스타제, 발암물질을 분해하는 옥시다제와 같은 성분을 포함하고 있다.
상기 추출물은 1) 무순에 추출 용매를 가하여 추출하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축하고 건조하여 무순의 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 무순은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용될 수 있으며, 상기 무순의 전체 또는 일부를 이용할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 추출 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 구체적으로는 C1 내지 C2의 저급 알코올일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 메탄올 또는 에탄올일 수 있다. 추출 방법으로는 감압고온 추출, 열탕 추출, 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 추출, 냉침 추출, 증기 추출, 상온 추출 또는 초음파 추출 등 당업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다.
본 발명자들은 DSS(Sextran Sulfate Sodium salt)로 대장염을 유발한 실험쥐에서 감소한 체중이 무순 추출물 처리에 의해 회복되는 것을 확인하였다(도 1).
또한, 무순 추출물이 대장염 증상의 하나인 장 길이 감소를 회복시키는지 확인하기 위해, 추출물을 처리한 후 마우스에서 대장을 적출하여 그 길이를 확인하였다. 그 결과, 모든 농도의 무순 추출물 처리군에서 장 길이 회복 효과를 확인하였다(도 2).
또한, 조직병리학적 관점에서 염증을 확인하기 위해 실시한 H&E 염색을 통해 무순 추출물 처리군에서 점막의 위축 및 염증이 개선되는 것을 확인하였다(도 3 및 표 1).
in vitro에서 무순의 항염증 효과를 확인하기 위해 대식세포에서 실시한 실험을 통해 무순 추출물이 농도 의존적으로 염증성 사이토카인(IL-6, TNF-α, MCP-1 및 IL-1β)의 발현을 억제하는 것을 확인하였으며 특히, 추출물 처리에 따른 IL-6의 억제가 두드러지게 나타났다(도 4a). 무순 추출물 처리에 따른 염증 관련 단백질 변화를 확인하기 위해 Western blotting을 수행한 결과, 염증 관련 단백질인 iNOS, COX-2, TNF-α 및 IL-1β의 발현량이 무순 추출물 처리에 의해 유의하게 억제되는 것을 확인하였다(도 4b). 앞서 확인한 염증성 사이토카인 및 염증 관련 단백질의 mRNA(iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, IL-1β 및 MCP-1)의 생성 또한 무순 추출물 처리에 따라 농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 4c).
또한, in vivo에서도 무순 추출물이 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는지 확인한 결과, IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 생성이 무순 추출물 농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 5). 조직의 염증반응 중 하나로 호중구의 조직 침투를 들 수 있는데, 이러한 호중구 침투를 측정하기 위해 호중구에서 많이 발현하는 과산화효소인 MPO의 활성 및 염증 반응을 유도하는 아라키돈간 대사의 중요한 염증 요소인 PGE2의 생성을 확인한 결과, 무순 추출물 처리군에서 MPO 및 PGE2의 생성이 억제되는 것을 확인하였다(도 5).
건강한 사람과 대장염 환자 사이에 장내 미생물의 다양성이 차이를 나타낸다는 연구가 많이 발표되고 있다. 이 연구 결과들을 근거로 하여, 정상이라고 간주되는 장내 미생물총의 조성이 변화함으로써 대장염이 발생한다는 이론이 매우 논리적으로 제시되고 있다. 즉, 건강인에서는 장내 미생물들의 균형이 잘 이루어져 정상적인 장기능을 수행하고 있음에 비하여, 이 균형이 파괴되는 현상이 일어나면 정상적인 면역반응을 유도할 수 있는 균에 비해 ‘친염증성(proinflammatory) 면역반응’을 유도하는 세균들이 장내에 정착하고, 그 결과 대장염과 관련된 염증반응이 증가한다. 따라서 본 발명자들은 DSS를 처리에 따른 장내 미생물총(마이크로바이옴) 변화와 무순 추출물 처리에 따른 장내 미생물총 회복을 확인하였다. DSS 처리로 인해 대조군과 차이를 보였던 장내 미생물총이 무순 추출물에 의해 대조군과 가장 가까운 거리로 회복되는 것을 확인하였다(도 6).
따라서, 본 발명의 무순 추출물은 대장염 예방 및 치료제로써 유용하게 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 혼합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용, 또는 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사 또는 근육 내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 본 발명의 혼합 추출물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100
㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 대장염 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 대장염은 급성 장염, 세균성 대장염, 세균성 이질, 콜레라, 장티푸스, 여행자 설사, 바이러스성 대장염, 위막성 대장염, 아메바성 대장염, 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 허혈성 대장염, 베체트 대장염, 약제 유발 대장염, 현미경적 대장염, 교원성 대장염, 림프구성 대장염 또는 방사선 대장염일 수 있으며, 본 발명의 대장염 치료 범위는 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 무순 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다.
단 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 무순 추출물의 제조
무순의 추출액을 얻기 위해 400g 무순에 95% 에탄올 4L 비율로 homogenizer로 분쇄한 후, 상온에서 24시간 방치하였다. 무순 추출액은 여과지 (NO. 2, Whatman, Maidstone, England)를 사용하여 여과한 후, rotary vacuum evaporator로 37℃에서 감압 농축하였다. 농축물은 동결건조한 후 -70℃로 보관하면서 실험시료로 이용하였다.
<실험예 1> 무순 추출물의 대장염에 의한 체중감소 억제 효과
체중 감소는 대장염의 임상 증상 중 하나이므로, DSS(Sextran Sulfate Sodium salt)로 대장염을 유발한 실험쥐에 상기 무순 추출물을 처리한 후 체중 변화를 확인하였다. 실험 동물은 6주령의 암컷 BALB/c 마우스를 cage 당 3~4 마리씩 나누어 키웠고, 21±2 ℃, 상대습도 50±10 %, 명암주기 12 시간이 유지되는 환경에서 사육하였다. 1주간의 적응기를 거친 후, 군당 평균체중이 비슷하도록 blank군 (대조군, n=8), DSS군 (음성 대조군, n=10), RS 10mg/kg군 (DSS+RS 10mg/kg, n=10), RS 50mg/kg군 (DSS+RS 50mg/kg, n=10), RS 100mg/kg군 (DSS+RS 100mg/kg, n=10), 5-ASA (DSS+ASA 50mg/kg, n=8)으로 분류하였다. 동일한 기간 동안 blank군을 제외한 나머지 5군은 3% DSS (Dextran Sulfate Sodium)를 식수로 공급하였으며, 동시에 0.9% 식염수에 무순 추출물과 염증성 장 질환의 치료제로 알려진 5-ASA (5-Aminosalicylic acid)를 양성물질 대조군으로서 용량별로 용해하여 매일 경구 투여하였다. 동일한 시간에 체중을 측정하고 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 2일마다 식수를 추가적으로 공급하였다.
그 결과, 도 1과 같이 무순 추출물을 처리한 모든 군에서 체중 감소를 억제하는 효과를 보였으며, 특히, DSS 처리군에서는 약 31% 가까이 감소한 체중이 무순추출물 100 mg/kg 처리농도에서는 약 19% 감소한 것으로 나타났으며 약 17% 감소한 양성물질 대조군(5-ASA)보다 유의적으로 체중감소가 억제되는 것을 확인하였다.
<실험예 2> 무순 추출물의 대장염에 의한 장길이 축소 억제 효과
대장염의 조직병리학적인 특징 중 하나인 대장 길이의 감소가 무순 추출물 처리에 의해 회복되는지 확인하기 위해 대장염이 유도된 실험쥐에서 대장의 길이를 측정하였다. 모든 개체의 장 길이는 14일째 실험동물을 희생한 다음 장을 적출하였고, 충수돌기와 대장접합부에서 직장상부까지의 길이를 미터단위로 측정하여 산출하였다. 희생된 실험동물의 복부를 절개한 다음 대장말단에서 맹장부분까지 절제하여 장을 적출하였다. 맹장의 하단에서 약 1cm 떨어진 부분을 절개하여 생리식염수로 세척한 다음 수분을 제거하였다.
그 결과, 도 2와 같이 무순 추출물이 모든 농도에서 DSS에 의해 축소된 대장의 길이를 회복시키는 것을 확인하였다. 특히, 100 mg/kg 처리농도의 무순 추출물에서 대조군 대비 약 38%의 회복률을 보여, 26%의 회복률을 보인 양성물질 대조군(5-ASA)보다 더 큰 효과를 나타내었다.
<실험예 3> 무순 추출물의 점막 위축 및 염증 억제 효과
무순 추출물에 의한 대장의 염증을 조직병리학적 관점에서 확인하고자, H&E 염색과 조직병리학적 검경을 시행하였다. 실험예 2와 동일하게 결장을 적출하여 준비하고 절개된 모든 개체의 결장을 10% 포르말린 용액에 고정하여 파라핀 절편을 제작하였다. 파라핀 블록 5 μm로 절단한 다음 슬라이드를 제작하였다. 제작한 슬라이드는 hematoxylin-eosin (H&E) 염색을 수행한 다음 광학현미경에서 100배와 400배의 배율로 관찰하였다.
대장조직의 H&E 염색 결과, DSS 처리군에서는 점막의 위축(화살표) 및 염증(화살표 머리)이 관찰되어 염증 유도가 잘 되었음을 확인하였다(도 3). 이에 반해, 무순 추출물 100 mg/kg 처리군에서는 점막의 위축 및 염증이 개선되는 것을 확인하였다. 위축 및 염증을 확인하기 위해 각 실험군 마다 5 마리의 실험쥐를 사용하였고 위축 및 염증의 정도에 따라 그 등급을 나누어 표 1에 나타내었다. 대조군과 비교하여 무순 추출물 처리군(R10, R50, R100)은 용량 의존적으로 대장에서 점막의 위축 및 염증 소견이 감소하는 것이 관찰되었다. 또한, 무순 추출물 100 mg/kg 처리군(R100)과 양성물질 대조군(ASA)의 점막 위축 및 염증 개선에 대한 소견정도는 차이가 나지 않는 것으로 판단되었다. 결론적으로 무순 추출물은 처리 용량이 증가함에 따라 대장의 위축 및 염증 소견을 감소시키며 최고 처리농도에서는 양성물질 대조군과 같이 약하거나 아주 약한 점막의 위축 및 아주 약한 염증 소견을 나타내었다.
(등급) ±:아주 약한, +:약한, ++:중간의, +++:뚜렷한
<실험예 4> i n vitro 에서 무순 추출물의 염증성 사이토카인과 염증 관련 단백질 및 mRNA 억제 효과
in vitro에서 무순 추출물의 염증 억제 효과를 확인하기 위해 대식세포에서 염증성 사이토카인의 생성량을 확인하였다. RAW 264.7 대식세포를 10% FBS fetal bovine serum (FBS, gibco, USA)과 1% penicillin streptomycin solution (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 배양액으로 하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양한 RAW 264.7 대식세포에 무순 추출물을 농도별로 4시간 동안 전처리하고 LPS(10 ng/mL)을 각 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포배양액을 수거하여 Griess reagent와 1:1의 비율로 혼합하여 10분 간 실온에서 암반응 시킨 후, microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
또한, 무순 추출물 처리에 따른 염증 관련 단백질 변화를 확인하기 위해 Western blotting을 수행하였다. Raw 264.7 대식세포를 2×105 cells/well 가 되도록 6 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후 무순 추출물을 농도별로 4시간 동안 전처리한 다음, LPS (10 ng/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양한 well을 PBS로 세척한 후 세포를 얻어 원심분리 하여 pellet에 lysis buffer를 가하여 얼음에서 30분간 incubation한 후 60초간 sonication을 하였다. lysis buffer의 점성이 없어졌음을 확인한 뒤 10000 rpm으로 10분 동안 원심분리 하여 상등액을 모았다. 모은 상등액은 bovine serum albumin을 사용하여 단백질을 정량하였다. 정량한 단백질을 동등한 농도로 맞춘 후, 4Х smaple buffer에 넣고 100℃에서 10분간 불활성화 시킨 후 12％ SDS poly-acylamide gel에 전기영동 하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane으로 transblotting 한 후 5％ skim milk로 2시간동안 blocking하였다. 1차 항체는 1:1,000 비율에 맞게 희석하고 4℃에서 overnight 시킨 후 tris-buffered saline Tween-20 (TBST)로 10분간 3회 세척하였고 2차 항체는 1:3,000의 비율로 희석하여 2시간 상온에서 부착시켰다. TBST buffer로 10분간 3회 세척한 후 ECL solution을 처리하여 Chemi-DOC (Bio-rad, USA)으로 측정하였다. 실험에 사용된 항체는 iNOS (Santa-cruz, sc7271), COX-2 (abcam, ab15191), IL-1β (abcam, ab9722), TNF-α (abcam, ab9739), GAPDH (abcam, ab9485)를 TBS-T에 희석하여 사용하였다.
단백질 수준에서뿐만 아니라 mRNA 수준에서도 염증 관련 인자들의 변화를 확인하였다. 배양한 RAW 264.7 대식세포를 PBS로 2회 세척하고 NucleoSpin® RNA Plus kit (Macherey-Nagel, Germany)를 이용하여 RNA를 분리하였다. RNA 정량은 NanoDrop (NanoDrop ONE, Thermo Fisher Scientific Inc.)을 이용한 후 1 μg의 total RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.)을 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA 1 μL, primer 1 μL, SYBR master mix 10 μL, RNA-free water 8 μL와 함께 real-time PCR을 수행하였다.
그 결과, LPS로 염증반응이 유도된 대식세포에서 무순 추출물이 사이토카인 (IL-6, TNF-alpha, MCP-1, IL-1beta) 생성을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 4a). 또한 농도가 높을수록 억제효과가 커지는 농도의존적인 경향을 보였다. Western blot 기법을 이용한 iNOS, COX-2, TNF-alpha, IL-1beta 와 같은 염증관련 단백질의 생성정도를 조사한 결과 또한 무순 추출물의 처리농도가 높아질수록 밴드가 연해지는 경향을 보였다(도 4b). 즉, 염증관련 단백질 또한 농도의존적으로 무순 추출물에 의해 억제되는 효과를 보였다. 게다가, 염증관련 mRNA 수준에서도 무순 추출물을 처리할수록 생성이 유의적으로 억제되는 경향을 보였다(도 4c).
<실험예 5> in vivo 에서 무순 추출물의 염증성 사이토카인 생성 억제 효과
DSS로 유도된 장염증 동물모델에서 무순 추출물을 처리한 실험쥐의 혈액 중 사이토카인 농도를 확인하였다. 실험동물의 꼬리에서 혈액을 채취한 후, 각각의 혈액을 원심분리하여 혈청을 분리하여 실험하였다. 혈청의 cytokine은 ELISA kit (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 IL-6, IL-1β, TNF-α, PGE2를 측정하였다. 또한 염증 반응에 관여하는 세포에서 분비되는 과산화효소 MPO(Myeleoperoxiase) 활성을 확인하였다. 장의 조직 (50-100 mg)의 무게를 측정하고, 대변을 1XPBS로 완전히 세척한 다음 0.5% hexaedcyltrimethyl ammonium bromide (pH 5.4)를 이용하여 조직을 균질화하고, 동결과 해동을 3회 반복하여 현탄액을 만들었다. 그 후, 4 ℃에서 10,000 rpm으로 원심분리하여 흡광도에 영향을 주지 않을 정도의 상층액을 얻었다. 이 상층액을 사용하여 MPO assay kit (Abcam, Cambridge, UK)의 방법에 따라 측정하였다. 흡광도의 값은 인간 호중구 MPO의 표준 곡선에 의해 보정되었으며, MPO의 1 unit (U)은 1 nmol/min의 H2O2를 분해하는 활성으로 정의하였다. 측정결과는 조직의 무게 (g)에 대한 U으로 표기하였다.
그 결과, 도 5에서와 같이 무순 추출물은 모든 처리농도에서 양성물질 대조군(DSS처리, 무순 무처리) 대비 IL-6, IL-1β, TNF-α와 같은 사이토카인 생성량이 유의적으로 감소하였으며, 특히 고농도(100 mg/kg)에서는 양성물질 대조군(ASA)과 유사한 가장 높은 억제효과를 보였다. 과산화효소 MPO 활성에서는 양성물질 대조군 대비 무순 추출물 50 및 100 mg/kg 처리가 유의적으로 억제하는 효과를 보였다. 그리고 염증반응을 유도하는 Arachidonic acid 에서 유래된 PGE2(Prostaglandin E2)의 생성량 또한 무순 추출물의 모든 처리농도에서 양성물질 대조군 대비 유의적인 감소를 보였다.
<실험예 6> 무순 추출물의 장내 마이크로바이옴 개선 효과
숙주가 장내 미생물총(microbiota)를 유지하는 이유는 영양소의 소화와 흡수, 병원균의 정착 방해, 정상적인 면역반응의 유지 등을 들 수 있다. 그렇지만 개체에 따라서는 장내 미생물총에 대한 면역반응이 질병으로 발전할 가능성이 있다. 이와 같은 병적인 기능을 차단하기 위하여 숙주는 장관 미생물총에 대한 면역반응을 적절히 통제하고 있다. 즉, 미생물총가 숙주 면역반응 사이에는 균형이 형성되어 있다고 할 수 있다. 이 균형이 파괴되면 미생물총의 조성 변화(dysbiosis)가 초래되어 만성 염증으로 이어진다. 즉, dysbiosis를 초래할 수 있는 인자들과 균의 부착 그리고 장점막 내부로의 침입을 증가시킬 수 있는 요인들은 대장염 발생과 지속을 위한 중요한 인자라고 할 수 있다. 따라서, DSS로 유도된 대장염 동물모델에 무순 추출물을 농도별로 처리한 후 미생물총을 분석하였다.
실험동물의 분변 내 microbial DNA는 PowerSoil® DNA Isolation Kit (Cat. No. 12888, MO BIO)를 이용하여 추출하였다. 추출된 DNA는 PicoGreen과 Nanodrop을 이용하여 순도를 확인 후 정량화하였다. 이후 각 샘플의 16S V3-V4 zone의 증폭을 위하여 미리 제작된 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 products는 MiSeq™ platform (Illumina, San Diego, USA)을 사용하여 염기서열 분석을 실시하였다. MiSeq raw data는 sequencing이 완료된 후, 인덱스 (Index) 서열을 이용하여 시료별로 분류하고 시료별 FASTQ 파일을 생성하였다. fastp 프로그램을 이용하여 어댑터 서열을 제거하고, 두 Read가 겹치는 영역에 대해서 오류 교정 (error correction)을 진행하였다. 각 시료별로 구분된 paired end data는 FLASH (1.2.11)를 사용하여 하나의 서열로 조립하였다. 하나로 조립된 서열의 길이가 400bp 미만, 500bp 초과인 서열들은 제거하였다. 얻어진 서열은 CD HIT EST 기반의 OTU 분석 프로그램인 CD HIT OTU를 이용하여 sequencing error로 간주되는 낮은 품질의 서열, Ambiguous 서열, C himera 서열 등을 제거한 후, 97% 이상의 서열 유사성을 갖는 서열끼리 clustering 하여 종 수준의 OTU 를 형성하였다. 각OTU의 대표서열은 Reference DB (NCBI 16S Microbial)에 BLAST+ V2.9.0 4 을 수행하여, 유사성이 가장 높은 subject의 organism 정보로 taxonomic assignment를 수행하였다. 이때, DB에 매치되는 best hit의 query coverage가 85% 미만이고, 매치된 영역의 Identity가 85% 미만이면, taxonomy를 정의하지 않았다. 위의 OTUs abundance taxonomy 정보로 QIIME(v1.9) 을 이용하여, 다양한 미생물 군집 비교 분석을 수행하였다. 시료 내 미생물 군집의 종 다양성 및 균등도를 확인하기 위해, Shannon Index를 구하고, Rarefaction curve와 Chao1 값을 통해 α-diversity 정보를 확인하였다. Weighted UniFrac distance를 기반으로 샘플 사이의 β-diversity를 구하고, PCoA를 통해 샘플 사이의 유연관계를 시각화하였다. α-diversity는 종 풍부도란 개념에 가장 가까운 측정 방법이며 각기 다른 생태계에 서식하는 군집 간 종수를 비교할 때 흔히 사용되고 그 중에서도 Shannon Index는 샘플에 존재하는 종의 다양성을 추정하는 값으로 값이 클수록 다양성이 큼을 의미한다. β-diversity는 종 조성이 다양한 환경 기울기에 따라 얼마나 변하는지 그 정도를 나타내는 것으로 각 샘플 간의 거리를 측정하여 비교할 수 있다. β-diversity는 미생물종의 유연관계를 고려한 주성분분석법(PCoA) 을 이용하였고 시료 간의 거리에 영향을 미치는 다양한 변수를 저차원으로 축소하여 전체 변수를 잘 설명할 수 있는 2가지의 성분을 선택하여 시각화하였다.
분변에서 추출한 미생물의 메타지놈 분석을 토대로 장내 미생물의 다양성을 나타내는 α-diversity에 해당하는 shannon index을 구하였다. shannon index는 무순 추출물 100 mg/kg 처리군이 대조군과 유사한 값으로 높은 값을 보였으며 양성물질(ASA) 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았다(도 6a). 즉, DSS 처리로 인해 염증이 유발되면 미생물의 종류가 감소하나 무순 추출물 처리에 의해 미생물의 다양성이 대조군과 유사하게 회복되는 것을 확인하였다. 대조군, 무순 추출물 처리군 및 양성물질 대조군 간 장내 미생물의 차이를 나타내는 β-diversity의 확인을 위하여 미생물 종간의 유연관계를 적용시킨 weighted PCoA를 분석을 수행한 결과, 도 6b와 같이 무순 추출물 100 mg/kg 처리군은 대조군과 가까운 거리를 나타냈으며 특히 전체 변수 혹은 데이터를 가장 폭 넓게 설명할 수 있는 제 1 주성분 차원에서도 양성물질 대조군보다 더 가까운 장내 미생물총을 보였다. 이는 DSS 처리로 인해 대조군과 차이를 보였던 장내 미생물총이 무순 추출물에 의해 대조군과 유사하게 회복되는 것을 나타낸다.

Claims (14)

  1. 무순 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 무순 에탄올 추출물은 90 내지 100%(v/v) 에탄올을 사용하여 추출하여 수득한 것임을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 대장염은 급성 장염, 세균성 대장염, 세균성 이질, 콜레라, 장티푸스, 여행자 설사, 바이러스성 대장염, 위막성 대장염, 아메바성 대장염, 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 허혈성 대장염, 베체트 대장염, 약제 유발 대장염, 현미경적 대장염, 교원성 대장염, 림프구성 대장염 또는 방사선 대장염인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 점막의 위축을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 염증을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 염증 억제는 염증성 사이토카인 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 IL-6, TNF-alpha, MCP-1 및 IL-1 beta인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 장내 마이크로바이옴 개선 효과를 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 무순 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 점막의 위축을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 염증을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 장내 마이크로바이옴 개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.












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