CN109265434B

CN109265434B - Dac制备法从南山茶中提取木脂素的方法

Info

Publication number: CN109265434B
Application number: CN201811459499.7A
Authority: CN
Inventors: 曹清明; 袁欢; 胡丹丹; 金燕京; 黄靓澳
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2038-11-30
Also published as: CN109265434A

Abstract

本发明提供了一种DAC制备法从南山茶中提取木脂素的方法。所述方法包括：将茶饼用乙醇水溶液浸提得到提取液；减压蒸馏得到浓缩液，用乙酸乙酯萃取浓缩液得到萃取液，减压蒸馏得到萃取浓缩液；将硅胶加入进行拌样，然后烘干得到处理样品；以硅胶作为填料干法上样，使用二氯甲烷‑甲醇体系进行梯度洗脱，收集含有目标化合物的多组分流份段；用C18色谱柱、甲醇水溶液作为流动相进行恒定洗脱，收集含有目标化合物的粗流份段；用C18色谱柱、0‑40min用45‑50％甲醇水溶液作为流动相进行梯度洗脱，收集含有目标化合物的流份段浓缩冻干。本申请提供的方法首次从山茶属植物中有效提取出目标化合物，有利于南山茶的深度开发利用。

Description

DAC制备法从南山茶中提取木脂素的方法

技术领域

本发明涉及化合物提取领域，具体而言，涉及一种DAC制备法从南山茶中提取木脂素的方法。

背景技术

南山茶又名广宁红花油茶(Camellia semiserrata Chi.)，属于山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia L.)植物，多年生乔木或灌木。南山茶主要分布在我国的广西东南部以及广东西部，它是油茶的一种重要栽培物种。经研究比较各类油茶发现，南山茶中的化学成分相对比较丰富。

木脂素是一类由苯丙素双分子聚合而成的天然成分，组成木脂素的单体有四种：桂皮酸(偶有桂皮醛)、桂皮醇、丙烯苯、烯丙苯。木脂素存在于植物中，属于一种植物雌激素，具有清除体内自由基，抗氧化，抗肿瘤的作用。亚麻籽及芝麻中木脂素的含量较高，谷物类食物(如黑麦，小麦，燕麦，大麦等)，大豆和十字花科植物(如西兰花)和一些水果(如草莓)中也含木脂素。木脂素能结合雌激素受体，并干扰癌促效应。因此，可能对乳腺癌，前列腺癌和结肠癌等有防治作用。

现有技术中也有对南山茶进行研究的，但是研究范围有限，方法和效果有一定的局限性。

对南山茶中有效成分的研究，分析南山茶中的有效活性物质，并将木脂素类化合物从中分离提取出来并得到纯度较高的产品，对于南山茶的深度应用以及抗肿瘤事业的发展具有重要的科技和经济价值。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DAC制备法从南山茶中提取木脂素的方法，所述方法能够快速有效的从南山茶中提取出纯度很高的目标化合物。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种DAC制备法从南山茶中提取木脂素的方法，所述方法包括以下步骤:

A.浸提：将南山茶的茶饼用乙醇水溶液浸提，得到提取液；

B.浓缩萃取：将所述提取液减压蒸馏至无醇得到浓缩液，用乙酸乙酯萃取所述浓缩液，得到萃取液，将所述萃取液减压蒸馏至粘稠状，得到萃取浓缩液；

C.柱层析：以少量多次的方式将硅胶加入所述萃取浓缩液，进行拌样，然后烘干，得到处理样品；以硅胶作为填料，干法上样进行柱层析，使用二氯甲烷-甲醇体系进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，收集含有目标化合物的多组分流份段；

D.DAC液相制备：使用C18色谱柱Z1、甲醇水溶液作为流动相，对所述多组分流份段进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，收集含有所述目标化合物的粗流份段；

E.液相半制备：使用C18色谱柱Z2、0-40min用45-50％甲醇水溶液作为流动相，对所述粗流份段进行梯度洗脱，收集含有所述目标化合物的流份段，浓缩冻干得到所述目标化合物，所述目标化合物的结构式为：

该方法通过浸提-浓缩-萃取-柱层析-DAC制备-液相半制备的程序，有效地将目标化合物进行分离提取，提取得率为180mg/kg以上，纯度高达98.5％以上。DAC(动态轴向压缩)制备的应用，有效地将目标化合物与其他成分进行分段，提高制备纯度和分离提取效率。

优选地，所述步骤C中，所述梯度洗脱为：各洗脱段二氯甲烷-甲醇体系的体积比依次为20:1、8:1、5:1、3:1，每个体积比对应的洗脱段洗脱至洗脱液无色。

洗脱剂的选择、洗脱体系的确定，也是柱层析的关键，所要考虑的是被分离物的极性。在本申请中，先根据极性使用常见的洗脱剂进行试验，确定洗脱剂类型；然后进行洗脱梯度的确定，通过用不同浓度的二氯甲烷-甲醇体系进行薄层色谱分析，获得能够将样品点分离的比较好的梯度作为柱层析的洗脱梯度。

进一步优选地，所述步骤C中，层析柱体积为1.25L，收集流份段时，以四分之一柱体积为一个收集单位，收集第31-33流份段。

选择合适的收集时机，对于将南山茶中复杂的成分进行有效分离、提高分离效率是十分重要的。流份段过宽会导致合并之后合并液内成分过多，需要多次分离才能获得提取物；流份段过窄会导致很难判断合并的时机，进而使得合并不恰当，要么得率过低，要么需要多次分析检测、分离才能获得目标提取物。优选地收集流份段的时机，可以最大程度的获得得率、纯度和提取效率的平衡。

优选地，所述步骤D中，所述C18色谱柱Z1的规格为：C18ME 50×250mm，填料粒径为10微米；甲醇水溶液的体积分数为50％。

更加优选地，所述步骤E中，所述C18色谱柱Z2的规格为：C18ME20×250mm，填料粒径为10微米。

流动相的选择是与目标提取物的性质和色谱柱的性质相关的。优选地参数可以使得提取结果更好，提取过程更加有效率。

优选地，所述南山茶饼的制作方法为：将南山茶果晾干、去壳，以物理压榨法脱去油脂后晾干，粉碎即可。

通过晾干、去壳、脱油脂的方法制得茶饼，可以有效的提高提取得率。

更加优选地，所述乙醇水溶液的体积分数为50-60％；所述浸提的方法为：料液比为1kg所述南山茶饼对应2-4L所述乙醇水溶液，在60-70℃条件下回流提取，过滤得到所述提取液。

料液比、浸提溶剂及其体积分数、浸提温度的选择，本质上是由目标提取物的性质决定的。

优选地，所述硅胶的粒径为200-300目。

更加优选地，所述步骤C中，硅胶的加入量为：每3.5-4mL所述萃取浓缩液对应1g硅胶。

拌样参数控制、填料类型和粒径的选择，极大的影响着柱层析的结果。优化这些参数，可以尽可能的将目标提取物与非目标提取物分离开，以提高提取得率和纯度。

更加优选地，所述步骤C中，柱层析时，对层析柱进行加压处理。

加压处理主要是为了保证柱层析效率，优选气泵法进行加压处理。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)首次从山茶属植物中分离出了目标提取物；

(2)本申请提供的提取方法，适合于推广应用。

(3)提取得率高、纯度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1进行液相半制备得到的目标化合物的HPLC图；

图2为实施例1制备得到的目标化合物的纯度测定图；

图3为本申请制备得到的目标化合物的质谱图；

图4为本申请制备得到的目标化合物的H谱图；

图5为本申请制备得到的目标化合物的C谱图；

图6为本申请制备得到的目标化合物的H-H COSY谱图；

图7为本申请制备得到的目标化合物的HSQC谱图；

图8为本申请制备得到的目标化合物的HMBC谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，本申请实施例使用柱体积为1.25L的层析柱，即，BV＝1.25L。

实施例1

将南山茶果晾干，去壳，以物理压榨法脱去油脂后将茶饼晾干，并适当粉碎，即得到南山茶饼。以56％乙醇水溶液于68℃加热回流提取3次，每次2h，料液比为1:2.5(m/v)，然后对得到的提取液进行过滤、合并。

合并后的滤液减压浓缩至无醇旋出，得浓缩液。取浓缩液2L，以等体积的乙酸乙酯反复萃取多次，直至上层萃取液颜色变浅，合并萃取液，减压浓缩至粘稠状，得乙酸乙酯萃取部位的萃取浓缩液150mL。

取上述萃取浓缩液150mL于蒸发皿中，以少量多次的方式加入250目硅胶，共计37.5g，进行拌样。搅拌均匀后于50℃烘干，得到处理样品。

对该处理样品进行硅胶柱层析处理：取200目硅胶500g作为柱层析的填料，以干法上样，并以泵对柱子进行加压处理。以不同浓度的二氯甲烷-甲醇体系进行薄层色谱分析，选择能够将样品点分离得比较好的梯度作为硅胶柱层析的洗脱梯度。经过分析，最终确定二氯甲烷-甲醇体系的洗脱配比依次为20:1，8:1，5:1，3:1。以已确定梯度的二氯甲烷-甲醇体系进行梯度洗脱，每个体积比对应的洗脱段洗脱至洗脱液无色，然后下个体积比对应的洗脱段进行洗脱，直至洗脱结束。同时以约1/4BV为单位收集洗脱液，分别按顺序编号为1、2、3……124、125，将收集到的洗脱液进行薄层色谱检测和高效液相色谱检测，根据检测结果合并收集编号31-33的含有目标化合物的多组分流份段。

此步骤中高效液相色谱检测的条件为：色谱仪：Waters 2996高效液相色谱仪(配备Waters 2996Photodiode Array Detector检测器)；色谱柱：Unitary C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相A为甲醇，B为0.1％甲酸-水；流速为1mL/min。其中，流动相A和B的比例在0-32分钟内自1:9至8:2变化，32-40分钟为1:9。

使用LC6000型高效液相色谱仪、色谱柱C18ME 100A 50mm×250mm，10μm；流动相：甲醇：水＝50:50；流速：80mL/min，进样量5mL；检测器：UV254nm；对编号31-33的含有目标化合物的流份段，进行DAC制备，得到含有目标化合物的粗流份段。

使用LC3000型高效液相色谱仪、C18ME(20×250mm，10μm，100A)色谱柱、0-40min用45-50％甲醇水溶液作为流动相；控制流速20mL/min、检测器UV254nm、进样量0.5mL，对上述流份段进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经薄层色谱分析，确定收集时机，收集仅含有目标化合物的流分段，浓缩冻干得到目标化合物。液相色谱图如图1所示。

实施例2

将南山茶果晾干，去壳，以物理压榨法脱去油脂后将茶饼晾干，并适当粉碎，即得到南山茶饼。以60％乙醇水溶液于65℃加热回流提取3次，每次2h，料液比为1:4(m/v)，然后对得到的提取液进行过滤、合并。

取上述萃取浓缩液150mL于蒸发皿中，以少量多次的方式加入200目硅胶，共计40g，进行拌样。搅拌均匀后于50℃烘干，得到处理样品。

对该处理样品进行硅胶柱层析处理：取300目硅胶500g作为柱层析的填料，以干法上样，并以泵对柱子进行加压处理。二氯甲烷-甲醇体系的洗脱配比依次为20:1，8:1，5:1，3:1。以已确定梯度的二氯甲烷-甲醇体系进行梯度洗脱，每个体积比对应的洗脱段洗脱至洗脱液无色，然后下个体积比对应的洗脱段进行洗脱，直至洗脱结束。同时以约1/4BV为单位收集洗脱液，分别按顺序编号为1、2、3……124、125，将收集到的洗脱液进行薄层色谱检测和高效液相色谱检测，根据检测结果合并收集编号31-33的含有目标化合物的多组分流份段。此步骤中，高效液相色谱检测条件同实施例1。

使用LC3000型高效液相色谱仪、C18ME(20×250mm，10μm，100A)色谱柱、0-40min用45-50％甲醇水溶液作为流动相；控制流速20mL/min、检测器UV254nm、进样量0.5mL，对上述流份段进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经薄层色谱分析，确定收集时机，收集仅含有目标化合物的流分段，浓缩冻干得到目标化合物。

实施例3

将南山茶果晾干，去壳，以物理压榨法脱去油脂后将茶饼晾干，并适当粉碎，即得到南山茶饼。以50％乙醇水溶液于60℃加热回流提取3次，每次2h，料液比为1:2(m/v)，然后对得到的提取液进行过滤、合并。

取上述萃取浓缩液150mL于蒸发皿中，以少量多次的方式加入300目硅胶，共计40g，进行拌样。搅拌均匀后于50℃烘干，得到处理样品。

实施例4

将南山茶果晾干，去壳，以物理压榨法脱去油脂后将茶饼晾干，并适当粉碎，即得到南山茶饼。以55％乙醇水溶液于70℃加热回流提取3次，每次2h，料液比为1:3(m/v)，然后对得到的提取液进行过滤、合并。

取上述萃取浓缩液150mL于蒸发皿中，以少量多次的方式加入200目硅胶，共计42.85g，进行拌样。搅拌均匀后于50℃烘干，得到处理样品。

对该处理样品进行硅胶柱层析处理：取200目硅胶500g作为柱层析的填料，以干法上样，并以泵对柱子进行加压处理。二氯甲烷-甲醇体系的洗脱配比依次为20:1，8:1，5:1，3:1。以已确定梯度的二氯甲烷-甲醇体系进行梯度洗脱，每个体积比对应的洗脱段洗脱至洗脱液无色，然后下个体积比对应的洗脱段进行洗脱，直至洗脱结束。同时以约1/4BV为单位收集洗脱液，分别按顺序编号为1、2、3……124、125，将收集到的洗脱液进行薄层色谱检测和高效液相色谱检测，根据检测结果合并收集编号31-33的含有目标化合物的多组分流份段。此步骤中，高效液相色谱检测条件同实施例1。

对实施例1-4得到的化合物单体的纯度进行测定，其测定条件为：使用LC3000型高效液相色谱仪、C18ME(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱、0-40min用45-50％甲醇水溶液作为流动相，控制流速20mL/min、检测器UV254nm、进样量0.5mL，进行梯度洗脱。其中实施例1得到纯度为98.5％，提取得率180mg/kg。纯度测定图如图2所示。实施例2-4得到的目标提取物纯度均大于等于98.5％。

对实施例1-4得到的化合物单体均进行LC-MS测定和核磁共振检测。

如图3所示，质谱数据m/z493.1489[M-H]^-，987.3070[2M-H]^-。推测其分子式为C₂₇H₂₆O₉。

图4(¹H-NMR)中，δ7.10-6.00之间共有11组信号为苯环或者烯烃质子，由此可推断该化合物中包含不止一个苯环；δ4.80-3.00之间共有10组信号符合连氧碳上质子特征。

图5(¹³C-NMR)中，δ80-60范围内共有9组信号符合连氧碳信号特征，其余18组信号化学位移位于110-160区间范围内，均符合苯环或烯烃碳信号特征，该结果与氢谱信号相吻合。

图6(H-H COSY)中，δ6.78分别与δ6.82、δ6.86相关。δ4.03分别与δ4.90、δ4.84、δ3.71、δ3.50相关，因此推断δ4.03为多个质子信号重叠在一起。结合H-H COSY、HSQC(见图7)，通过HMBC(见图8)可确定不同片段的连接位点，HMBC中，129.42与4.84(H，d，J＝8.0Hz)相关，131.22与4.90(H，d，J＝8.0Hz)相关。

对H谱和C谱的峰进行归属如下：

¹³C-NMR:129.42(C-1),115.57(C-2),146.66(C-3),147.19(C-4),116.37(C-5),120.44(C-6),77.61(C-7),80.05(C-8),62.08(C-9),131.22(C-1’),117.25(C-2’),145.47(C-3’),145.47(C-4’),118.12(C-5’),121.80(C-6’),77.33(C-7’),79.93(C-8’),62.03(C-9’),129.42(C-1”),115.65(C-2”),144.54(C-3”),145.16(C-4”),116.37(C-5”),120.44(C-6”),77.61(C-7”),80.05(C-8”),63.76(C-9”)。

¹H-NMR:7.02(H，d，J＝8.5Hz，H-5’),7.00(H，d，J＝2.5Hz，H-2’),6.97(2H，d，J＝2.5Hz，H-2”),6.93(2H，m，H-6,7”),6.89(2H，d，J＝8.5Hz，H-5”),6.86(H，d，J＝2.5Hz，H-2),6.82(H，d，J＝8.5Hz，H-5),6.78(H，d，J＝8.5Hz，H-6),4.90(H，d，J＝8.0Hz，H-7’),4.84(H，d，J＝8.0Hz，H-7),4.19(2H，d，J＝5.6Hz，H-9”),4.03(H，m，H-8’),3.71(H，d，J＝12.2,2.3Hz，H-9a,9’a),3.50(H，d，J＝10.2,3.4Hz，H-9b,9’b)。

综合所有核磁谱图及质谱结果，提取物结构式为：

本申请提供的DAC制备法从南山茶中提取木脂素的方法，首次从山茶属植物中分离提取出了目标化合物，方法简单实用，适宜于规模化应用，产品纯度高收率高，对于南山茶的深度开发利用有着积极意义，也为木脂素类化合物的应用提供了一个稳定、绿色、高效的来源。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种DAC制备法从南山茶中提取木脂素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:

A.浸提：将南山茶果晾干、去壳，以物理压榨法脱去油脂后晾干，粉碎；料液比为1kg南山茶饼对应2-4L乙醇水溶液，在60-70℃条件下回流提取，过滤得到提取液；所述乙醇水溶液的体积分数为50-60％；

C.柱层析：以少量多次的方式将硅胶加入所述萃取浓缩液，进行拌样，然后烘干，得到处理样品；以硅胶作为填料，干法上样进行柱层析，使用二氯甲烷-甲醇体系进行梯度洗脱，各洗脱段二氯甲烷-甲醇体系的体积比依次为20:1、8:1、5:1、3:1，每个体积比对应的洗脱段洗脱至洗脱液无色；分段收集洗脱液，经色谱分析，收集含有目标化合物的多组分流份段；层析柱体积为1.25L，收集流份段时，以四分之一柱体积为一个收集单位，收集第31-33流份段；

E.液相半制备：使用C18色谱柱Z2、0-40min用45-50％甲醇水溶液作为流动相，对所述粗流份段进行梯度洗脱，收集含有所述目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物，所述目标化合物的结构式为：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤D中，所述C18色谱柱Z1的规格为：C18ME 50×250mm，填料粒径为10微米；甲醇水溶液的体积分数为50％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤E中，所述C18色谱柱Z2的规格为：C18ME 20×250mm，填料粒径为10微米。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硅胶的粒径为200-300目。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤C中，硅胶的加入量为：每3.5-4mL所述萃取浓缩液对应1g硅胶。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤C中，柱层析时，对层析柱进行加压处理。