CN115010589B - 神香草提取物中大苞松香烷二萜类成分及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及大苞荆芥地上部分分离纯化技术领域，是一种NepetabrateE及其制备方法和应用，前者是将大苞荆芥地上部分经乙醇回流提取后，得大苞荆芥总浸膏，经有机溶剂萃取后得到各部位浸膏，取正丁醇部位浸膏用乙醇‑水梯度洗脱，再经ODS反相色谱以甲醇‑水梯度洗脱，取第3个馏分再经高效液相色谱洗脱后纯化分离后得到。本发明首次公开了NepetabrateE，本发明所述的NepetabrateE对脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞具有较强的抗炎作用，从而使得NepetabrateE能够作为制备预防炎症药物和抗炎药物以及防治炎症保健品的应用。
Description
技术领域
本发明涉及大苞荆芥地上部分分离纯化技术领域，是一种神香草提取物中大苞松香烷二萜类成分及其制备方法和应用，其中，神香草提取物中大苞松香烷二萜类成分为所述Nepetabrate E的简称。
背景技术
大苞荆芥Nepeta bracteata Benth.为唇形科(Labiatae)荆芥属Nepeta植物，习称神香草，维吾尔名也为“祖发”，以干燥的全草为入药，气微清香，味淡、性微湿，入肺、肝经。主要分布于巴基斯坦、伊朗、尼泊尔等国家。具有生热、温肺平喘、驱寒止咳、燥湿化痰、排汗解毒、消炎消肿等多种药理作用，主要治疗湿冷、粘液性呼吸道疾病。虽然现代药理学研究表明其提取物具有显著的抗炎活性，但对其化学成分进行表征的相关研究较少。其所含松香烷二萜类成分在抗炎方面具有较好的抗炎活性,且不良反应小、价格便宜、来源广泛,从而得到广大中外科研工作者的重视。
大苞荆芥的药效主要来源于其中的萜类化合物，包括单萜类和二萜类化合物，其中优势成分二萜类成分抗炎、抑菌活性较好。因此，开发和利用大苞荆芥的松香烷二萜类单体化合物，进一步挖掘其潜在的药用价值，并对其单体化合物的结构和理化性质进行确定和表征，对于开发利用大苞荆芥具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种Nepetabrate E及其制备方法和应用，克服了上述现有技术之不足，本发明首次公开了Nepetabrate E，本发明所述的Nepetabrate E对脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7细胞具有较强的抗炎作用，从而使得Nepetabrate E能够作为制备预防炎症药物和抗炎药物的应用。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种Nepetabrate E，化学结构式为：
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述按照下述方法制备得到：第一步，将大苞荆芥地上部分粉碎过筛并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散成混悬液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，将萃取液浓缩得到各部位浸膏；第三步，取正丁醇部位浸膏用水分散经AB-8大孔树脂，用乙醇-水梯度洗脱，取10％乙醇洗脱部位浓缩为乙醇洗脱部位浸膏；第四步，取乙醇洗脱部位浸膏经ODS反相色谱以甲醇-水梯度洗脱，取第3个馏分经高效液相色谱甲醇-水梯度洗脱后纯化分离，收集洗脱物并浓缩，在第15.2分钟处得到Nepetabrate E。
上述第一步中，每1g大苞荆芥地上部分加入8mL至12mL乙醇。
上述第四步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为85:15。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种Nepetabrate E的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，将大苞荆芥地上部分粉碎过筛并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散成混悬液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，将萃取液浓缩得到各部位浸膏；第三步，取正丁醇部位浸膏用水分散经AB-8大孔树脂，用乙醇-水梯度洗脱，取10％乙醇洗脱部位浓缩为乙醇洗脱部位浸膏；第四步，取乙醇洗脱部位浸膏经ODS反相色谱以甲醇-水梯度洗脱，取第3个馏分经高效液相色谱甲醇-水梯度洗脱后纯化分离，收集洗脱物并浓缩，在第15.2分钟处得到Nepetabrate E。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述第一步中，每1g大苞荆芥地上部分加入8mL至12mL乙醇。
上述第四步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为85:15。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种Nepetabrate E作为制备预防炎症药物的应用。
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种Nepetabrate E作为制备抗炎药物的应用。
本发明的技术方案之五是通过以下措施来实现的：一种Nepetabrate E作为制备防治炎症保健品的应用。
本发明首次公开了Nepetabrate E，本发明所述的Nepetabrate E对脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7细胞具有较强的抗炎作用，从而使得Nepetabrate E能够作为制备预防炎症药物和抗炎药物的应用。
附图说明
附图1为本发明Nepetabrate E的化学结构图。
附图2为本发明Nepetabrate E的HR-MS图谱。
附图3为本发明Nepetabrate E的1H-NMR谱图。
附图4为本发明Nepetabrate E的13C-APT谱图。
附图5为本发明Nepetabrate E的H1-H1 COSY谱图。
附图6为本发明Nepetabrate E的HSQC谱图。
附图7为本发明Nepetabrate E的HMBC谱图。
附图8为本发明Nepetabrate E的NOESY谱图。
附图9为本发明Nepetabrate E对RAW264.7细胞的毒性作用柱状图。
附图10为本发明Nepetabrate E对LPS诱导的RAW264.7细胞的TNF-α水平影响图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：该Nepetabrate E，于化学结构式为：
实施例2：作为上述实施例的优化，按照下述方法制备得到：第一步，将大苞荆芥地上部分粉碎过筛并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散成混悬液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，将萃取液浓缩得到各部位浸膏；第三步，取正丁醇部位浸膏用水分散经AB-8大孔树脂，用乙醇-水梯度洗脱，取10％乙醇洗脱部位浓缩为乙醇洗脱部位浸膏；第四步，取乙醇洗脱部位浸膏经ODS反相色谱以甲醇-水梯度洗脱，取第3个馏分经高效液相色谱甲醇-水梯度洗脱后纯化分离，收集洗脱物并浓缩，在第15.2分钟处得到Nepetabrate E。
实施例3：作为上述实施例的优化，第一步中，每1g大苞荆芥地上部分加入8mL至12mL乙醇。
实施例4：作为上述实施例的优化，第四步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为85:15。
实施例5：该Nepetabrate E的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，将大苞荆芥地上部分粉碎过筛并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散成混悬液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，将萃取液浓缩得到各部位浸膏；第三步，取正丁醇部位浸膏用水分散经AB-8大孔树脂，用乙醇-水梯度洗脱，取10％乙醇洗脱部位浓缩为乙醇洗脱部位浸膏；第四步，取乙醇洗脱部位浸膏经ODS反相色谱以甲醇-水梯度洗脱，取第3个馏分经高效液相色谱甲醇-水梯度洗脱后纯化分离，收集洗脱物并浓缩，在第15.2分钟处得到Nepetabrate E。
实施例6：该Nepetabrate E作为制备预防炎症药物的应用。
实施例7：该Nepetabrate E作为制备抗炎药物的应用。
实施例8：该Nepetabrate E作为制备防治炎症保健品的应用。
实施例9：该Nepetabrate E按照下述方法得到：第一步，将6kg大苞荆芥地上部分粉碎过筛并加入40L乙醇，在室温下浸泡3小时后，在50℃条件下加热回流提取3次，每次2小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散成混悬液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，将萃取液浓缩得到各部位浸膏；第三步，取正丁醇部位浸膏用水分散经AB-8大孔树脂，用乙醇-水梯度洗脱，取10％乙醇洗脱部位浓缩为乙醇洗脱部位浸膏；第四步，取乙醇洗脱部位浸膏经ODS反相色谱以甲醇-水梯度洗脱，取第3个馏分经高效液相色谱甲醇-水梯度洗脱后纯化分离，收集洗脱物并浓缩，在第15.2分钟处得到Nepetabrate E。
将本发明实施例9得到的Nepetabrate E进行核磁共振氢谱(1H-NMR)和核磁共振碳谱(13C-APT)分析。HR-MS图谱、1H-NMR谱图、13C-APT谱图、H1-H1 COSY谱图、HSQC谱图、HMBC谱图、NOESY谱图如图2至图8所示。
结合图2、图5、图6、图7、图8对图3和图4进行图谱解析，将图3和图4各峰进行归属，图3和图4的峰归属如表1所示。通过图3、图4和表1的数据可知，本发明Nepetabrate E的化学结构式如图1所示，本发明Nepetabrate E为无定形粉末，易溶于氯仿、甲醇。
将本发明Nepetabrate E进行体外细胞毒性实验和抗炎药效学实验，体外细胞毒性实验利用MTT比色法。ELISA法测定细胞上清液炎症因子TNF-α水平。
以Nepetabrate E为实验组，以吲哚美辛(抗炎药物)为对照组，同时设立空白组，取对数生长期的RAW264.7细胞,移液枪吹打收集至离心管中,稀释计数,计算细胞悬浮液中细胞密度,用完全培养基配成2×105/mL的细胞悬浮液,接种于96孔板中,100μL/孔,置培养箱中培养。12h后,弃去孔中上清液,分别加入100μL浓度为200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL的Nepetabrate E培养基或空白培养基,即给药组和空白对照组,每组设置3个复孔,置培养箱中培养24h,弃去上清液,每孔加入100μL DMEM培养基20μL MTT溶液(5mg/mL),继续培养4h,弃去上清液,每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO),在摇床上震荡10min后,紫色结晶充分溶解,于酶标仪490nm处检测各孔的光密度D(λ)值。
取对数生长期的RAW264.7细胞,用移液枪吹打收集至离心管中,稀释计数,计算细胞悬浮液中细胞的密度,用完全培养基配成1×106/mL的细胞悬浮液,接种于96孔板中,100μL/孔,置培养箱中培养。12h后,弃去孔中上清液,分别加入200μLNepetabrate E培养基含LPS 1μg/mL,浓度为4μg/mL的阿司匹林的培养基含LPS1μg/mL,含LPS 1μg/mL培养基和培养基,即给药组、阳性对照组、模型组和空白对照组,每组设置3个复孔,置培养箱中培养,24h后按试剂盒测定细胞分泌的TNF-α水平。
本发明Nepetabrate E对RAW264.7细胞的毒性作用柱状图如图9所示。图9可以看出Nepetabrate E对脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7细胞具有较强的抗炎作用。
本发明Nepetabrate E对LPS诱导的RAW264.7细胞的TNF-α水平影响图如图10所示。图10可以看出，与正常组与模型组比较,各给药组TNF-α分泌量显著降低。
综上所述，本发明首次公开了Nepetabrate E，本发明Nepetabrate E对脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7细胞具有较强的抗炎作用，从而使得Nepetabrate E能够作为制备预防炎症药物和抗炎药物的应用。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
表1
Claims (6)
1.一种化合物，其特征在于化学结构式为：
2.一种根据权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：第一步，将大苞荆芥地上部分粉碎过筛并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散成混悬液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，将萃取液浓缩得到各部位浸膏；第三步，取正丁醇部位浸膏用水分散经AB-8大孔树脂，用乙醇-水梯度洗脱，取10％乙醇洗脱部位浓缩为乙醇洗脱部位浸膏；第四步，取乙醇洗脱部位浸膏经ODS反相色谱以甲醇-水梯度洗脱，取第3个馏分经高效液相色谱甲醇-水梯度洗脱后纯化分离，收集洗脱物并浓缩，在第15.2分钟处得到化合物。
3.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于第一步中，每1g大苞荆芥地上部分加入8mL至12mL乙醇。
4.根据权利要求2或3所述的化合物的制备方法，其特征在于第四步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为85：15。
5.一种根据权利要求1所述的化合物作为制备预防脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7细胞炎症药物的应用。
6.一种根据权利要求1所述的化合物作为制备抗脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7细胞炎症药物的应用。
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