CN108129544B - 一种具有抗微生物活性的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有抗微生物活性的化合物及其制备方法和应用，属于植物化学技术领域。本发明化合物命名为3‑(4',5'‑二羟基苯甲醛)羽扇豆醇，其分子式为C37H54O4，如式（I）所示：
，式（I）。本发明化合物是首次从云南西双版纳澄广花的枝叶中被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为三萜类化合物，并表征了其具体结构。本发明化合物对油菜菌核菌、草莓黑斑菌、马铃薯黄萎菌均表现出中等的抑制活性，其最低抑制浓度从25‑100ug/mL。同时这两个化合物也对某些细菌表现出微弱的抗细菌活性，最低抑制浓度50‑100ug/mL不等，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种具有抗微生物活性的化合物 及其制备方法和应用。
背景技术
云南澄广花(Orophea yunnanensis)为番荔枝科澄广花属的植物，产于云 南中部。澄广花中富含三萜类活性成分，三萜类成分是一类基本母核由30个碳 原子所组成的萜类化合物，以游离形式或以与糖结合成苷或酯的形式存在于植 物体内，具有多方面的生化活性，本发明通过对该植物的三萜类活性成分进行 系统分离，分离得到了结构新颖的三萜类活性成分，同时利用活性测试平台， 发现其对细菌和真菌均有一定的活性表现，为该类活性成分的应用提供了基础 数据。目前，该化合物及其应用未见相关报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种具有抗微生物活性的化合物；第二目的在 于提供所述化合物的制备方法；第三目的在于提供所述化合物在对抗真菌和细 菌活性方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
一种具有抗微生物活性的化合物，结构式如式(I)所示：
本发明同时提供上述具有抗微生物活性的化合物的制备方法，包括如下步 骤：
步骤(1)，浸膏提取：将干燥的澄广花粉碎到30-50目，以体积百分比浓 度为70-95％乙醇水溶液在室温下进行提取2-4次，每次6-10h，合并提取液， 过滤，得滤液，减压浓缩得浸膏；
步骤(2)，硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶 为200-300目；以石油醚和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为15: 1、7:1、3:1和1:1，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同 的部分并浓缩，得到A-D四部分；
步骤(3)，高压液相色谱分离分离：将步骤(2)得到的B部分再用体积比 为15:1-2:1氯仿和丙酮的混合溶剂进行梯度洗脱，得到B1-B6六部分；将B2 部分经高压液相色谱分离纯化，即得式(I)所示的具有抗微生物活性的化合物。
进一步，优选的是，所述的步骤(1)中乙醇水溶液的体积百分比浓度为7 0％。
进一步，优选的是，所述的步骤(1)中每次提取时乙醇水溶液的体积与澄 广花的质量比为8-12L:1Kg。
进一步，优选的是，步骤(2)中，步骤(1)得到的浸膏在经硅胶柱层析 前，用浸膏重量1.5～4倍量的体积浓度为95％甲醇水溶液进行溶解，然后用浸 膏质量2-4倍的100目硅胶搅拌至混合均匀，之后上样；
进一步，优选的是，步骤(2)中，装柱所用硅胶重量为浸膏重量3～5倍。
进一步，优选的是，所述的步骤(2)所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗 脱液流量为每秒一滴，每0.5-1.0L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于 1g，即更换梯度；
所述的步骤(3)中，梯度洗脱时，氯仿和丙酮的体积比依次为15:1、15: 2、15:3、15:4、15:5、15:7.5；梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒 一滴，每0.5-1.0L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度。
进一步，优选的是，步骤(3)所述的高压液相色谱分离纯化是采用采用2 0mm×250mm，5μm的C18色谱柱，以甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为 4:6-6:4，流速为10-14mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样180- 220μL，收集12-14min样品的色谱峰，多次累加后蒸干，得到蒸干物。
进一步，优选的是，高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解， 再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离纯化，分离时按照接收液体积计算，接 收第120-150mL洗脱液，然后浓缩，即得到式(Ⅰ)所示化合物纯品；其中， 凝胶色谱分离纯化使用的是SephadexLH-20凝胶柱。
上述方法制备得到的具有抗微生物活性的化合物结构通过以下方法进行测 定：
3-(4',5'-二羟基苯甲醛)羽扇豆醇(Ⅰ):白色粉末,[α]20D＝+51(c＝0.2,CHCl3),UV(MeOH)λmax(logε)298(4.05),262(4.20),216(4.49),20 4(4.62)nm；IR(KBr)νmax:3421,2943,1711,1678,1607,1445,1381,1 293,1227,1096,976cm-1。氢谱和碳谱见表1、图1和图2。Negative HR-ES I-MS:561.3947([M-H]-,C37H54O4,cald 561.3949)。
表1化合物(Ⅰ)的氢谱和碳谱
此外，本发明还提供澄广花中的三萜类化合物作为制备抗菌剂的应用。具 体抗真菌和抗细菌结果如表2和表3所示。
表2.化合物的抗细菌活性(MIC,μg/mL)
| 本发明化合物 | Ciprofloxacin | |
| Micrococcus lysodeikticus | >100 | 0.78 |
| Bacillus subtilis | >100 | 0.78 |
| Bacillus cereus | >100 | 0.78 |
| Micrococcus luteus | 50 | 0.78 |
| Staphyloccocus aureus | 100 | 3.13 |
| Bacillus megaterium | 50 | 0.78 |
| Bacterium paratyphosum B | >100 | 0.78 |
| Proteusbacillm vulgaris | >100 | 0.78 |
| Salmonella typhi | >100 | 0.78 |
| Psmdomonas aeruginosa | 50 | 0.78 |
| Escherichia coli | >100 | 0.78 |
| Enterobacter aerogenes. | >100 | 0.78 |
表3化合物的抗真菌活性(MIC,μg/mL)
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明化合物是首次从云南西双版纳澄广花的枝叶中被分离出来的，通过 核磁共振和质谱测定方法确定了为三萜类化合物，并表征了其具体结构。化合 物(I)对油菜菌核菌、草莓黑斑菌、马铃薯黄萎菌均表现出中等的抑制活性， 其最低抑制浓度从25-100ug/mL。同时这两个化合物也对某些细菌表现出微弱 的抗细菌活性，最低抑制浓度50-100ug/mL不等。
附图说明
图1为本发明化合物(Ⅰ)的核磁共振碳谱(13C NMR)图；
图2为本发明化合物(Ⅰ)的核磁共振氢谱(1H NMR)图；
图3为本发明化合物的HMBC和COSY图；
图4为本发明化合物的ROESY图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所 描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商 者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明所使用的澄广花为普通市售干制品，对于含水率没有具体限制。
本发明除非另有说明，否则百分数为质量百分数，比例为质量比。
本发明采用硅胶柱层析分离时，也可同时采用TLC薄层色谱点板跟踪。
实施例1
一种具有抗微生物活性的化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)，浸膏提取：将干燥的澄广花粉碎到30-40目，以体积百分比浓 度为70％乙醇水溶液在室温下进行提取2次，每次6h，合并提取液，过滤，得 滤液，减压浓缩得浸膏；每次提取时乙醇水溶液的体积与澄广花的质量比为8L: 1Kg；
步骤(2)，硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏先用浸膏重量1.5倍量的 体积浓度为95％甲醇水溶液进行溶解，然后用浸膏质量2倍的100目硅胶搅拌 至混合均匀，之后上样进行硅胶柱层析，装柱硅胶为200-250目，装柱所用硅 胶重量为浸膏重量3倍；以石油醚和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比 依次为15:1、7:1、3:1和1:1，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测， 合并相同的部分并浓缩，得到A-D四部分；
其中，梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.5L洗脱液 进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；
步骤(3)，高压液相色谱分离分离：将步骤(2)得到的B部分再用体积比 依次为15:1、15:2、15:3、15:4、15:5、15:7.5的氯仿和丙酮的混合溶剂进行 梯度洗脱，洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.5L洗脱液进行减压浓缩，当 浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度，得到B1-B6六部分；将B2部分经高压液 相色谱分离纯化，即得式(I)所示的具有抗微生物活性的化合物。
步骤(3)所述的高压液相色谱分离纯化是采用采用20mm×250mm，5μm 的C18色谱柱，以甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为4:6，流速为10mL/ min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样1800μL，收集12min样品的色 谱峰，多次累加后蒸干，得到蒸干物。
实施例2
一种具有抗微生物活性的化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)，浸膏提取：将干燥的澄广花粉碎到40-50目，以体积百分比浓 度为95％乙醇水溶液在室温下进行提取4次，每次10h，合并提取液，过滤， 得滤液，减压浓缩得浸膏；每次提取时乙醇水溶液的体积与澄广花的质量比为1 2L:1Kg；
步骤(2)，硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏先用浸膏重量4倍量的体 积浓度为95％甲醇水溶液进行溶解，然后用浸膏质量4倍的100目硅胶搅拌至 混合均匀，之后上样进行硅胶柱层析，装柱硅胶为250-300目，装柱所用硅胶 重量为浸膏重量5倍；以石油醚和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依 次为15:1、7:1、3:1和1:1，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测， 合并相同的部分并浓缩，得到A-D四部分；
其中，梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每1.0L洗脱液 进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；
步骤(3)，高压液相色谱分离分离：将步骤(2)得到的B部分再用体积比 依次为15:1、15:2、15:3、15:4、15:5、15:7.5的氯仿和丙酮的混合溶剂进行 梯度洗脱，洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每1.0L洗脱液进行减压浓缩，当 浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度，得到B 1-B6六部分；将B2部分经高压液 相色谱分离纯化，即得式(I)所示的具有抗微生物活性的化合物。
步骤(3)所述的高压液相色谱分离纯化是采用采用20mm×250mm，5μm 的C18色谱柱，以甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为6:4，流速为14mL/ min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样220μL，收集14min样品的色 谱峰，多次累加后蒸干，得到蒸干物。
高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相， 用凝胶柱层析分离纯化，分离时按照接收液体积计算，接收第120-150mL洗脱 液，然后浓缩，即得到式(Ⅰ)所示化合物纯品；其中，凝胶色谱分离纯化使 用的是Sephadex LH-20凝胶柱。
实施例3
一种具有抗微生物活性的化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)，浸膏提取：将干燥的澄广花粉碎到30-50目，以体积百分比浓 度为90％乙醇水溶液在室温下进行提取3次，每次8h，合并提取液，过滤，得 滤液，减压浓缩得浸膏；每次提取时乙醇水溶液的体积与澄广花的质量比为10 L:1Kg；
步骤(2)，硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏先用浸膏重量2倍量的体 积浓度为95％甲醇水溶液进行溶解，然后用浸膏质量3倍的100目硅胶搅拌至 混合均匀，之后上样进行硅胶柱层析，装柱硅胶为220-280目，装柱所用硅胶 重量为浸膏重量4倍；以石油醚和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依 次为15:1、7:1、3:1和1:1，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测， 合并相同的部分并浓缩，得到A-D四部分；
其中，梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.8L洗脱液 进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；
步骤(3)，高压液相色谱分离分离：将步骤(2)得到的B部分再用体积比 依次为15:1、15:2、15:3、15:4、15:5、15:7.5的氯仿和丙酮的混合溶剂进行 梯度洗脱，洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.8L洗脱液进行减压浓缩，当 浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度，得到B 1-B6六部分；将B2部分经高压液 相色谱分离纯化，即得式(I)所示的具有抗微生物活性的化合物。
步骤(3)所述的高压液相色谱分离纯化是采用采用20mm×250mm，5μm 的C18色谱柱，以甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为5:5，流速为13mL/ min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集13.1min样品的色 谱峰，多次累加后蒸干，得到蒸干物。
高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相， 用凝胶柱层析分离纯化，分离时按照接收液体积计算，接收第120-150mL洗 脱液，然后浓缩，即得到式(Ⅰ)所示化合物纯品；其中，凝胶色谱分离纯化 使用的是Sephadex LH-20凝胶柱。
实施例4
一种具有抗微生物活性的化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)，浸膏提取：将干燥的澄广花粉碎到30-50目，以体积百分比浓 度为85％乙醇水溶液在室温下进行提取3次，每次7h，合并提取液，过滤，得 滤液，减压浓缩得浸膏；每次提取时乙醇水溶液的体积与澄广花的质量比为9L: 1Kg；
步骤(2)，硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏先用浸膏重量3倍量的体 积浓度为95％甲醇水溶液进行溶解，然后用浸膏质量3.5倍的100目硅胶搅拌 至混合均匀，之后上样进行硅胶柱层析，装柱硅胶为200-300目，装柱所用硅 胶重量为浸膏重量4.5倍；以石油醚和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比 依次为15:1、7:1、3:1和1:1，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测， 合并相同的部分并浓缩，得到A-D四部分；
其中，梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.9L洗脱液 进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；
步骤(3)，高压液相色谱分离分离：将步骤(2)得到的B部分再用体积比 依次为15:1、15:2、15:3、15:4、15:5、15:7.5的氯仿和丙酮的混合溶剂进行 梯度洗脱，洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.6L洗脱液进行减压浓缩，当 浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度，得到B1-B6六部分；将B2部分经高压液 相色谱分离纯化，即得式(I)所示的具有抗微生物活性的化合物。
步骤(3)所述的高压液相色谱分离纯化是采用采用20mm×250mm，5μm 的C18色谱柱，以甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为4.5：5.5，流速为1 mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样190μL，收集12.7min样品 的色谱峰，多次累加后蒸干，得到蒸干物。
高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相， 用凝胶柱层析分离纯化，分离时按照接收液体积计算，接收第120-150mL洗 脱液，然后浓缩，即得到式(Ⅰ)所示化合物纯品；其中，凝胶色谱分离纯化 使用的是Sephadex LH-20凝胶柱。
实施例5
------化合物结构的鉴定
将实施例1方法制备得到的化合物的结构通过以下方法进行测定：
3-(4',5'-二羟基苯甲醛)羽扇豆醇(Ⅰ):白色粉末,[α]20D＝+51(c＝0.2,CHCl3),UV(MeOH)λmax(logε)298(4.05),262(4.20),216(4.49),20 4(4.62)nm；IR(KBr)νmax:3421,2943,1711,1678,1607,1445,1381,1 293,1227,1096,976cm-1。氢谱和碳谱见表1、图1和图2。HMBC和COSY 图如图3所示，ROESY图如图所示。Negative HR-ESI-MS:561.3947([M-H]-, C37H54O4,cald 561.3949)。至此，化合物的结构得到确定。
实施例6
取实施例2-4制备的化合物，为白色粉末。测定方法与实施例5相同，确认 实施例2-4制备的化合物为3-(4',5'-二羟基苯甲醛)羽扇豆醇。
应用例
本发明还提供澄广花中的三萜类化合物的抗真菌和抗细菌试验，结果如表4 和表5所示。
表4.化合物的抗细菌活性(MIC,μg/mL)
| 本发明化合物 | Ciprofloxacin | |
| Micrococcus lysodeikticus | >100 | 0.78 |
| Bacillus subtilis | >100 | 0.78 |
| Bacillus cereus | >100 | 0.78 |
| Micrococcus luteus | 50 | 0.78 |
| Staphyloccocus aureus | 100 | 3.13 |
| Bacillus megaterium | 50 | 0.78 |
| Bacterium paratyphosum B | >100 | 0.78 |
| Proteusbacillm vulgaris | >100 | 0.78 |
| Salmonella typhi | >100 | 0.78 |
| Psmdomonas aeruginosa | 50 | 0.78 |
| Escherichia coli | >100 | 0.78 |
| Enterobacter aerogenes. | >100 | 0.78 |
表5化合物的抗真菌活性(MIC,μg/mL)
由以上结果显示，本发明化合物可以作为制备抗菌剂，具有良好的应用前 景。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的 技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描 述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还 会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (9)
1.一种具有抗微生物活性的化合物的制备方法，其特征在于，所述的具有抗微生物活性的化合物结构式如式（I）所示：
所述的制备方法包括如下步骤：
步骤（1），浸膏提取：将干燥的澄广花粉碎到30-50目，以体积百分比浓度为70-95%乙醇水溶液在室温下进行提取2-4次，每次6-10h，合并提取液，过滤，得滤液，减压浓缩得浸膏；
步骤（2），硅胶柱层析：将步骤（1）得到的浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为200-300目；以石油醚和丙酮混合有机溶剂进行梯度洗脱，体积比依次为15:1、7:1、3:1和1:1，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分并浓缩，得到A-D四部分；
步骤（3），高压液相色谱分离分离：将步骤（2）得到的B部分再用体积比为15:1-2:1氯仿和丙酮的混合溶剂进行梯度洗脱，得到B1-B6六部分；将B2部分经高压液相色谱分离纯化，即得式（I）所示的具有抗微生物活性的化合物。
2.根据权利要求1所述具有抗微生物活性的化合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中乙醇水溶液的体积百分比浓度为70%。
3.根据权利要求1所述具有抗微生物活性的化合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中每次提取时乙醇水溶液的体积与澄广花的质量比为8-12L:1Kg。
4.根据权利要求1所述具有抗微生物活性的化合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，步骤（1）得到的浸膏在经硅胶柱层析前，用浸膏重量1.5~4倍量的体积浓度为95%甲醇水溶液进行溶解，然后用浸膏质量2-4倍的100目硅胶搅拌至混合均匀，之后上样。
5.根据权利要求1所述具有抗微生物活性的化合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，装柱所用硅胶重量为浸膏重量3~5倍。
6.根据权利要求1所述具有抗微生物活性的化合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.5-1.0L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；
所述的步骤（3）中，梯度洗脱时，氯仿和丙酮的体积比依次为15:1、15:2、15:3、15:4、15:5、15:7.5；梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.5-1.0L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度。
7.根据权利要求1所述具有抗微生物活性的化合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的高压液相色谱分离纯化是采用20mm×250mm，5μm的C18色谱柱，以甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为4:6-6:4，流速为10-14mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样180-220μL，收集12-14min样品的色谱峰，多次累加后蒸干，得到蒸干物。
8.根据权利要求1或7所述具有抗微生物活性的化合物的制备方法，其特征在于，高效液相色谱分离纯化后得到的蒸干物用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离纯化，分离时按照接收液体积计算，接收第120-150 mL洗脱液，然后浓缩，即得到式（Ⅰ）所示化合物纯品；其中，凝胶色谱分离纯化使用的是Sephadex LH-20凝胶柱。
9.权利要求1所述具有抗微生物活性的化合物作为制备抗菌剂的应用。
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