CN107501065B - 一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物及其制备方法与应用，属于天然产物化学技术领域。该化合物结构式如式（I）所示：

，式（I）；该化合物是以传统药食同源植物芦荟为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得。经活性测试表明，本发明化合物具有较好的抑菌作用，将本发明化合物添加到烟草料液中，能有效抑制料液中的微生物生长，延长烟草料液的保质期，具有良好的应用前景。

Description

一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物及其制备 方法与应用

技术领域

本发明属于天然产物化学技术领域，具体涉及一种从传统药食同源植物芦荟中首次提取得到的多取代基萘类化合物。同时，本发明还涉及该化合物的制备方法，以及其在防止烟草料液腐败变质，延长烟草烟草料液保质期中的应用。

背景技术

芦荟为百合科芦荟属多年生常绿草本植物，原产于地中海、非洲，因其易于栽种，为花叶兼备的观赏植物，颇受大众喜爱。据考证野生芦荟品种300多种，有药用价值的芦荟品种主要有：洋芦荟、库拉索芦荟、好望角芦荟、元江芦荟等。芦荟是集食用、药用、美容、观赏于一身植物。其泌出物(主要有效成分是芦荟素等葱醌类物质)已广泛应用到医药和日化中。芦荟酊是抗菌性很强的物质，能杀灭多种真菌、霉菌、细菌、病毒等病菌，抑制和消灭病原体的发育繁殖。研究表明芦荟中发现的化学成分已达160多种，其有效活性成分达100种以上。芦荟中主要活性成分有蒽醌、吡喃酮、色酮、萘类衍生物、多糖类、黄酮等，这些有效成分具有抗菌、抗炎、解热、保肝、抗癌、杀虫及免疫增强等多方面的功用。

天然防腐剂也称天然有机防腐剂，是由生物体分泌或者体内存在的具有抑菌作用的物质，经人工提取或者加工而成为食品防腐剂。此类防腐剂为天然物质，有的本身就是食品的组分，故对人体无毒害，并能增进食品的风味品质，因而是一类有发展前景的食品防腐剂。随着食品安全性与保健功能日益成为人们关注的焦点，食品原料乃至食品添加剂的选择趋向天然、健康、具有生物活性的材料，天然植物成为了食品防腐、抗菌成分的重要来源，可用于抗菌、防腐剂开发的天然物质资源非常广泛，结构类型主要有：多取代基萘、黄酮、单宁、蒽醌、生物碱、木酯素、萜类化合物、甾醇等。

萘环化合物广泛存在自然界的某些植物和微生物代谢产物中，目前发现的总数大约有500多种，其分子结构不尽相同。由于萘环化合具有多种生物活性，常常是一些潜在的药物，萘环化合物多样的骨架结构以及它的广泛的生理活性得到了各方面的广泛关注；特别是其突出的抗菌活性，使萘环化合物成为了抗菌药物开发的重要药源分子。本发明从芦荟中分离得到了一种多取代基萘类化合物，活性研究表明该化合物具有较好的抗菌活性，可用于防止烟草料液的腐败变质，延长烟草料液的保质期。该化合物至今尚未见到相关报道。

发明内容

基于上述现有技术，本发明的目的在于提供一种新的多取代基萘类化合物，同时提供一种制备所述多取代基萘类化合物的方法，还涉及所述多取代基萘类化合物在防止烟草料液腐败变质，延长烟草料液保质期中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物，结构式如式(I)所示：

该化合物的命名为：3-羟基-1-(1,7-二羟基-3,6-二甲氧基萘-2-基)-1-丙酮；英文名为：3-hydroxy-1-(1,7-dihydroxy-3,6-dimethoxynaphthalen-2-yl)propan-1-one。

本发明所述的芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)，浸膏提取：以干燥的芦荟为原料，将芦荟粉碎到30～50目，用重量百分浓度为80％～100％的甲醇水溶液、重量百分浓度为80％～100％的乙醇水溶液或重量百分浓度60％～90％的丙酮水溶液为提取溶剂，浸泡提取多次，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤(2)，硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为160～300目，所用硅胶重量为浸膏重量2～4倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤(3)，高压液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高压液相色谱分离纯化，即得式(I)所示的多取代基萘类化合物。

进一步，优选的是，步骤(1)中，浸泡提取次数为3～5次，每次浸泡24h～72h，每次所用提取溶剂与芦荟的重量比为3～5:1。

进一步，优选的是，步骤(2)中，浸膏在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏1.5～3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样，之后上样。

进一步，优选的是，步骤(2)中，硅胶装柱的方法为干法装柱。

进一步，优选的是，步骤(3)中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为48％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集32.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。

本领域技术人员应该知晓本技术方案只是一个优选技术方案，高效液相色谱分离纯化采用的流动相不限于此。

进一步，优选的是，高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

上述方法制备得到的多取代基萘类化合物结构通过以下方法进行测定：

化合物为橙红色胶状物，其高分辨质谱HRESIMS(正离子采集)显示准分子离子峰为m/z 315.0852，(计算值315.0845)。结合¹H和¹³C NMR谱确定化合物分子式为C₁₅H₁₆O₆，不饱和度为8。

红外光谱中显示了羟基(3425cm^-1)、羰基(1682cm^-1)和芳环(1618、1542和1441cm^-1)的共振吸收峰。紫外光谱在215、260、332nm有最大吸收证实化合物中存在芳环结构。

化合物的¹H、¹³C NMR和DEPT数据(如图1、图2和表1)显示化合物中存在16个碳和16个氢，包括1个1,2,3,6,7-五取代的萘母核(C-1～C-8，C-4a和C-8a；H-4，H-5和H-8)，一个3-羟基-1-丙酮基^[5](C-1'～C-3'；H₂-2'和H₂-3')，两个甲氧基(δ_C 56.0q和56.3q；δ_H 3.80s和3.83s)，以及两个酚羟基(δ_H 12.74和11.28)。1,2,3,6,7-四取代的萘母核可进一步由H-4和C-2、C-3、C-4a、C-8a和C-5，H-5和C-4、C-6、C-7、C-4a和C-8a，以及H-8和C-1、C-6、C-7、C-4a和C-8a的HMBC相关(图3)得到确认。

进一步分析其HMBC相关谱(如图3)，根据两个甲氧基氢(δ_H 3.80和3.83)分别与C-3(δ_C 150.1)和C-6(δ_C 154.3)的HMBC相关可推测甲氧基取代在萘母核的C-3和C-6位。两个酚羟基取代在萘母核的C-1和C-7位可由酚羟基氢(δ_H 12.74)和C-1(δ_C 167.3)、C-2(δ_C109.3)、C-8a(δ_C 121.6)，以及另一个酚羟基氢(δ_H 11.28)和C-6(δ_C 154.3)、C-7(δ_C148.3)、C-8(δ_C 105.3)的HMBC相关得到确认。3-羟基-1-丙酮基取代在C-2位可通过H₂-2′(δ_H 3.33)和C-2(δ_C 109.3)的HMBC相关得到确认。萘环上典型的质子信号H-4(δ_H6.43s)、H-5(δ_H 6.94s)和H-8(δ_H 7.62s)也支持萘母核上的上述取代基模式。

至此，化合物的结构得到确定，并命名为化合物命名为：3-羟基-1-(1,7-二羟基-3,6-二甲氧基萘-2-基)-1-丙酮。

化合物的红外、紫外和质谱数据：UV(甲醇)，λ_max(logε)332(3.55)，260(3.18)，215(3.82)nm；IR(溴化钾压片)：ν_max 3425，3064，2959，2771，1682，1618，1542，1441，1350，1167，1288，1154，1046，1012cm^-1；¹H和¹³C NMR数据(500和125MHz,(CDCl₃)，见表-1；正离子模式ESIMS m/z 315[M+Na]⁺；正离子模式HRESIMS m/z 315.0852[M+Na]⁺(C₁₅H₁₆NaO₆，计算值315.0845)。

表1化合物(Ⅰ)的核磁共振数据(500/125MHz，溶剂为CDCl₃)

本发明还提供上述芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物作为抗菌剂的应用。

同时，本发明还提供芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物作为防腐剂的应用。

进一步，优选的是，所述的防腐剂为烟草料液防腐剂。本发明化合物能够防止烟草料液腐败变质，有效的延长烟草料液保质期。

对本发明化合物进行了抗菌活性筛选，体外抗菌实验用琼脂扩散法进行：首先将受试菌均匀地涂在MH琼脂培养基(牛肉粉6.0g/L，可溶性淀粉1.5g/L，酸水解酪蛋白17.5g/L，琼脂17.0g/L，pH7.3±0.1)，受试菌涂抹量为用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度，再将待测化合物(本发明化合物用10mL DMSO溶解，加水稀释成50μg/mL的溶液)浸泡好的药片(直径5mm)放在带菌的培养基上，放入恒温箱内，于25℃孵育24-72h后观察抑菌圈大小。

结果表明：本发明化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、埃希菌、枯草杆菌、变形杆菌等具有很强的活性；抑制率均超过94.8％。

同时，对本发明化合物进行了安全性评价，通过小鼠骨髓微核实验、Ames实验和TK基因突变实验,证明本发明化合物对动物无毒，使用安全。

将本发明化合物添加到烟草料液中，添加量为10μg/mL、20μg/mL和50μg/mL，并以未添加化合物的料液作为对照，放置两周后观察样品中的微生物变化。结果表明：和对照相比，添加10μg/mL、20μg/mL和50μg/mL的本发明化合物后，检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、真菌总数的抑制率，三种浓度的抑制率最低分别为：68.5％、82.6％、和96.7％。由于微生物的生长得到了有效抑制，烟草料液的质保期延长3-8倍。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明化合物从传统药食同源植物芦荟中分离得到，芦荟具有悠久的食用历史，并且芦荟作为原料或添加剂已被广泛应用于保健饮料和食品，对动物无毒，使用安全，芦荟提取物也广泛用作烟用添加剂，不会给卷烟产品带来不良影响。

本发明化合物安全、无毒，且展现出良好的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的抑菌率全部达到94.8％以上；用作烟草料液抑菌剂，能有效抑制烟草料液腐败变质，显著延长烟草料液的保质期；可有效避免烟草料液变质造成的损失和变质料液不慎进入卷烟产品造成的不良影响。

目前芦荟种植非常广泛，在我国广东、广西、四川、云南、福建等地有规模化栽培基地，原料来源广泛、成本低，而且本发明化合物制备工艺简单，工业化生产容易实现，具备大规模推广应用的条件。

附图说明

图1为本发明多取代基萘的核磁共振碳谱；

图2为本发明多取代基萘的核磁共振氢谱；

图3为本发明多取代基萘的主要HMBC相关。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明所用芦荟原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面基于不同产地的芦荟原料，对本发明做进一步说明。本发明所采用的芦荟均为普通市购品。

实施例1

芦荟样品来源于云南昆明，品种为库拉索芦荟。

一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)，浸膏提取：以干燥的芦荟为原料，将芦荟粉碎到30～50目，用重量百分浓度为80％的甲醇水溶液为提取溶剂，浸泡提取3次，每次浸泡24h，每次所用提取溶剂与芦荟的重量比为3:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤(2)，硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏1.5倍的丙酮溶解，然后用重量是浸膏0.8倍的80目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为160目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量3倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤(3)，高压液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式(I)所示的多取代基萘类化合物。

步骤(3)中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为48％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集32.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例2

芦荟样品来源于云南昆明，品种为库拉索芦荟。

一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)，浸膏提取：以干燥的芦荟为原料，将芦荟粉碎到30～50目，用甲醇为提取溶剂，浸泡提取5次，每次浸泡72h，每次所用提取溶剂与芦荟的重量比为5:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤(2)，硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏3倍的甲醇溶解，然后用重量是浸膏1.2倍的100目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为300目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量3.5倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤(3)，高压液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式(I)所示的多取代基萘类化合物。

步骤(3)中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为48％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集32.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例3

芦荟样品来源于云南昆明，品种为库拉索芦荟。

一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)，浸膏提取：以干燥的芦荟为原料，将芦荟粉碎到30～50目，用重量百分浓度为80％的乙醇水溶液为提取溶剂，浸泡提取4次，每次浸泡48h，每次所用提取溶剂与芦荟的重量比为4:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤(2)，硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏2.5倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.9倍的90目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为220目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量3倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤(3)，高压液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式(I)所示的多取代基萘类化合物。

步骤(3)中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为48％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集32.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例4

芦荟样品来源于云南昆明，品种为库拉索芦荟。

一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)，浸膏提取：以干燥的芦荟为原料，将芦荟粉碎到30～50目，用乙醇为提取溶剂，浸泡提取4次，每次浸泡56h，每次所用提取溶剂与芦荟的重量比为3.5:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤(2)，硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏2.2倍的丙酮溶解，然后用重量是浸膏1.1倍的90目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为250目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量2.5倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤(3)，高压液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式(I)所示的多取代基萘类化合物。

步骤(3)中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为48％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集32.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例5

芦荟样品来源于云南昆明，品种为库拉索芦荟。

一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)，浸膏提取：以干燥的芦荟为原料，将2.0kg芦荟粉碎到30～50目，用重量百分浓度为95％的甲醇水溶液为提取溶剂，浸泡提取5次，每次浸泡24h，每次所用提取溶剂与芦荟的重量比为3:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏，得浸膏115g；

步骤(2)，硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏2倍的甲醇溶解，然后用重量为130g的100目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为160目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量2倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤(3)，高压液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式(I)所示的多取代基萘类化合物。

步骤(3)中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的Zorb ax SB-C18，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为48％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集32.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例6

芦荟样品来源于云南元江，品种为中国芦荟。

一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)，浸膏提取：以干燥的芦荟为原料，将3.6kg芦荟粉碎到30～50目，用重量百分浓度为95％的乙醇水溶液为提取溶剂，浸泡提取3～5次，每次浸泡48h，每次所用提取溶剂与芦荟的重量比为4:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏，得浸膏265g；

步骤(2)，硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏2倍的甲醇溶解，然后用重量为280g的80目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为200目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量3倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤(3)，高压液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式(I)所示的多取代基萘类化合物。

步骤(3)中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的Zorb ax SB-C18，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为48％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集32.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例7

芦荟样品来源于福建三明，品种为库拉索芦荟。

一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)，浸膏提取：以干燥的芦荟为原料，将5.5kg芦荟粉碎到30～50目，用75％的丙酮水溶液为提取溶剂，浸泡提取3次，每次浸泡72h，每次所用提取溶剂与芦荟的重量比为5:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏，得浸膏396g；

步骤(2)，硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏1.6倍的甲醇溶解，然后用重量是450g的90目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为180目，硅胶装柱的方法为干法装柱，所用硅胶重量为浸膏重量4倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤(3)，高压液相色谱分离纯化：将步骤(2)中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高效液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化，即得式(I)所示的多取代基萘类化合物。

步骤(3)中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的Zorb ax SB-C18，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为48％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集32.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。

高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

实施例8

------化合物结构的鉴定

将实施例1方法制备得到的多取代基萘类化合物的结构通过以下方法进行测定：

化合物为橙红色胶状物，其高分辨质谱HRESIMS(正离子采集)显示准分子离子峰为m/z 315.0852，(计算值315.0845)。结合¹H和¹³C NMR谱确定化合物分子式为C₁₅H₁₆O₆，不饱和度为8。

红外光谱中显示了羟基(3425cm^-1)、羰基(1682cm^-1)和芳环(1618、1542和1441cm^-1)的共振吸收峰。紫外光谱在215、260、332nm有最大吸收证实化合物中存在芳环结构。

化合物的¹H、¹³C NMR和DEPT数据(如图1、图2和表1)显示化合物中存在16个碳和16个氢，包括1个1,2,3,6,7-五取代的萘母核(C-1～C-8，C-4a和C-8a；H-4，H-5和H-8)，一个3-羟基-1-丙酮基^[5](C-1'～C-3'；H₂-2'和H₂-3')，两个甲氧基(δ_C 56.0q和56.3q；δ_H 3.80s和3.83s)，以及两个酚羟基(δ_H 12.74和11.28)。1,2,3,6,7-四取代的萘母核可进一步由H-4和C-2、C-3、C-4a、C-8a和C-5，H-5和C-4、C-6、C-7、C-4a和C-8a，以及H-8和C-1、C-6、C-7、C-4a和C-8a的HMBC相关(图3)得到确认。

进一步分析其HMBC相关谱(如图3)，根据两个甲氧基氢(δ_H 3.80和3.83)分别与C-3(δ_C 150.1)和C-6(δ_C 154.3)的HMBC相关可推测甲氧基取代在萘母核的C-3和C-6位。两个酚羟基取代在萘母核的C-1和C-7位可由酚羟基氢(δ_H 12.74)和C-1(δ_C 167.3)、C-2(δ_C109.3)、C-8a(δ_C 121.6)，以及另一个酚羟基氢(δ_H 11.28)和C-6(δ_C 154.3)、C-7(δ_C148.3)、C-8(δ_C 105.3)的HMBC相关得到确认。3-羟基-1-丙酮基取代在C-2位可通过H₂-2′(δ_H 3.33)和C-2(δ_C 109.3)的HMBC相关得到确认。萘环上典型的质子信号H-4(δ_H6.43s)、H-5(δ_H 6.94s)和H-8(δ_H 7.62s)也支持萘母核上的上述取代基模式。

至此，化合物的结构得到确定，并命名为化合物命名为：3-羟基-1-(1,7-二羟基-3,6-二甲氧基萘-2-基)-1-丙酮。

实施例9

取实施例2-7制备的化合物，为橙红色胶状物。测定方法与实施例8相同，确认实施例2-7制备的化合物为所述的多取代基萘类化合物——3-羟基-1-(1,7-二羟基-3,6-二甲氧基萘-2-基)-1-丙酮。

实施例10

------化合物抗菌活性试验

取实施例1-7制备的任一多取代基萘类化合物进行抗菌活性试验，试验情况如下：

首先将受试菌均匀地涂在MH琼脂培养基(牛肉粉6.0g/L，可溶性淀粉1.5g/L，酸水解酪蛋白17.5g/L，琼脂17.0g/L，pH7.3±0.1)，受试菌涂抹量为用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度，再将待测化合物(本发明化合物用10mL DMS O溶解，加水稀释成50μg/mL的溶液)浸泡好的药片(直径5mm)放在带菌的培养基上，放入恒温箱内，于25℃孵育24-72h后观察抑菌圈大小。

结果表明：本发明化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、埃希菌、枯草杆菌、变形杆菌等具有很强的活性；抑制率均超过94.8％。

同时，对本发明化合物进行了安全性评价，通过小鼠骨髓微核实验、Ames实验和TK基因突变实验，证明本发明化合物对动物无毒，使用安全。

实施例11

------化合物应用

将本发明化合物添加到烟草料液中，添加量为10μg/mL、20μg/mL和50μg/mL，并以未添加化合物的料液作为对照，放置两周后观察样品中的微生物变化。结果表明：和对照相比，添加10μg/mL、20μg/mL和50μg/mL的本发明化合物后，检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、真菌总数的抑制率，三种浓度的抑制率最低分别为：68.5％、82.6％、和96.7％。由于微生物的生长得到了有效抑制，烟草料液的质保期大大得到延长，可延长3-8倍。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物，其特征在于，结构式如式（I）所示：

，式（I）。

2.权利要求1所述的芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1），浸膏提取：以干燥的芦荟为原料，将芦荟粉碎到30～50目，用重量百分浓度为80%～100%的甲醇水溶液、重量百分浓度为80%～100%的乙醇水溶液或重量百分浓度60%～90%的丙酮水溶液为提取溶剂，浸泡提取多次，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；

步骤（2），硅胶柱层析：将步骤（1）得到的浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~300目，所用硅胶重量为浸膏重量2～4倍量；以氯仿和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；

步骤（3），高压液相色谱分离纯化：将步骤（2）中采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分，经高压液相色谱分离纯化，即得式（I）所示的多取代基萘类化合物；

步骤（3）中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流速为20mL/min，流动相为体积浓度为48%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集32.8 min的色谱峰，多次累加后蒸干。

3.根据权利要求2所述的芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，浸泡提取次数为3～5次，每次浸泡24h～72h，每次所用提取溶剂与芦荟的重量比为3～5:1。

4.根据权利要求2所述的芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，浸膏在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏1.5~3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样，之后上样。

5.根据权利要求2所述的芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，硅胶装柱的方法为干法装柱。

6.根据权利要求2所述的芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物的制备方法，其特征在于：高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，得到本发明化合物的纯品。

7.权利要求1所述的芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物在制备抗菌剂中的应用。

8.权利要求1所述的芦荟中的具有抗菌活性的多取代基萘类化合物作为烟草料液防腐剂的应用。

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