CN106420919A - 一种大苞荆芥总黄酮提取物的制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大苞荆芥总黄酮提取物的制备方法和用途，它将维吾尔药大苞荆芥全草经含水乙醇提取，再经大孔树脂富集得到的大苞荆芥总黄酮，其大苞荆芥总黄酮提取物中总黄酮含量不低于68%。本发明提供的大苞荆芥总黄酮具有抗炎、止咳、祛痰、平喘作用，以大苞荆芥总黄酮为原料，添加不同药物赋形剂制备的制剂可作为治疗感冒、肺炎、支气管炎、哮喘的药物。本制备方法安全简便，可重复性好，无环境污染，适用于规模化生产。

Description

一种大苞荆芥总黄酮提取物的制备方法和用途
技术领域
本发明涉及中药材的提取，该方法尤其适用于大苞荆芥总黄酮提取及制备。
背景技术
大苞荆芥是唇形科(Labiatae)植物荆芥属大苞荆芥(Nepeta bracteata Benth)的干燥全草，是维吾尔医常用药材，维吾尔名为“祖发 印地”，被收载于维吾尔医古典医籍《阿力卡农》，已有800多年的历史，《依合提亚拉提 拜地依》已有650多年的历史、《买克散艾地维》已有500多年的历史，维吾尔医古典医籍中记载，大苞荆芥生干生热，温肺平喘，祛寒止咳，燥湿祛痰，发汗解毒，消炎退肿，主治湿寒性和粘液质性呼吸器官疾病。它在维吾尔医和民间用于寒性哮喘，咳嗽感冒，湿性痰多，乃孜来毒液流窜胸肺，胸膜炎，气管炎，肺炎及水肿。在《维吾尔药志》（上册）（乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999年）中记载，大苞荆芥全草含挥发油、黄酮类、多糖类、三萜类、有机酸类等化学成分，具有镇咳平喘、清热利湿之功效，用于气管炎、咳嗽气喘、感冒发烧等症 。目前，国内外对荆芥属植物相关研究报道主要集中在荆芥、藏荆芥等，其中荆芥Schizonepetae Herba为唇形科(Labiatae)植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq. 的干燥地上部分，为传统的发散解表药，具有解表散风，透疹消疮等功效，用于感冒、头痛、麻疹、风疹、疮疡初起等，药理研究表明，荆芥及其提取物在中枢神经系统、消化系统、血液系统等方面有很好的生物活性，如：止血、镇痛、抗炎、抑制平滑肌运动等；公开号为CN104352562 A的中国发明专利文献公开了一种荆芥总黄酮的制备方法及其在抗肿瘤中的作用，通过药效学验证了其对Caco-2肿瘤细胞具有明显的抑制作用。藏荆芥(Nepeta angustifolia C.Y. Wu)为唇形科荆芥属植物藏荆芥的地上部分，具有“开窍醒神”等药理作用，主治神昏痉厥、中风、癫痫、脑溢血、脑膜炎、时疫、疼痛及疮伤等病症；文献报道，藏荆芥二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、正丁醇、石油醚提取部分都具有明显清除DPPH自由基的作用，二氯甲烷和乙酸乙酯提取部分的活性较强；另外，通过超临界C02法萃取藏荆芥总黄酮，最佳工艺条件为萃取温度40"C，萃取压力26MPa，萃取时间1h时，藏荆芥总黄酮平均含量达到12.24 mg/g。但是，国内外对大苞荆芥的研究报道甚少，据文献研究报道，大苞荆芥中总多糖可抑制炎性细胞因子IL-4、IL-6、IL-17 的释放。大苞荆芥醇提物和不同溶剂提取物对DPPH自由基均有一定的清除能力，其中大苞荆芥乙酸乙酯与正丁醇提取物清除自由基的活性较强。至今，尚未发现有关大苞荆芥总黄酮的制备方法、药理活性及其药物用途方面的文献。
本发明采用乙醇提取、大孔吸附树脂富集纯化方法，制备的大苞荆芥总黄酮含量不低于68%，制备的大苞荆芥总黄酮具有抗炎、止咳、祛痰、平喘作用，该制备方法安全简便，可重复性好，无环境污染，适用于规模化生产，具有良好的市场销售前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大苞荆芥总黄酮提取物的制备方法和用途，因其具有抗炎、祛痰、止咳和平喘作用，可作为制备治疗感冒、肺炎、支气管炎、哮喘的药物原始材料。
本发明目的是这样实现的：一种大苞荆芥总黄酮提取物及其制备方法和用途，分步骤实施：
步骤1取干燥、粉碎的大苞荆芥，置于10L圆底烧瓶中，采用体积百分比浓度为50-95 %乙醇/水进行提取，乙醇/水是大苞荆芥的5-15倍重量，水浴加热至40-80℃，回流提取1-5次，时间为1-3h，提取后的滤液经减压浓缩至0.25-1.0 g 生药/mL,其压力为-0.08MPa，温度30-50℃，得大苞荆芥提取液备用；
步骤2将大苞荆芥提取液，加1-3倍量水稀释、静置12-24 h，在-0.08MPa真空抽虑压力下抽滤，除去不溶性物质，滤液经浓缩至0.25-1.0 g生药/mL时备用；
步骤3将大苞荆芥提取液与大孔吸附树脂以1:1-1:5重量比实施吸附，树脂柱径高比为1:1-1:6，上样液黄酮浓度为1.0-5.0 mg/mL，上样流速为2-6 BV/h；吸附后先用水洗脱大孔吸附树脂2-8 BV，洗脱流速2-6 BV/h；在将水洗脱液弃去后，用体积百分比浓度为30-95 %乙醇/水洗脱2-10 BV，流速为2-6 BV/h；收集乙醇洗脱液，经RE52-AA旋转蒸发仪浓缩，其压力-0.08MPa，温度30-35°C，再经DZF-6050B 真空干燥箱干燥，经DFY-500摇式高速万能粉粹机粉碎至粉末，即得大苞荆芥总黄酮；
其中使用的大孔吸附树脂为AB-8或D-101或HPD-400或HPD-600树脂。
所述方法，提取的大苞荆芥总黄酮含量达到68-80%，具有抗炎、止咳、祛痰、平喘作用。
本发明选用大苞荆芥为唇形科植物荆芥属大苞荆芥（Nepeta bracteata Benth ）的干燥全草，经粉碎，采用浓度为50～80 %乙醇/水进行提取，采用50～80 %乙醇/水洗脱2～10 BV，采用非极性或弱极性大孔树脂，获取大苞荆芥总黄酮含量不低于67%，所述的大苞荆芥总黄酮可作为制备治疗感冒、肺炎、支气管炎、哮喘的药物的原始材料，提取方法安全简便，可重复性好，无环境污染，适用于规模化生产，彰显技术进步。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步说明。
实施例1
选用的大苞荆芥药材为干燥全草，经粉碎过20目筛后使用；将过筛的大苞荆芥置于10L圆底烧瓶中，采用体积百分比浓度为60 %乙醇/水进行提取，乙醇/水是大苞荆芥药材的6倍重量，水浴加热至70℃，回流提取1次，提取时间为2h，提取液过滤，滤液减压浓缩至1.0 g生药/mL，得到大苞荆芥提取液；将大苞荆芥提取液，加1倍量水稀释、静置12 h，抽滤除去不溶性物质，滤液浓缩至1.0 g生药/mL；将大苞荆芥提取液，经HPD-400大孔吸附树脂进行吸附，大苞荆芥与大孔吸附树脂重量比为1:1，上样液黄酮浓度为1.28 mg/mL，上样流速为3 BV/h，树脂柱径高比为1:4；吸附后先用水洗脱大孔吸附树脂4 BV，洗脱流速4 BV/h，水洗脱液弃去；然后用体积百分比浓度为60 %乙醇/水洗脱6 BV，流速为3 BV/h，收集乙醇洗脱液，经RE52-AA旋转蒸发仪浓缩，其压力-0.08MPa，温度35°C，再经DZF-6050B 真空干燥箱干燥，经DFY-500摇式高速万能粉粹机粉碎至粉末，即得大苞荆芥总黄酮其总黄酮含量为68.6%。
实施例2
选用的大苞荆芥药材为干燥全草，经粉碎过20目筛后使用；将过筛的大苞荆芥置于10L圆底烧瓶中，采用体积百分比浓度为70 %乙醇/水进行提取，乙醇/水是大苞荆芥药材的8倍重量，水浴加热至80℃，回流提取3次，提取时间为1小时，提取液过滤，滤液减压浓缩至0.25 g生药/mL，得到大苞荆芥提取液。将大苞荆芥提取液，加3倍量水稀释、静置18 h，抽滤除去不溶性物质，滤液浓缩至0.25 g生药/mL；将大苞荆芥提取液，经AB-8大孔吸附树脂进行吸附，大苞荆芥与大孔吸附树脂重量比为1:4，上样液黄酮浓度为2.56 mg/mL，上样流速为4 BV/h，树脂柱径高比为1:5；吸附后先用水洗脱大孔吸附树脂5 BV，洗脱流速5 BV/h，水洗脱液弃去；然后用体积百分比浓度为70 %乙醇/水洗脱8 BV，流速为4 BV/h，收集乙醇洗脱液，经RE52-AA旋转蒸发仪浓缩，其压力-0.08MPa，温度32°C，再经DZF-6050B 真空干燥箱干燥，，经DFY-500摇式高速万能粉粹机粉碎至粉末，即得大苞荆芥总黄酮其总黄酮含量为69.7%。
实施例3
选用的大苞荆芥药材为干燥全草，经粉碎过20目筛后使用；将过筛的大苞荆芥置于10L圆底烧瓶中，采用体积百分比浓度为75 %乙醇/水进行提取，乙醇/水是大苞荆芥药材的10倍重量，水浴加热至60℃，回流提取2次，提取时间为3小时，提取液过滤，滤液减压浓缩至0.5 g生药/mL，得到大苞荆芥提取液。将大苞荆芥提取液，加2倍量水稀释、静置24 h，抽滤除去不溶性物质，滤液浓缩至0.5 g生药/mL；将大苞荆芥提取液，经HPD-600大孔吸附树脂进行吸附，大苞荆芥与大孔吸附树脂重量比为1:6，上样液黄酮浓度为3.84 mg/mL，上样流速为5 BV/h，树脂柱径高比为1:6；吸附后先用水洗脱大孔吸附树脂6 BV，洗脱流速6 BV/h，水洗脱液弃去；然后用体积百分比浓度为75 %乙醇/水洗脱9 BV，流速为5 BV/h，收集乙醇洗脱液，经RE52-AA旋转蒸发仪浓缩，其压力-0.08MPa，温度30°C，再经DZF-6050B 真空干燥箱干燥，，经DFY-500摇式高速万能粉粹机粉碎至粉末，即得大苞荆芥总黄酮，所得的大苞荆芥总黄酮含量为67.2%。
本方法选用的AB-8、D-101大孔吸附树脂由南开大学化工厂生产；HDP-400、HDP-600由沧州宝恩化工有限公司提供；DTC-221真空抽虑装置由日本VLVAC公司提供；RE52-AA旋转蒸发仪由上海本波仪器有限公司提供； DZF-6050B 真空干燥箱由上海齐欣科学仪器有限公司提供； DFY-500摇式高速万能粉粹机由温岭市林大机械有限公司提供。
本发明方法获取大苞荆芥总黄酮的药效学实验验证，具有良好的抗炎、止咳、祛痰、平喘作用。
1）大苞荆芥总黄酮对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（抗炎作用）
取昆明种小鼠50只，体重（20士2）g，雌雄各半，随机分成5组：空白对照组（0.9 %生理盐水），阳性对照组（急支糖浆，5.0 g/kg）、大苞荆芥总黄酮高剂量组（0.8 g/kg）、大苞荆芥总黄酮中剂量组（0.4 g/kg）、大苞荆芥总黄酮低剂量组（0.2 g/kg）；灌胃给药1次/日，连续7d，灌胃体积均为 0.2 mL/10 g，末次给药后30 min，各组小鼠均在小鼠右耳前、后面均匀涂二甲苯20 μL致炎，1 h后颈椎脱臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，用直径9 mm打孔器分别在两耳的同一部位打下圆耳片，精密称重，以左右耳重量差为肿胀度，以此判断大苞荆芥总黄酮对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响；
耳肿胀度（mg）= 右耳片重—左耳片重；
肿胀抑制率（%）= 【（空白对照组平均肿胀度—给药组平均肿胀度）/空白对照组平均肿胀度】×100%；
实验结果，致炎后各组小鼠右耳立刻出现高度红肿现象，阳性对照组和三个不同剂量的大苞荆芥总黄酮给药组对二甲苯所致的小鼠耳肿胀均有明显抑制作用（P<0.05），三个不同剂量的大苞荆芥总黄酮给药组肿胀抑制率呈明显的剂量依赖关系，抑制作用随剂量的增加而增加（P<0.05），见表1。
注：与空白对照组比较，* P＜0.05；大苞荆芥总黄酮各剂量组之间比较，△ P＜0.05。
结果验证，在以血管通透性增加为主要改变的急性炎症模型实验中，大苞荆芥总黄酮能显著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀炎症反应，说明大苞荆芥总黄酮具有抗炎作用。
2）大苞荆芥总黄酮对浓氨水致小鼠咳嗽反应的影响（止咳作用）
取昆明种小鼠50只，体重（20士2）g，雌雄各半，随机分成5组：空白对照组（0.9 %生理盐水），阳性对照组（急支糖浆，5.0 g/kg）、大苞荆芥总黄酮高剂量组（0.8 g/kg）、大苞荆芥总黄酮中剂量组（0.4 g/kg）、大苞荆芥总黄酮低剂量组（0.2 g/kg）；灌胃给药1次/日，连续7d，灌胃体积均为 0.2 mL/10 g，末次给药后l h，将小鼠逐一放入4L密闭干燥容器内，恒压喷入25%浓氨水气雾，喷雾5 s引咳，观察其咳嗽潜伏期及2 min内咳嗽次数；
实验结果，阳性对照组和三个不同剂量的大苞荆芥总黄酮给药组对浓氨水致小鼠咳嗽反应有明显的抑制作用，能延长小鼠咳嗽反应的潜伏期（P<0.05），并减少咳嗽次数（P<0.05），三个不同剂量的大苞荆芥总黄酮给药组止咳作用呈明显的剂量依赖关系（P<0.05），见表2。
注：与空白对照组比较，* P＜0.05；大苞荆芥总黄酮各剂量组之间比较，△ P＜0.05。
结果验证，大苞荆芥总黄酮能显著抑制浓氨水喷雾引起的小鼠咳嗽反应及延长咳嗽潜伏期，提示大苞荆芥总黄酮作用于有关化学感受器, 抑制支气管粘膜对刺激的反应性而表现出镇咳作用。
3）大苞荆芥总黄酮对小鼠气管段酚红排泌量的影响（祛痰作用）
取昆明种小鼠50只，体重（20士2）g，雌雄各半，随机分成5组：空白对照组（0.9 %生理盐水），阳性对照组（急支糖浆，5.0 g/kg）、大苞荆芥总黄酮高剂量组（0.8 g/kg）、大苞荆芥总黄酮中剂量组（0.4 g/kg）、大苞荆芥总黄酮低剂量组（0.2 g/kg）；灌胃给药1次/日，连续7d，灌胃体积均为 0.2 mL/10 g，最后一次给药后30 min，每只小鼠腹腔注射5%酚红生理盐水溶液0.2 mL/20g体重，30 min后处死小鼠，仰位固定，颈部拉直，解剖分离出气管，将各气管段放入预先盛有1.5mL 5% NaHCO3溶液的试管中，超声波清洗，使气管段中的酚红完全释放，清洗液离心，取上清液于分光光度计546 nm处比色，测定OD值，与酚红标准曲线比较，折算成酚红含量，根据酚红含量和动物体重计算出校正酚红含量；
实验结果，阳性对照组和三个不同剂量的大苞荆芥总黄酮给药组能明显提高小鼠呼吸道酚红排泌量（P<0.05），三个不同剂量的大苞荆芥总黄酮给药组祛痰作用呈明显的剂量依赖关系（P<0.05），见表3。
注：与空白对照组比较，* P＜0.05；大苞荆芥总黄酮各剂量组之间比较，△ P＜0.05。
结果验证，大苞荆芥总黄酮能显著促进小鼠气管段酚红排泄量，提示大苞荆芥总黄酮具有明显的祛痰作用。
4）大苞荆芥总黄酮对豚鼠乙酰胆碱组胺引喘的影响（平喘作用）
取60只豚鼠，体重150-200g，雌雄兼用，先将豚鼠逐一放在密闭的玻璃钟罩内，待安静后，启动超生雾化器，以恒压喷雾2％氯化乙酰胆碱与0.1%组胺1:1混合液15 sec引喘，喷雾停止后，立即观察6 min内豚鼠出现喘息性抽搐的潜伏期（从喷雾开始到哮喘发作，呼吸极度困难，直至抽搐跌倒的时间），选择潜伏期小于150 sec 的豚鼠用于正式实验, 并以此潜伏期作为给药前潜伏期；挑选合格动物，按体重、性别随机分为5组：空白对照组（0.9 %生理盐水），阳性对照组（氨茶碱，0.15g/kg）、大苞荆芥总黄酮高剂量组（0.5 g/kg）、大苞荆芥总黄酮中剂量组（0.25 g/kg）、大苞荆芥总黄酮低剂量组（0.125 g/kg）；灌胃给药1次/日，连续7 d，灌胃体积均为 0.2 mL/10 g，末次给药1h后，以同样条件引喘，观察引喘潜伏期，大于360 s不跌倒者按360 s计算，对各实验组豚鼠的引喘潜伏期进行比较；
实验结果，阳性对照组和三个不同剂量的大苞荆芥总黄酮给药组能明显延长豚鼠引喘潜伏期（P<0.05）；三个不同剂量的大苞荆芥总黄酮给药组引喘潜伏期呈明显的剂量依赖关系（P<0.05），见表4。
注：与空白对照组比较，* P<0.05；与给药前比较，△ P<0.05；大苞荆芥总黄酮各剂量组之间比较，▲ P＜0.05。
结果验证，大苞荆芥总黄酮能显著延长乙酰胆碱组胺引起的哮喘潜伏期，提示大苞荆芥总黄酮具有明显的平喘作用。

Claims (3)

1.一种大苞荆芥总黄酮提取物的制备方法，其特征在于：分步骤实施：
步骤1取干燥、粉碎的大苞荆芥，置于10L圆底烧瓶中，采用体积百分比浓度为50-95 %乙醇/水进行提取，乙醇/水是大苞荆芥的5-15倍重量，水浴加热至40-80℃，回流提取1-5次，时间为1-3h，提取后的滤液经减压浓缩至0.25-1.0 g 生药/mL,其压力为-0.08MPa，温度30-50℃，得大苞荆芥提取液备用；
步骤2将大苞荆芥提取液，加1-3倍量水稀释、静置12-24 h，在-0.08MPa真空抽虑压力下抽滤，除去不溶性物质，滤液经浓缩至0.25-1.0 g生药/mL时备用；
步骤3将大苞荆芥提取液与大孔吸附树脂以1:1-1:5重量比实施吸附，树脂柱径高比为1:1-1:6，上样液黄酮浓度为1.0-5.0 mg/mL，上样流速为2-6 BV/h；吸附后先用水洗脱大孔吸附树脂2-8 BV，洗脱流速2-6 BV/h；在将水洗脱液弃去后，用体积百分比浓度为30-95 %乙醇/水洗脱2-10 BV，流速为2-6 BV/h；收集乙醇洗脱液，经RE52-AA旋转蒸发仪浓缩，其压力-0.08MPa，温度30-35°C，再经DZF-6050B 真空干燥箱干燥，经DFY-500摇式高速万能粉粹机粉碎至粉末，即得大苞荆芥总黄酮；
其中选用的大苞荆芥为唇形科植物硬尖大苞荆芥或同属植物欧大苞荆芥的干燥全草，经粉碎过20目筛后使用；
其中使用的大孔吸附树脂为AB-8或D-101或HPD-400或HPD-600树脂。
2.根据权利要求1所述的一种大苞荆芥总黄酮的制备方法，其特征在于所述的大苞荆芥总黄酮含量不低于68%。
3.一种大苞荆芥总黄酮的用途，其特征在于所述的大苞荆芥总黄酮用于制备治疗感冒、肺炎、支气管炎、哮喘的药物。
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