CN113336628B - 一种二醇蔷薇烷、其制备方法及用途 - Google Patents

一种二醇蔷薇烷、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种二醇蔷薇烷，其具有如下结构：
Figure DDA0003024636460000011
其化合物的分子式为C19H26O2，分子量是286。本发明还公开所述二醇蔷薇烷的制备方法和用途。

Description

一种二醇蔷薇烷、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于天然药物化学技术领域，具体涉及一种大狼毒中二醇蔷薇烷、其制备方法及应用。
背景技术
大戟科大戟属植物大狼毒(Euphorbia nematocypha Hand.-Mazz.)，以根入药。辛、苦、温，有毒，根有大毒。该物种为中国植物图谱数据库收录的有毒植物，其毒性为汁液沾染皮肤引起过敏反应，面部浮肿，口服引起腹痛、腹泻、呕吐、烦躁、血压下降，重者眩晕、步态不稳、痉挛等。大狼毒中富含二萜、三萜类成分、鞣质和其他含有挥发油成分、植物甾醇类、蒽醌等。二萜类结构类型主要为松香烷型、巴豆烷型、异海松型骨架二萜、对映-阿替斯烷型骨架二萜等，三萜类结构类型主要为羊毛脂烷型、环阿尔廷烷型、大戟烷型、甘遂烷型、齐敦果烷型、乌苏烷型及羽扇豆烷型等。
大狼毒的提取部位和化学成分显示出多方面的用途。NorihitoMaru等[1]从大狼毒中分离鉴定出具有细胞毒活性的jolkinolide F。Chun-Shuai Huang等[2]从大狼毒中分离鉴定出具有拒食作用和抗呼吸道合胞病毒(RSV)的化合物。陈颖志[3]发现大狼毒乙酸乙酯部位可抑制β-羟高铁血红素形成。Lu Li等[4]分离鉴定出ebraphenolA-D和EbralactoneA，其中ebraphenolA表现出显著的脂肪酶抑制活性。吴玉霞等[5]比较了大狼毒、鸡冠花等13种常见中药材80％乙醇提取物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)、大肠埃希菌(Escherichiacoli,EC)和白色念珠菌(Candida albicans,CA)的抑制作用。并不清楚大狼毒抑制金黄色葡萄球菌的物质基础。研究表明，中国人肠道菌群具有更多的耐药基因。因此研发能有效控制耐药细菌感染的新策略和新药物，成为抗菌素研究的热点。
参考文献：
[1]Maru N,Chikaraishi N,Yokota K,et al.Jolkinolide F,a CytotoxieDiterpenoid from Euphorbia jolkinii[J].Chemistry Letters,2015,42(7):756-757.
[2]Chun-Shuai Huang,Shi-Hong Luo,Yao-Lan Li,et al.Antifeedant andAntiviral Diterp enoids from the Fresh Roots of Euphorbia jolkinii[J].NaturalProducts and Bioprospect ing,2014,4(2):91-100.
[3]陈颖志,三种植物地下部分化学成分与生物活性研究[D],大理大学,2017.
[4]Lu L A,Dl B,Cw C,et al.Aromatic rosanediterpenoids from the rootsof Euph orbia ebracteolata and their inhibitory effects against lipase[J].Bioorganic Chemistry,2020,94:103360.
[5]吴玉霞,张铁焕,奠佐红,左国营.13种中药材提取物体外抗菌活性筛选[J].中国医院药学杂志,2020,40(05):481-487.
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种二醇蔷薇烷；第二目的在于提供所述二醇蔷薇烷的制备方法；第三目的在于提供所述二醇蔷薇烷的应用，可用于清除自由基和抑制金黄色葡萄球菌生长。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面公开了一种二醇蔷薇烷，其具有如下结构：
Figure BDA0003024636440000021
其化合物的分子式为C19H26O2，分子量是286。
本发明第二方面公开了所述的二醇蔷薇烷的制备方法，以大狼毒为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为：
(1)浸膏提取：将大狼毒药材粉碎后用第一溶剂提取，然后除去第一溶剂得到粗提取物；
(2)有机溶剂萃取：将步骤(1)得到的粗提物悬浮于水中，用第二溶剂萃取，然后除去第二溶剂，得到棕色浸膏；
(3)柱层析：以氯仿与甲醇体积比1:1的混合溶剂溶解步骤(2)得到的浸膏，然后吸附在200～300目的硅胶上，干法装柱；以氯仿与甲醇的体积比为1:0,50:1,20:1,10:1,1:1的混合溶剂进行梯度洗脱；取20:1的洗脱液，除去溶剂得到洗脱样品A；用甲醇溶解洗脱样品A，将其吸附在RP-18上，干法柱层析，依次以5v/v％甲醇、70v/v％甲醇、100v/v％甲醇洗脱；取70v/v％甲醇洗脱液，除去溶剂得到洗脱样品B；
(4)高效液相色谱分离：高效液相色谱分离纯化步骤(3)得到样品B，即得到所述的二醇蔷薇烷。
优选地，步骤(1)所述的第一溶剂为体积浓度为70～100％的甲醇水溶液或体积浓度为90～100％的乙醇水溶液，所述提取为加热回流提取。
优选地，步骤(2)所述的第二溶剂为乙酸乙酯。
优选地，步骤(4)所述的高效液相色谱是以9.4×250mm，5μm的C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为220～300nm；流动相为体积浓度为35％的乙腈水溶液，流速为3.0ml/min，每次进样10～100μL，收集26.3min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得到所述的二醇蔷薇烷。
本发明第三方面公开了所述的二醇蔷薇烷用于清除自由基的用途。
本发明第三方面还公开了所述的二醇蔷薇烷用于抑制金黄色葡萄球菌生长的用途。
本发明的所述二醇蔷薇烷的制备方法的一个实施例如下：
(1)浸膏提取：干燥的大狼毒粉末25.0kg，粉碎后用90％的MeOH加热回流提取3次(70℃；每次提取时间为4小时)，减压蒸馏除去溶剂合并浸膏，得甲醇粗提取物；
(2)有机溶剂萃取：将粗提物悬浮于水(15.5L)中，以乙酸乙酯萃取(15L×3)，减压蒸馏除去乙酸乙酯，得到棕色浸膏193.2g；
(3)柱层析：以氯仿:甲醇(体积比1:1)的混合溶剂(4.0L)溶解甲醇浸膏540.2g，将样品吸附在200～300目的硅胶(1.0kg)上；干法装柱，以体积比氯仿:甲醇(1:0；50:1；20:1；10:1；1:1，体积分别是50L、50L、50L、50L、20L)进行梯度洗脱，减压蒸馏除去溶剂后，得到相对应洗脱样品Fr.1(11.0g)、Fr.2(20.2g)、Fr.3(24.2g)、Fr.4(66.0g)和Fr.5(201.5g)。以甲醇溶解样品Fr.3(24.2g)，将其吸附在RP-18上，干法柱层析，依次以体积比为5％甲醇(9.0L)、70％甲醇(9.0L)、100％甲醇(5.0L)洗脱，减压蒸馏除去溶剂后，得到相对应洗脱样品Fr.3a(9.6g)、Fr.3b(2.0g)、Fr.3c(1.2g)；
(4)高效液相色谱分离纯化：取70v/v％甲醇洗脱液得到洗脱样品Fr.3b(2.0g)的300mg，以体积浓度为35％的乙腈水溶液为流动相，流速为3.0ml/min，以9.4×250mm，5μm的C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50μL，收集26.3min的色谱峰，多次累加后蒸干得到8mg浅黄色粉末，即为所述的二醇蔷薇烷。
以上述方法制备得到的二醇蔷薇烷的结构通过以下方法进行测定：
本发明化合物为浅黄色粉末；
ESI-MS显示其准分子离子峰为285[M-H]-，结合1H NMR、13C NMR和D EPT谱确定其分子式为C19H26O2，不饱和度为7。
13C-NMR和DEPT谱显示该化合物3个甲基、5个亚甲基、5个次甲基、6个季碳。这些信息提示得到化合物是一个18位缺失的蔷薇烷型二萜。该化合物的核磁信号与ebraphenol B的核磁信号相似，主要区别是：该化合物比ebraphenol B比少了一个甲氧基信号δC 56.0(q)和δH 3.48(3H,s)。同时，C-6向低场位移至δC65.5(d)，C-7位向高场位移至δC35.3(t)。这个信息提示该化合物的C-6位链接了-OH基团。在HMBC谱中，δH4.93(1H，dd6.0,1.5,H-6)与δC123.7(s,C-4),δC135.7(s,C-5)相关性以及δH1.91(1H，dt13.8,4.2,H-7)与δC65.5(d,C-6)的相关性进一步证明了C-6位连接了-OH基团。在ROESY谱中，δH2.13(1H,m,H-8)分别与δH4.93(1H,dd,6.0,1.5,H-6)和δH1.07(3H,s,H-17)有相关性，提示该化合物C-6位的-OH是β构型。至此，化合物的结构得到确定，并命名为：3,6β-二羟基蔷薇烷。
表1：化合物的(1H:400MHz；13C:100MHz)NMR数据(CDCl3)
Figure BDA0003024636440000041
Figure BDA0003024636440000051
化合物ebraphenol B的化学结构如下所示：
Figure BDA0003024636440000052
本发明所述二醇蔷薇烷具有清除自由基的作用。
对本发明化合物进行了抗氧化活性测试，抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50μg/mL的乙醇溶液为初筛浓度，测定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一块costar 96孔板，加入新鲜配制的DPPH乙醇溶液(浓度为6.0×105mol/L)190μL/孔，加入本发明化合物样品l0μL/孔，空白孔加l0μL生理盐水，充分混匀，用封板膜封板后室温下避光静置30分钟，于UV2401分光光度计上测定仪上测定各孔吸光度值，测定波长为517nm；样品对脂性自由基DPPH清除率按下式计算:
DPPH清除率(％)＝(A空白-A样品)/A空白×100％
A空白：空白对照组吸光度值；A样品：加样品组吸光度值。
样品平行3次检测，计算半数清除浓度IC50测定结果为12.79±0.07μg/L，表明本发明化合物具有良好的清除自由基效果。
本发明所述二醇蔷薇烷具有一定的抑制金黄色葡萄球菌生长的作用。
抗菌活性参照文献报道的连续梯度稀释法于96孔板中进行。将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,ATCC 25923)接种至LB培养基(1L水，10g胰蛋白胨，5g酵母膏和10g氯化钠)，培养18h。样品溶解于DMSO中，采用二倍梯度稀释法将样品加入96孔板中，使最终浓度为0～512μg/mL，加入稀释至适当浓度的预先培养好的菌液，放置于37度下，培养18小时细菌观察微生物生长状况。卡纳霉素用做阳性对照，DMSO做阴性对照。每个样品做2次重复，最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentrain,MIC)为抑制微生物生长的最小浓度。卡那霉素和本发明所述二醇蔷薇烷的平均MIC分别是6.01μg/mL和15.60μg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的二醇蔷薇烷为首次报道。
2、本发明首次从中药材大狼毒中被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为二醇蔷薇烷，并表征了其具体结构。
3、本发明通过试验证明，二醇蔷薇烷化合物具有良好清除自由基作用和抑制金黄色葡萄球菌生长的活性的作用。
附图说明
图1为本发明的二醇蔷薇烷的化学结构；
图2为本发明的二醇蔷薇烷的核磁共振氢谱(1H NMR谱)；
图3为本发明的二醇蔷薇烷的核磁共振碳谱(13C NMR和DEPT谱)；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
除非另有说明，本发明的比例为体积比，浓度为体积百分比浓度。
本发明所述的二醇蔷薇烷，是从中药材大狼毒中分离得到，其分子式和分子量分别是C19H26O2、286，具有下述结构：
Figure BDA0003024636440000061
本发明所述二醇蔷薇烷的制备方法，是以中药材大狼毒原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为：
A、浸膏提取：干燥的大狼毒粉末25.0kg，粉碎后用90％的MeOH加热回流提取3次(70℃；每次提取时间为4小时)，减压蒸馏除去溶剂合并浸膏，得甲醇粗提取物；
B、有机溶剂萃取：将粗提物悬浮于水(15.5L)中，以乙酸乙酯萃取(15L×3)，减压蒸馏除去乙酸乙酯，得到棕色浸膏193.2g；
C、柱层析：以氯仿:甲醇(体积比1:1)的混合溶剂(4.0L)溶解甲醇浸膏540.2g，将样品吸附在200～300目的硅胶(1.0kg)上，干法装柱，以体积比氯仿:甲醇(1:0；50:1；20:1；10:1；1:1，体积分别是50L、50L、50L、50L、20L)进行梯度洗脱，减压蒸馏除去溶剂后，得到相对应洗脱样品Fr.1(11.0g)、Fr.2(20.2g)、Fr.3(24.2g)、Fr.4(66.0g)和Fr.5(201.5g)。以甲醇溶解样品Fr.3(24.2g)，将其吸附在RP-18上，干法柱层析，依次以体积比为5％甲醇(9.0L)、70％甲醇(9.0L)、100％甲醇(5.0L)洗脱，减压蒸馏除去溶剂后，得到相对应洗脱样品Fr.3a(9.6g)、Fr.3b(2.0g)、Fr.3c(1.2g)。
D、高效液相色谱分离：取70v/v％甲醇洗脱液得到洗脱样品Fr.3b(2.0g)的300mg，以体积浓度为35％的乙腈水溶液为流动相，流速为3.0ml/min，以9.4×250mm，5μm的C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50μL，收集26.3min的色谱峰，多次累加后蒸干得到8mg浅黄色粉末，即为所述的二醇蔷薇烷。
实施例1
干燥的大狼毒粉末25.0kg，粉碎后用90％的MeOH加热回流提取3次(70℃；每次提取时间为4小时)，减压蒸馏除去溶剂合并浸膏，得甲醇粗提取物。将粗提物悬浮于水(15.5L)中，以乙酸乙酯萃取(15L×3)，减压蒸馏除去乙酸乙酯，得到棕色浸膏193.2g；以氯仿:甲醇(体积比1:1)的混合溶剂(4.0L)溶解甲醇浸膏540.2g，将样品吸附在200～300目的硅胶(1.0kg)上。干法装柱，以体积比氯仿:甲醇(1:0；50:1；20:1；10:1；1:1，体积分别是50L、50L、50L、50L、20L)进行梯度洗脱，减压蒸馏除去溶剂后，得到相对应洗脱样品Fr.1(11.0g)、Fr.2(20.2g)、Fr.3(24.2g)、Fr.4(66.0g)和Fr.5(201.5g)。以甲醇溶解样品Fr.3(24.2g)，将其吸附在RP-18上，干法柱层析，依次以体积比为5％甲醇(9.0L)、70％甲醇(9.0L)、100％甲醇(5.0L)洗脱，减压蒸馏除去溶剂后，得到相对应洗脱样品Fr.3a(9.6g)、Fr.3b(2.0g)、Fr.3c(1.2g)。取70v/v％甲醇洗脱液得到洗脱样品Fr.3b(2.0g)，以体积浓度为35％的乙腈水溶液为流动相，流速为3.0ml/min，以9.4×250mm，5μm的C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50μL，收集26.3mi n的色谱峰，多次累加后蒸干得到浅黄色粉末，即为所述的二醇蔷薇烷。
实施例2
ESI-MS显示其准分子离子峰为285[M-H]-，结合1H NMR、13C NMR和DEPT谱(如图2和图3所示)确定其分子式为C19H26O2，不饱和度为7；13C-NMR和DEPT谱显示该化合物3个甲基、5个亚甲基、5个次甲基、6个季碳。这些信息提示得到化合物是一个18位缺失的蔷薇烷型二萜。该化合物的核磁信号与ebraphenol B的核磁信号相似，主要区别是：该化合物比ebraphenol B比少了一个甲氧基信号δC 56.0(q)和δH 3.48(3H,s)。同时，C-6向低场位移至δC65.5(d)，C-7位向高场位移至δC35.3(t)。这个信息提示该化合物的C-6位链接了-OH基团。在HMBC谱中，δH4.93(1H，dd6.0,1.5,H-6)与δC123.7(s,C-4),δC135.7(s,C-5)相关性以及δH1.91(1H，dt13.8,4.2,H-7)与δC65.5(d,C-6)的相关性进一步证明了C-6位连接了-OH基团。在ROESY谱中，δH2.13(1H,m,H-8)分别与δH4.93(1H,dd,6.0,1.5,H-6)和δH1.07(3H,s,H-17)有相关性，提示该化合物C-6位的-OH是β构型。至此，化合物的结构得到确定，如图1所示，并命名为：3,6β-二羟基蔷薇烷。
实施例3
对化合物进行了抗氧化活性测试，抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50μg/mL为初筛浓度，测定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一块costar 96孔板，加入新鲜配制的DPPH乙醇溶液(6.0×105mol/L)190μL/孔，加入待测样品l0μL/孔，空白孔加l0μL生理盐水，充分混匀，用封板膜封板后室温下避光静置30分钟，于UV2401分光光度计上测定仪上测定各孔吸光度值，测定波长为517nm；样品对脂性自由基DPPH清除率按下式计算:
DPPH清除率(％)＝(A空白-A样品)/A空白×100％
A空白：空白对照组吸光度值；A样品：加样品组吸光度值。
样品平行3次检测，计算半数清除浓度IC50测定结果为12.79±0.07μg/L，与阳性对照芦丁的IC50测定结果12.31±0.04μg/L相近。该结果表明化合物具有良好的清除自由基作用。
实施例4
抗菌活性参照文献报道的连续梯度稀释法于96孔板中进行。将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,ATCC 25923)接种至LB培养基(1L水，10g胰蛋白胨，5g酵母膏和10g氯化钠)，培养18h。样品溶解于DMSO中，采用二倍梯度稀释法将样品加入96孔板中，使最终浓度为0～512μg/mL，加入稀释至适当浓度的预先培养好的菌液，放置于37度下，培养18小时细菌观察微生物生长状况。卡纳霉素用做阳性对照。每个样品做2次重复，最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentrain,MIC)为抑制微生物生长的最小浓度。卡那霉素和本发明所述二醇蔷薇烷的平均MIC分别是6.01μg/mL和15.60μg/mL。说明本发明的二醇蔷薇烷具有一定的抑制金黄色葡萄球菌生长的作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (2)

1.一种二醇蔷薇烷，其特征在于，其具有如下结构：
Figure FDA0004012145800000011
其化合物的分子式为C19H26O2，分子量是286。
2.一种根据权利要求1所述的二醇蔷薇烷的制备方法，其特征在于，以大狼毒为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为：
(1)浸膏提取：将大狼毒药材粉碎后用第一溶剂提取，然后除去第一溶剂得到粗提取物；所述的第一溶剂为体积浓度为70～100％的甲醇水溶液或体积浓度为90～100％的乙醇水溶液，所述提取为加热回流提取；
(2)有机溶剂萃取：将步骤(1)得到的粗提物悬浮于水中，用第二溶剂萃取，然后除去第二溶剂，得到浸膏；所述的第二溶剂为乙酸乙酯；
(3)柱层析：以氯仿与甲醇体积比1:1的混合溶剂溶解步骤(2)得到的浸膏，然后吸附在200～300目的硅胶上，干法装柱；以氯仿与甲醇的体积比为1:0,50:1,20:1,10:1,1:1的混合溶剂进行梯度洗脱；取20:1的洗脱液，除去溶剂得到洗脱样品A；用甲醇溶解洗脱样品A，将其吸附在RP-18上，干法柱层析，依次以5v/v％甲醇、70v/v％甲醇、100v/v％甲醇洗脱；取70v/v％甲醇洗脱液，除去溶剂得到洗脱样品B；
(4)高效液相色谱分离：高效液相色谱分离纯化步骤(3)得到样品B，即得到所述的二醇蔷薇烷；所述的高效液相色谱是以9.4×250mm，5μm的C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为220～300nm；流动相为体积浓度为35％的乙腈水溶液，流速为3.0ml/min，每次进样10～100μL，收集26.3min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得到所述的二醇蔷薇烷。
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