CN105748539A - 新疆圆柏总黄酮提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新疆圆柏技术领域，是一种新疆圆柏总黄酮提取物及其制备方法和应用；按下述方法得到：将新疆圆柏枝叶粉碎干燥后脱脂，脱脂后用乙醇溶液回流提取，提取后浓缩，经硅胶柱除杂，再经大孔树脂富集纯化后得到本发明新疆圆柏总黄酮提取物；本发明较传统方法具有以下优点：（1）避免了酸和铅盐的使用，具有成分稳定、不易水解和无重金属残留；（2）利用硅胶除去油溶性杂质后，可有效降低大孔树脂的污染，大孔树脂再生容易；（3）可在密闭环境下实现对新疆圆柏中的黄酮类成分富集纯化，且总黄酮含量高、工艺方法操作简单、成本低、无污染；同时本发明新疆圆柏总黄酮提取物具有较好的抗炎镇痛作用，可用于关节炎疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及新疆圆柏技术领域，是一种新疆圆柏总黄酮提取物及其制备方法和应用。
背景技术
新疆圆柏Juniperussabina，又名砂地柏、叉子圆柏和臭柏等，为柏科圆柏属植物常绿匍匐灌木，广泛分布于我国新疆、甘肃、内蒙和陕北的干旱荒山和沙地之中。由于具有较好地抗风蚀、保持水土、固沙护坡以及改善环境的能力，该植物在上述地区已开始大面积栽培种植。新疆圆柏枝叶在我国民间常用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎等疾病的治疗，被收载于《维吾尔药志》、《新疆中草药手册》和《中国沙漠药用植物》等医药文献中。目前，国内外对新疆圆柏的研究主要集中在其化学成分及生态学方面，在药理作用上的相关研究较少。近年来仅报道了抗菌、抗炎、抗氧化和杀虫等方面的生物活性，其中西北农林科技大学已就新疆圆柏的杀虫活性申请了多篇发明专利（ZL200310122231.1,ZL9405885.9）。新疆圆柏包含黄酮、木脂素和萜类等多种类型的化学成分，其中黄酮类化合物是新疆圆柏的主要特征性化合物之一。经对有关黄酮提取工艺现有技术文献的检索发现，田旭平在《新疆圆柏的提取、精制与抗氧化作用的研究》（新疆大学硕士学位论文）一文中提出：用三种不同的方法纯化新疆圆柏总黄酮。其中醋酸铅沉淀法，总黄酮含量为53%；阳离子树脂法，总黄酮含量为18%；酸化法，总黄酮含量为63%。这三种方法的不足之处在于：阳离子交换树脂法得到的总黄酮纯度低；酸化法容易使黄酮苷水解成苷元；醋酸铅沉淀法操作繁琐，且引入了重金属。新疆圆柏枝叶中存在大量的油溶性物质，许芳在《新疆圆柏有效成分及其总黄酮对大鼠佐剂性关节炎抑制作用的实验研究》（新疆医科大学硕士学位论文）一文中采用大孔树脂聚酰胺联用的方法对新疆圆柏枝叶中的黄酮类成分进行富集纯化，所得到的总黄酮提取物黄酮含量高，但其油溶性成分除不干净，影响总黄酮提取物的质量，也影响大孔吸附树脂的再生。
发明内容
本发明提供了一种新疆圆柏总黄酮提取物及其制备方法和应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有提取新疆圆柏总黄酮的方法存在总黄酮含量低、易使黄酮苷水解成苷元、操作繁琐且引入了重金属、脂溶性成分除不干净影响总黄酮提取物的质量，也影响大孔吸附树脂再生的问题。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种新疆圆柏总黄酮提取物，按下述方法得到：第一步，将新疆圆柏枝叶粉碎后干燥，干燥后得到混合药材，混合药材用石油醚脱脂，在石油醚脱脂后的药材中加入乙醇溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏和硅胶混合拌样后干燥，干燥后装入已装填好的硅胶填料层析柱，先用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行二次脱脂，再用乙醇溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后，得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加去离子水稀释后得到稀释液；第四步，大孔树脂柱对稀释液进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到新疆圆柏总黄酮提取物。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述在第一步中，每次回流提取时乙醇溶液的加入量为混合药材质量的6倍至20倍；或/和，每次提取时间为1h至2h，每次回流提取时乙醇溶液为体积百分比为50%至70%的乙醇水溶液。
上述在第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05至1.20后，得到一次浸膏。
上述在第二步中，一次浸膏和硅胶按质量比为1:1至1:2进行混合拌样，拌样后在温度为90℃至95℃下进行干燥，干燥时间为6h至12h；或/和，硅胶填料层析柱的径长比1:1.5至1:2。
上述在第二步中，石油醚和乙酸乙酯的混合溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍至7倍，混合溶液为石油醚和乙酸乙酯按体积比为2:8混合得到的混合溶液；或/和，在第二步中，乙醇溶液为体积百分比为60%至95%的乙醇水溶液，乙醇溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍至8倍；或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05至1.20后，得到二次浸膏。
上述在第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:5至1:12稀释后得到稀释液。
上述在第四步中，稀释液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的1/20倍至1/8倍，去离子水的上柱量为大孔树脂柱柱体积的8倍至12倍，乙醇溶液为体积百分比为60%至80%的乙醇水溶液，乙醇溶液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，在第四步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.30至1.50，干燥时间为12h至16h，干燥温度为50℃至60℃。
上述大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种新疆圆柏总黄酮提取物的制备方法，按下述步骤进行：第一步，将新疆圆柏枝叶粉碎后干燥，干燥后得到混合药材，混合药材用石油醚脱脂，在石油醚脱脂后的药材中加入乙醇溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏和硅胶混合拌样后干燥，干燥后装入已装填好的硅胶填料层析柱，先用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行二次脱脂，再用乙醇溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后，得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加去离子水稀释后得到稀释液；第四步，大孔树脂柱对稀释液进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到新疆圆柏总黄酮提取物。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述在第一步中，每次回流提取时乙醇溶液的加入量为混合药材质量的6倍至20倍；或/和，每次提取时间为1h至2h，每次回流提取时乙醇溶液为体积百分比为50%至70%的乙醇水溶液。
上述在第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05至1.20后，得到一次浸膏。
上述在第二步中，一次浸膏和硅胶按质量比为1:1至1:2进行混合拌样，拌样后在温度为90℃至95℃下进行干燥，干燥时间为6h至12h；或/和，硅胶填料层析柱的径长比1:1.5至1:2。
上述在第二步中，石油醚和乙酸乙酯的混合溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍至7倍，混合溶液为石油醚和乙酸乙酯按体积比为2:8混合得到的混合溶液；或/和，在第二步中，乙醇溶液为体积百分比为60%至95%的乙醇水溶液，乙醇溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍至8倍；或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05至1.20后，得到二次浸膏。
上述在第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:5至1:12稀释后得到稀释液。
上述在第四步中，稀释液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的1/20倍至1/8倍，去离子水的上柱量为大孔树脂柱柱体积的8倍至12倍，乙醇溶液为体积百分比为60%至80%的乙醇水溶液，乙醇溶液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，在第四步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.30至1.50，干燥时间为12h至16h，干燥温度为50℃至60℃。
上述大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种新疆圆柏总黄酮提取物在制备治疗关节炎疾病药物中的应用。
本发明较传统方法具有以下优点：（1）避免了酸和铅盐的使用，本发明新疆圆柏总黄酮提取物具有成分稳定、不易水解、无重金属残留；（2）利用硅胶除去油溶性杂质后，可有效降低大孔树脂的污染，大孔树脂再生容易、重复利用度高；（3）可在密闭环境下实现对新疆圆柏中的黄酮类成分富集纯化，且总黄酮含量高、工艺方法操作简单、成本低、无污染；同时本发明新疆圆柏总黄酮提取物具有较好的抗炎镇痛作用，可用于关节炎疾病的治疗。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
实施例1，该新疆圆柏总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，将新疆圆柏枝叶粉碎后干燥，干燥后得到混合药材，混合药材用石油醚脱脂，在石油醚脱脂后的药材中加入乙醇溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏和硅胶混合拌样后干燥，干燥后装入已装填好的硅胶填料层析柱，先用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行二次脱脂，再用乙醇溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后，得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加去离子水稀释后得到稀释液；第四步，大孔树脂柱对稀释液进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩干燥后，得到新疆圆柏总黄酮提取物。本发明得到的新疆圆柏总黄酮提取物为棕黄色粉末，得率为6.0%至8.0%；新疆圆柏总黄酮中黄酮含量测定方法按《中国药典》一部项下测定，槲皮苷的高效液相测定方法为：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈:0.036mol/L磷酸溶液(0～15min,21:79～25:75；15～20min,25:75～21:79)为流动相，检测波长为266nm。理论板数按槲皮苷峰计应不低于5000。本发明得到的新疆圆柏总黄酮提取物中总黄酮的质量百分含量为65%至70%；槲皮苷的质量百分含量为2.0%至4.0%。
实施例2，作为上述实施例的优化，在第一步中，每次回流提取时乙醇溶液的加入量为混合药材质量的6倍至20倍；或/和，每次提取时间为1h至2h，每次回流提取时乙醇溶液为体积百分比为50%至70%的乙醇水溶液。
实施例3，作为上述实施例的优化，在第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05至1.20后，得到一次浸膏。
实施例4，作为上述实施例的优化，在第二步中，一次浸膏和硅胶按质量比为1:1至1:2进行混合拌样，拌样后在温度为90℃至95℃下进行干燥，干燥时间为6h至12h；或/和，硅胶填料层析柱的径长比1:1.5至1:2。
实施例5，作为上述实施例的优化，在第二步中，石油醚和乙酸乙酯的混合溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍至7倍，混合溶液为石油醚和乙酸乙酯按体积比为2:8混合得到的混合溶液；或/和，在第二步中，乙醇溶液为体积百分比为60%至95%的乙醇水溶液，乙醇溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍至8倍；或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05至1.20后，得到二次浸膏。
实施例6，作为上述实施例的优化，在第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:5至1:12稀释后得到稀释液。
实施例7，作为上述实施例的优化，在第四步中，稀释液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的1/20倍至1/8倍，去离子水的上柱量为大孔树脂柱柱体积的8倍至12倍，乙醇溶液为体积百分比为60%至80%的乙醇水溶液，乙醇溶液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，在第四步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.30至1.50，干燥时间为12h至16h，干燥温度为50℃至60℃。
实施例8，作为上述实施例的优化，大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂。
实施例9，该新疆圆柏总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，将新疆圆柏枝叶粉碎后干燥，干燥后得到混合药材，混合药材用石油醚脱脂，称取2.0kg石油醚脱脂后的药材，在石油醚脱脂后的药材中加入乙醇溶液煮沸后回流提取2次，每次回流提取时乙醇溶液的加入量为混合药材质量的6倍，每次提取时间为1h，每次回流提取时乙醇溶液为体积百分比为70%的乙醇水溶液，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05后，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏和硅胶按质量比为1:1进行混合拌样，拌样后在温度为90℃下进行干燥，干燥时间为6h，干燥后装入已装填好的硅胶填料层析柱，硅胶填料层析柱的径长比1:1.5，先用石油醚和乙酸乙酯按体积比为2:8混合得到的混合溶液进行二次脱脂，石油醚和乙酸乙酯的混合溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍，再用体积百分比为60%的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05后，得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后得到稀释液；第四步，D101大孔树脂柱对稀释液进行吸附，稀释液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的1/20倍，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水的上柱量为大孔树脂柱柱体积的8倍，去离子水洗脱后用体积百分比为60%的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇溶液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.30，然后在温度为50℃下干燥16h，干燥后得到新疆圆柏总黄酮提取物。本实施例得到的新疆圆柏总黄酮提取物为棕黄色粉末，得率为6.3%；新疆圆柏总黄酮中黄酮含量测定方法按《中国药典》一部项下测定，槲皮苷的高效液相测定方法为：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈:0.036mol/L磷酸溶液(0～15min,21:79～25:75；15～20min,25:75～21:79)为流动相，检测波长为266nm。理论板数按槲皮苷峰计应不低于5000。本实施例得到的新疆圆柏总黄酮提取物中总黄酮的质量百分含量为65.13%，槲皮苷的质量百分含量为3.34%。
实施例10，该新疆圆柏总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，将新疆圆柏枝叶粉碎后干燥，干燥后得到混合药材，混合药材用石油醚脱脂，称取2.0kg石油醚脱脂后的药材，在石油醚脱脂后的药材中加入乙醇溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取时乙醇溶液的加入量为混合药材质量的6倍，每次提取时间为1h，每次回流提取时乙醇溶液为体积百分比为70%的乙醇水溶液，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05后，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏和硅胶按质量比为1:1进行混合拌样，拌样后在温度为90℃下进行干燥，干燥时间为6h，干燥后装入已装填好的硅胶填料层析柱，硅胶填料层析柱的径长比1:1.5，先用石油醚和乙酸乙酯按体积比为2:8混合得到的混合溶液进行二次脱脂，石油醚和乙酸乙酯的混合溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍，再用体积百分比为60%的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05后，得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏和去离子水按质量比为1:12稀释后得到稀释液；第四步，D101大孔树脂柱对稀释液进行吸附，稀释液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的1/20倍，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水的上柱量为大孔树脂柱柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比为70%的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇溶液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.30，然后在温度为50℃下干燥16h，干燥后得到新疆圆柏总黄酮提取物。本实施例得到的新疆圆柏总黄酮提取物为棕黄色粉末，得率为6.76%；新疆圆柏总黄酮中黄酮含量测定方法按《中国药典》一部项下测定，槲皮苷的高效液相测定方法为：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈:0.036mol/L磷酸溶液(0～15min,21:79～25:75；15～20min,25:75～21:79)为流动相，检测波长为266nm。理论板数按槲皮苷峰计应不低于5000。本实施例得到的新疆圆柏总黄酮提取物中总黄酮的质量百分含量为65.73%，槲皮苷的质量百分含量为3.31%。
实施例11，该新疆圆柏总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，将新疆圆柏枝叶粉碎后干燥，干燥后得到混合药材，混合药材用石油醚脱脂，称取1.0kg石油醚脱脂后的药材，在石油醚脱脂后的药材中加入乙醇溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取时乙醇溶液的加入量为混合药材质量的20倍，每次提取时间为1.5h，每次回流提取时乙醇溶液为体积百分比为50%的乙醇水溶液，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.10后，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏和硅胶按质量比为1:1.5进行混合拌样，拌样后在温度为95℃下进行干燥，干燥时间为10h，干燥后装入已装填好的硅胶填料层析柱，硅胶填料层析柱的径长比1:2，先用石油醚和乙酸乙酯按体积比为2:8混合得到的混合溶液进行二次脱脂，石油醚和乙酸乙酯的混合溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍，再用体积百分比为60%的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.15后，得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏和去离子水按质量比为1:8稀释后得到稀释液；第四步，AB-8大孔树脂柱对稀释液进行吸附，稀释液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的1/12倍，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水的上柱量为大孔树脂柱柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比为70%的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇溶液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.40，然后在温度为55℃下干燥13h，干燥后得到新疆圆柏总黄酮提取物。本实施例得到的新疆圆柏总黄酮提取物为棕黄色粉末，得率为7.17%；新疆圆柏总黄酮中黄酮含量测定方法按《中国药典》一部项下测定，槲皮苷的高效液相测定方法为：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈:0.036mol/L磷酸溶液(0～15min,21:79～25:75；15～20min,25:75～21:79)为流动相，检测波长为266nm。理论板数按槲皮苷峰计应不低于5000。本实施例得到的新疆圆柏总黄酮提取物中总黄酮的质量百分含量为69.12%，槲皮苷的质量百分含量为2.95%。
实施例12，该新疆圆柏总黄酮提取物在制备治疗关节炎疾病药物中的应用。
上述实施例得到的本发明新疆圆柏总黄酮提取物在制备治疗关节炎疾病药物中的应用体内药效学试验如下：
1.新疆圆柏总黄酮提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
取昆明小鼠50只，雌雄各半，体重18g至22g，随机分为5个实验组，分别是模型组、阿司匹林组（200mg/kg）、本发明新疆圆柏总黄酮提取物低剂量组(125mg/kg)、本发明新疆圆柏总黄酮提取物中剂量组(250mg/kg)、本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组(500mg/kg)，每组10只。除模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液外，阿司匹林组给予相应剂量的阿司匹林，本发明新疆圆柏总黄酮提取物低剂量组、本发明新疆圆柏总黄酮提取物中剂量组和本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组给予相应剂量的本发明新疆圆柏总黄酮提取物，连续灌胃5天。于末次给药后1h，将50μl二甲苯均匀涂抹于各组小鼠右耳廓前后两面致炎，以左耳作对照。1.5h后脱颈椎处死小鼠，用直径6mm打孔器分别在左右耳对称部位打下圆形耳片，精密称重，计算肿胀度和肿胀抑制率。每组小鼠耳廓肿胀度以每鼠左右耳重量之差的平均值来表示。
肿胀抑制率（%）=(模型组肿胀度均值－给药组肿胀度均值)/模型组肿胀度均值×100%
实验结果表明，与模型组比较，本发明新疆圆柏总黄酮提取物低剂量组、本发明新疆圆柏总黄酮提取物中剂量组和本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组均能显著抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀（P<0.05），并呈剂量依赖关系，其中本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组耳肿胀抑制率达可达52.02%，接近于阳性对照阿司匹林（200mg/kg）67.94%的抑制率。结果说明本发明新疆圆柏总黄酮提取物具有较好的抗炎作用，本发明新疆圆柏总黄酮提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(,n=10)见表1所示。
新疆圆柏总黄酮提取物对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
取昆明种小鼠50只，体重18g至22g，雌雄各半，随机分为5个实验组，分别是模型组、阿司匹林组（50mg/kg）、本发明新疆圆柏总黄酮提取物低剂量组(125mg/kg)、本发明新疆圆柏总黄酮提取物中剂量组(250mg/kg)、本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组(500mg/kg)，每组10只。除模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液外，阿司匹林组给予相应剂量的阿司匹林，本发明新疆圆柏总黄酮提取物低剂量组、本发明新疆圆柏总黄酮提取物中剂量组和本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组给予相应剂量的本发明新疆圆柏总黄酮提取物，末次给药后lh，尾静脉注射0.5％Evansblue溶液0.1mL/10g，随即腹腔注射0.6％醋酸0.1mL/10g，20min后脱颈椎处死，剪开腹腔，用5.0mL生理盐水清洗腹腔，用吸管吸出洗涤液，3000rpm离心15min，取上清液于590nm波长处测吸光度A值，判断毛细血管通透性。
抑制率(％)=(对照组平均吸光度一给药组平均吸光度)／对照组平均吸光度×100%。
实验结果表明，本发明新疆圆柏总黄酮提取物低剂量组、本发明新疆圆柏总黄酮提取物中剂量组和本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组对醋酸引起的腹腔毛细血管通透性有显著的抑制作用（P<0.05），且各组的抑制率有明显的剂量依赖性，其中本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组耳肿胀抑制率达可达53.49%，接近于阳性对照阿司匹林（200mg/kg）69.76%的抑制率；本发明新疆圆柏总黄酮提取物对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响（，n＝10）见表2所示。
新疆圆柏总黄酮提取物对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响
取昆明小鼠60只，雌雄各半，体重18g至22g，随机分为5个实验组，分别是模型组、阿司匹林组（200mg/kg）、本发明新疆圆柏总黄酮提取物低剂量组(125mg/kg)、本发明新疆圆柏总黄酮提取物中剂量组(250mg/kg)、本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组(500mg/kg)，每组12只。除模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液外，阿司匹林组给予相应剂量的阿司匹林，本发明新疆圆柏总黄酮提取物低剂量组、本发明新疆圆柏总黄酮提取物中剂量组和本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组给予相应剂量的本发明新疆圆柏总黄酮提取物，灌胃1h后，每鼠腹腔注射0.6%新鲜配制的冰醋酸液0.2mL,观察记录10min内各组出现扭体反应次数，并计算扭体次数减少百分率。
结果表明，与模型组比较，本发明新疆圆柏总黄酮提取物低剂量组、本发明新疆圆柏总黄酮提取物中剂量组和本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组均能显著抑制冰醋酸致小鼠扭体次数（P<0.05），其中本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组扭体反应抑制率可达50.77%。结果说明本发明新疆圆柏总黄酮提取物具有较好的镇痛作用，本发明新疆圆柏总黄酮提取物对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响(,n=12)见表3所示。
新疆圆柏总黄酮提取物对热板法小鼠痛阈值的影响
昆明种小鼠100只，体重18g至22g，雌雄各半，给药前以小鼠接触热板后，舔后足作为痛反应指标进行初筛，痛阈超过60s和少于6s的小鼠淘汰。选取反应潜伏期在10s至30s内的合格小鼠50只，根据药前痛阈和体质量随机分成5组，分别是模型组、阿司匹林组（200mg/kg）、本发明新疆圆柏总黄酮提取物低剂量组(125mg/kg)、本发明新疆圆柏总黄酮提取物中剂量组(250mg/kg)、本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组(500mg/kg)，每组10只。小鼠灌胃给药(模型对照组给予等体积生理盐水)，分别检测给药后0.5h、lh、1.5h、2h的痛阈，比较痛阈随时间的变化，热板温度为50±5℃。比较各组药后不同时间痛阈值组间差异，判断是否有镇痛作用。
实验结果表明，本发明新疆圆柏总黄酮提取物低剂量组、本发明新疆圆柏总黄酮提取物中剂量组和本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组均能显著提高小鼠热刺激后不同时间点体表的痛阈值，本发明新疆圆柏总黄酮提取物对小鼠热板法疼痛反应时间的影响（，n＝10）见表4所示。
结论：药效学研究表明，本发明新疆圆柏总黄酮提取物对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀醋酸诱导的毛细血管通透性、冰醋酸诱导的小鼠扭体反应和热板致小鼠疼痛反应均具有明显的抑制作用，其中本发明新疆圆柏总黄酮提取物高剂量组的抗炎镇痛作用几乎接近于阳性对照阿司匹林的疗效；说明本发明新疆圆柏总黄酮提取物具有较好的抗炎镇痛作用，可用于关节炎疾病的治疗。
本发明较传统方法具有以下优点：（1）避免了酸和铅盐的使用，本发明新疆圆柏总黄酮提取物具有成分稳定、不易水解、无重金属残留；（2）利用硅胶除去油溶性杂质后，可有效降低大孔树脂的污染，大孔树脂再生容易、重复利用度高；（3）可在密闭环境下实现对新疆圆柏中的黄酮类成分富集纯化，且总黄酮含量高、工艺方法操作简单、成本低、无污染；同时本发明新疆圆柏总黄酮提取物具有较好的抗炎镇痛作用，可用于关节炎疾病的治疗。
综上所述，本发明较传统方法具有以下优点：（1）避免了酸和铅盐的使用，本发明新疆圆柏总黄酮提取物具有成分稳定、不易水解、无重金属残留；（2）利用硅胶除去油溶性杂质后，可有效降低大孔树脂的污染，大孔树脂再生容易、重复利用度高；（3）可在密闭环境下实现对新疆圆柏中的黄酮类成分富集纯化，且总黄酮含量高、工艺方法操作简单、成本低、无污染；同时本发明新疆圆柏总黄酮提取物具有较好的抗炎镇痛作用，可用于关节炎疾病的治疗。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
Claims (10)
1.一种新疆圆柏总黄酮提取物，其特征在于按下述方法得到：第一步，将新疆圆柏枝叶粉碎后干燥，干燥后得到混合药材，混合药材用石油醚脱脂，在石油醚脱脂后的药材中加入乙醇溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏和硅胶混合拌样后干燥，干燥后装入已装填好的硅胶填料层析柱，先用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行二次脱脂，再用乙醇溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后，得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加去离子水稀释后得到稀释液；第四步，大孔树脂柱对稀释液进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到新疆圆柏总黄酮提取物。
2.根据权利要求1所述的新疆圆柏总黄酮提取物，其特征在于第一步中，每次回流提取时乙醇溶液的加入量为混合药材质量的6倍至20倍；或/和，每次提取时间为1h至2h，每次回流提取时乙醇溶液为体积百分比为50%至70%的乙醇水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的新疆圆柏总黄酮提取物，其特征在于第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05至1.20后，得到一次浸膏。
4.根据权利要求1或2或3所述的新疆圆柏总黄酮提取物，其特征在于第二步中，一次浸膏和硅胶按质量比为1:1至1:2进行混合拌样，拌样后在温度为90℃至95℃下进行干燥，干燥时间为6h至12h；或/和，硅胶填料层析柱的径长比1:1.5至1:2。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的新疆圆柏总黄酮提取物，其特征在于第二步中，石油醚和乙酸乙酯的混合溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍至7倍，混合溶液为石油醚和乙酸乙酯按体积比为2:8混合得到的混合溶液；或/和，在第二步中，乙醇溶液为体积百分比为60%至95%的乙醇水溶液，乙醇溶液的上柱量为硅胶填料层析柱柱体积的5倍至8倍；或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.05至1.20后，得到二次浸膏。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的新疆圆柏总黄酮提取物，其特征在于第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:5至1:12稀释后得到稀释液。
7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的新疆圆柏总黄酮提取物，其特征在于第四步中，稀释液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的1/20倍至1/8倍，去离子水的上柱量为大孔树脂柱柱体积的8倍至12倍，乙醇溶液为体积百分比为60%至80%的乙醇水溶液，乙醇溶液的上柱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍；或/和，在第四步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25℃下的相对密度为1.30至1.50，干燥时间为12h至16h，干燥温度为50℃至60℃。
8.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的新疆圆柏总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂。
9.一种根据权利要求2或3或4或5或6或7或8所述的新疆圆柏总黄酮提取物的制备方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，将新疆圆柏枝叶粉碎后干燥，干燥后得到混合药材，混合药材用石油醚脱脂，在石油醚脱脂后的药材中加入乙醇溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏和硅胶混合拌样后干燥，干燥后装入已装填好的硅胶填料层析柱，先用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行二次脱脂，再用乙醇溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后，得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加去离子水稀释后得到稀释液；第四步，大孔树脂柱对稀释液进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到新疆圆柏总黄酮提取物。
10.一种根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的新疆圆柏总黄酮提取物在制备治疗关节炎疾病药物中的应用。
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