CN113831245B - 大苞荆芥提取物中的二萜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及大苞荆芥分离纯化技术领域，是一种大苞荆芥提取物中的二萜及其制备方法和应用。本发明首次公开了化合物1,2,3,4,4a,9,10,10a‑octahydro‑4a‑(hydroxymethyl)‑7‑isopropyl‑1,1‑dimethylphenanthren‑4‑yl acetate(nepetabrate A)，并将该化合物进行了体外抗炎及抗菌药效学实验，实验明显可以看出该化合物对RAW 264.7细胞和金黄色葡萄球菌及大肠杆菌具有较强的抑制作用，从而使该化合物能够作为制备预防炎症及抑菌药物或/和制备抗炎、抗菌药物或/和制备防治炎症及抑菌保健品的应用。
Description
技术领域
本发明涉及大苞荆芥分离纯化技术领域，是一种大苞荆芥提取物中的二萜及其制备方法和应用，大苞荆芥提取物中的二萜为所述1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrateA)的简称。
背景技术
大苞荆芥Nepeta bracteata Benth为唇形科Labiatae荆芥属Nepeta植物，主要分布于巴基斯坦，尼泊尔，伊朗等国家，维吾尔名为“祖发”，习称神香草，临床用药广泛，主要以进口为主。其全草入药，气微清香，味淡、性微湿，入肺、肝经，具有镇咳平喘、清热利湿的作用，临床上用于治疗气管炎症，咳嗽气喘、感冒发烧、小便不利等症状。此外，大苞荆芥还具有来源容易、成本低廉、临床疗效可靠、毒副作用小等特点。迄今为止，对大苞荆芥进行探究的重点以及基础理论研究还不多见，现代药理学表明，其提取物具有显著的抗炎、抑菌活性，但尚未对化学成分进行相关研究，大苞荆芥可能是一味治疗呼吸系统疾病很好的物种，因此，近年来备受人们的关注。
大苞荆芥的药效主要来源于其中的萜类化合物，包括单萜类和二萜类化合物，其中优势成分二萜类成分抗炎、抑菌活性较好，因此，开发和利用大苞荆芥的二萜类单体化合物，进一步挖掘其潜在的药用价值，并对其单体化合物的结构和理化性质进行确定和表征，对于开发利用大苞荆芥具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)及其制备方法和应用，克服了上述现有技术之不足，其首次公开了1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrateA)及其作为制备预防炎症及抑菌药物或/和制备抗炎、抗菌药物或/和制备防治炎症及抑菌保健品的应用。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)，化学结构式为
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述按照下述方法制备得到：第一步，将大苞荆芥粉碎并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位和二氯甲烷部位；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50：1、25:1、8:1、5:1、1:1、1:0；第四步，将得到的8个馏分中第6个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到5个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、10:1、3：1、1:1、0:1；第五步，再将得到的5个馏分中第3个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3：1；第六步，再将得到的3个馏分中第3个馏分再经高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，并收集洗脱物，在第42.4分钟处得到1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)。
上述第一步中，每1g大苞荆芥加入8ml至10ml乙醇。
上述第六步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为90：10。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，将大苞荆芥粉碎并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位和二氯甲烷部位；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50：1、25:1、8:1、5:1、1:1、1:0；第四步，将得到的8个馏分中第6个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到5个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、10:1、3：1、1:1、0:1；第五步，再将得到的5个馏分中第3个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3：1；第六步，再将得到的3个馏分中第3个馏分再经高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，并收集洗脱物，在第42.4分钟处得到1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-ylacetate(nepetabrate A)。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述第一步中，每1g大苞荆芥加入8ml至10ml乙醇。
上述第六步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为90：10。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)作为制备预防炎症及抑菌药物的应用。
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)作为制备抗炎及抗菌药物的应用。
本发明的技术方案之五是通过以下措施来实现的：一种1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)作为制备防治炎症及抑菌保健品的应用。
本发明首次公开了化合物1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrateA)，并将该化合物进行了体外抗炎及抗菌药效学实验，实验明显可以看出该化合物对RAW264.7细胞和金黄色葡萄球菌及大肠杆菌具有较强的抑制作用，从而使该化合物能够作为制备预防炎症及抑菌药物或/和制备抗炎、抗菌药物或/和制备防治炎症及抑菌保健品的应用。
附图说明
附图1为本发明所述1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)的化学结构图。
附图2为本发明所述1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)的1H-NMR谱图。
附图3为本发明所述1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)的13C-APT谱图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：该1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)，其特征在于化学结构式为
将本发明实施例1所述的1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrateA)进行核磁共振氢谱(1H-NMR)和核磁共振碳谱(13C-APT)分析。
本实施例所述的1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)的1H-NMR谱图如图2所示。
本实施例所述的该1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)的13C-APT谱图如图3所示。
对图2和图3进行图谱解析，并将图2和图3各峰进行归属，得出化合物1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)结构中碳和氢的化学位移和峰的类型，其化学结构式如图1所示。其中，图2和图3的各峰归属如表1所示。
实施例2：该1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)，按照下述方法制备得到：第一步，将大苞荆芥粉碎并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位和二氯甲烷部位；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50：1、25:1、8:1、5:1、1:1、1:0；第四步，将得到的8个馏分中第6个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到5个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、10:1、3：1、1:1、0:1；第五步，再将得到的5个馏分中第3个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3：1；第六步，再将得到的3个馏分中第3个馏分再经高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，并收集洗脱物，在第42.4分钟处得到1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)。
实施例3：作为上述实施例的优化，该1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrateA)，按照下述方法制备得到：第一步，将大苞荆芥粉碎并加入乙醇，在室温下浸泡3小时或4小时后，在50℃或60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时或3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位和二氯甲烷部位；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50：1、25:1、8:1、5:1、1:1、1:0；第四步，将得到的8个馏分中第6个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到5个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、10:1、3：1、1:1、0:1；第五步，再将得到的5个馏分中第3个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3：1；第六步，再将得到的3个馏分中第3个馏分再经高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，并收集洗脱物，在第42.4分钟处得到1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrateA)。
实施例4：作为上述实施例的优化，第一步中，每1g大苞荆芥加入8ml至10ml乙醇。
实施例5：作为上述实施例的优化，第六步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为90：10。
实施例6：该1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)作为制备预防炎症及抑菌药物的应用。
实施例7：该1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)作为制备抗炎及抗菌药物的应用。
实施例8：该1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)作为制备防治炎症及抑菌保健品的应用。
实施例9：该1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)按照下述方法得到：第一步，将大苞荆芥粉碎并加入乙醇，在室温下浸泡3小时后，在50℃条件下加热回流提取3次，每次2小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位和二氯甲烷部位；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50：1、25:1、8:1、5:1、1:1、1:0；第四步，将得到的8个馏分中第6个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到5个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、10:1、3：1、1:1、0:1；第五步，再将得到的5个馏分中第3个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3：1；第六步，再将得到的3个馏分中第3个馏分再经高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，并收集洗脱物，在第42.4分钟处得到1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)。
将本发明实施例9得到的1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrateA)进行体外抗炎及抗菌药效学实验，体外抗炎及抗菌药效学实验利用MTT比色法。
以1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)为实验组，以Aspinin(阿司匹林，抗炎药物)为对照组，同时设立空白组，实验组、对照组和空白组选取RAW 264.7细胞为实验对象，培养基稀释后，以6×104/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，培养箱中正常培养24小时后，各组加入相对应的药物，使各组药物的最终浓度分别为2.5μg/ml(1组)，5μg/ml(2组)，10μg/ml(3组)，20μg/ml(4组)，40μg/ml(5组)，共设5个浓度，每个浓度3个复孔；培养48小时后，于每孔加MTT 10μl染色；继续培养四小时后，吸弃原培养液，每孔加入DMSO 150μl，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，并于酶联免疫检测仪570nm波长处检测光密度值，根据光密度值计算50％抑制浓度(IC50，μM)，光密度值计算IC50的计算方法为现有公知技术。实验组、对照组对RAW 264.7细胞的IC50如表2所示。表2数据可以看出，本发明所述的1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)对RAW 264.7细胞均具有一定的抑制作用。
以1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)为实验组，以Penicillin(阿莫西林，抗菌药物)为对照组，同时设立空白组，实验组、对照组和空白组选取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为实验对象，将样品以无菌水或DMSO稀释一定倍数后，离心取100μL加入指示菌平板的孔内，做为抑菌实验孔，取新鲜培养的指示菌株，将菌悬液浓度调至0.5McF arland并均匀涂布在上述平板上，放置相应温度下培养24h或48h，观察各平皿的菌落生长情况。向孔中加入100μL新鲜培养基做为阴性对照孔，阿莫西林溶液做为阳性对照。培养基稀释后，以6×104/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，培养箱中正常培养24小时后，各组加入相对应的药物，使各组药物的最终浓度分别为2.5μg/ml(1组)，5μg/ml(2组)，10μg/ml(3组)，20μg/ml(4组)，40μg/ml(5组)，共设5个浓度，每个浓度3个复孔；培养48小时后，于每孔加MTT 10μl染色；继续培养四小时后，吸弃原培养液，每孔加入DMSO 150μl，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，并于酶联免疫检测仪570nm波长处检测光密度值，根据光密度值计算50％抑制浓度(IC50，μM)，光密度值计算IC50的计算方法为现有公知技术。实验组、对照组对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的IC50如表3所示。表3数据可以看出，本发明所述的1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrate A)对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有一定的抑制作用。
综上所述，本发明首次公开了化合物1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-4a-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-1,1-dimethylphenanthren-4-yl acetate(nepetabrateA)，并将该化合物进行了体外抗炎及抗菌药效学实验，实验明显可以看出该化合物对RAW264.7细胞和金黄色葡萄球菌及大肠杆菌具有较强的抑制作用，从而使该化合物能够作为制备预防炎症及抑菌药物或/和制备抗炎、抗菌药物或/和制备防治炎症及抑菌保健品的应用。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
表1
表2
表3
Claims (6)
1.一种化合物，其特征在于化学结构式为
。
2.一种根据权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：第一步，将大苞荆芥粉碎并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位和二氯甲烷部位；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50：1、25:1、8:1、5:1、1:1、1:0；第四步，将得到的8个馏分中第6个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到5个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、10:1、3：1、1:1、0:1；第五步，再将得到的5个馏分中第3个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3：1；第六步，再将得到的3个馏分中第3个馏分再经高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，并收集洗脱物，在第42.4分钟处得到目标产物。
3.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于第一步中，每1 g大苞荆芥加入8 ml至10 ml乙醇。
4.根据权利要求2或3所述的化合物的制备方法，其特征在于第六步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为90：10。
5.一种根据权利要求1所述的化合物用于制备预防炎症及抑菌药物的用途。
6.一种根据权利要求1所述的化合物用于制备抗炎及抗菌药物的用途。
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