CN106344663A - 一种金英黄归注射剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金英黄归注射剂的制备方法，包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，原料药中加入乙醇浸泡，随后回流提取，过滤；药渣加乙醇回流提取，过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL‑1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到75％～85％，进行醇沉，在4℃下放置16～20h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液，再加入辅料制成注射剂。本发明提供的金英黄归注射剂的制备方法，工艺简单，试剂用量少，降低成本，节约时间，能够显著减少成品中有效成分的损失。

Description

一种金英黄归注射剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种金英黄归注射剂的制备方法，属于兽药技术领域。
背景技术
经皮给药导致有效成分挥发或减少、口服给药剂量大，此外还存在药物在胃肠道易被破坏的“首过效应”及某些药物难以通过“血乳屏障”等缺点。中药注射剂是我国所独有的新型中药剂型，以注射给药的方式，改变了传统剂型的给药途径，具有起效快、生物利用度高等特点，能较好地发挥中药治疗急病重症的作用，成为中药临床应用的突破口。但是，由于其组方复杂、成分难以确定、制备工艺相对落后、质量检验标准低等原因，近年来，有关不良反应的报道日益增多。因此，改善制备工艺、提高检验标准是控制中药注射剂质量促进中医药事业蓬勃发展的关键问题。现有的金英黄归注射剂制备工艺复杂，有效成分丢失较多，成品不稳定，易生成沉淀，因此，研究一种解决上述问题的金英黄归制剂，显得尤为必要。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种金英黄归注射剂的制备方法，操作简单易实现，制备的金英黄归注射剂有效成分含量高。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种金英黄归注射剂的制备方法，包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，原料药中加入乙醇浸泡，随后回流提取，过滤；药渣加乙醇回流提取，过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到75％～85％，进行醇沉，在4℃下放置16～20h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液，再加入辅料制成注射剂。
具体地，前述金英黄归注射剂的制备方法，包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，原料药中加入50％～60％乙醇浸泡25～35min，随后回流提取2～3h，多层纱布过滤；药渣加50％～60％乙醇回流提取1～2h，多层纱布过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到75％～85％，进行醇沉，在4℃下放置16～20h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液；混合液中加入明胶溶液至不产生沉淀为止，放置2～3h，使沉淀沉降，过滤去除沉淀，在滤液中加入无水乙醇至乙醇浓度>75％，放置2～3h，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，残渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到药液，随后加入亚硫酸钠，调节pH值至7.0～7.5，再加入活性炭，煮沸15～30min，采用0.22μm的水系无菌滤膜过滤至热源处理后的容器中，得到注射剂。
优选地，前述金英黄归注射剂的制备方法，包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，原料药中加入50％乙醇浸泡30min，随后回流提取2h，多层纱布过滤；药渣加50％乙醇回流提取1.5h，多层纱布过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到80％，进行醇沉，在4℃下放置16h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液；混合液中加入明胶溶液至不产生沉淀为止，放置2h，过滤去除沉淀，在滤液中加入无水乙醇至乙醇浓度>75％，放置2h，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，残渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到药液，随后加入亚硫酸钠，调节pH值至7.2，再加入活性炭，煮沸15min，采用0.22μm的水系无菌滤膜过滤至热源处理后的容器中，得到注射剂。
前述金英黄归注射剂的制备方法中，原料药中加入乙醇浸泡，原料药与乙醇的料液比为1g︰9～15mL。
前述金英黄归注射剂的制备方法中，药渣加乙醇回流提取，药渣与乙醇的料液比为1g︰8～12mL。
前述金英黄归注射剂的制备方法中，混合液的浓度为1.00g·mL-1。
前述金英黄归注射剂的制备方法中，明胶溶液的浓度为0.05～0.10g·mL-1。
前述金英黄归注射剂的制备方法中，亚硫酸钠的加入量为药液总质量的0.10％～0.20％。
前述金英黄归注射剂的制备方法中，活性炭的加入量为药液总质量的0.10％～0.50％。
前述金英黄归注射剂的制备方法中，原料药的用量，按照重量份数计为：金银花80～100份、蒲公英80～100份、瓜蒌80～100份、连翘60～80份、芙蓉花40～60份、大黄20～40份、黄芪20～40份和当归10～30份。
为了确保本发明方案的合理、有效，发明人进行了一系列实验。
一、原料与仪器
1、主要药物
金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、大黄、黄芪、当归于2013年购自贵阳市同济堂药店(药品GMP证号:黔J0190)，金银花为忍冬科植物忍冬Lonicerae japonica Thunb.的干燥花蕾，蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.的干燥全草，瓜蒌为葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥果实，连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl.的干燥果实，大黄为蓼科植物药用大黄Rheumofficinale Baill.的干燥根，黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge.的干燥根茎，当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels.的干燥根，芙蓉花为锦葵科植物木芙蓉(Hibiscus mutabilis L.)的花，2013年10月采自贵阳花溪湿地公园。
绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：119753-201314，纯度>96.65)，连翘酯苷A对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：HN1116XA13，纯度≥98％)。
2、主要试剂
无水乙醇、无水亚硫酸钠、明胶、氢氧化钠等有机化学试剂，均为国产分析纯、化学纯或色谱纯试剂。
3、主要实验仪器
Agilent Technologies 1260Infinity液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；RE-5298旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；超声波清洗机，上海冠特超声仪有限公司；回流提取装置，河南一恒仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；SW-CJ-1D型单人净化工作台，苏州净化设备有限公司；MultiskanGo型全波段酶标仪，Thermo公司；赛多利斯TE64电子分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
二、金英黄归注射剂制备工艺的确定
1、醇沉工艺的选择
1.1、醇沉条件的筛选
采用L9(34)正交实验考察乙醇浓度、醇沉时间、醇沉温度3个因素对提取效果的影响。以绿原酸和连翘酯苷A的含量为评价指标，正交试验设计及结果见表1和表2。
表1正交实验因素及水平
表2正交实验设计及结果
1.2、醇沉次数的筛选
对每次醇沉后得到的沉淀(药渣)进行反复醇沉，每次醇沉得到的上清液与上一次的上清液合并，以其中绿原酸和连翘酯苷A的含量评价指标，筛选出最合适的醇沉次数。实验结果见表3。
表3醇沉次数的筛选结果
综合醇沉条件的筛选和醇沉次数的筛选试验，实验结果表明：醇沉的最佳条件是乙醇浓度为80％，放置4℃醇沉16～20h。在醇沉后可以将药渣回收醇沉一次，合并滤液，这样可以提高有效成分的含量。
2、鞣质去除方法选择
2.1、醇溶液调pH值法
按照本发明的方法制备金英黄归注射剂时，在采用最佳醇沉浓度醇沉后，用40％NaOH调pH至7.5～8.0，再冷藏过夜、过滤去除沉淀。然后对样品进行鞣质检查，即取样液1.00mL，加稀醋酸1滴，再加明胶氯化钠试液(含明胶1wt.％、氯化钠10wt.％的水溶液)4～5滴，不得出现浑浊或沉淀。实验结果明显出现沉淀，表明此法对本药液除鞣质效果不好。
2.2、明胶沉淀法
按照本发明的方法制备金英黄归注射剂时，在采用最佳醇沉浓度醇沉后，随后加入浓度为0.10g·mL-1的明胶溶液于该药液中，至不产生沉淀为主，静置2h，滤过除去沉淀，滤液浓缩后加无水乙醇至浓度达到>75％，以除去过量的明胶。然后对样品进行鞣质检查，实验结果无浑浊或沉淀现象出现，表明此法可用于该药液鞣质的去除。
3、辅料的选择
结合本注射剂的理化性质，加入抗氧化剂作为辅料即可。本发明中选用亚硫酸钠作为辅料。中国药典规定中药注射剂中抗氧化剂(亚硫酸钠)的含量为0.10％～0.20％，因此，本发明中亚硫酸钠的加入量为药液总质量的0.10％～0.20％。优选为0.15％。
4、pH值的选择
按照本发明的方法制备金英黄归注射剂，在加入辅料后量取等量的该注射剂6份，分别调pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，综合药液的澄明度、溶解度及所用机体所需pH值观察试验结果。结果表明当pH值为7.0与7.5时溶液的澄明度、溶解度最好，故将金英注射剂的pH值定为7.0～7.5。
5、灭菌方法的选择
将按照本发明的方法制备金英黄归注射剂，并加入辅料和调好pH值后所得成品药液作为实验对象。
5.1、高压湿热灭菌法
将所得成品药液用立式压力蒸汽灭菌器以115℃的条件灭菌15min，灭菌之后按中国药典规定方法(2010年版一部附录ⅪH)进行无菌检查及进行绿原酸和连翘酯苷A的含量测定。实验结果见表4。
5.2、0.22μm滤膜过滤法
将所得成品药液采用水系的0.22μm无菌滤膜过滤，然后进行绿原酸和连翘酯苷A的含量测定。实验结果表明采用0.22μm滤膜过滤法更适合金英注射剂的灭菌。实验结果见表4。
表4灭菌后绿原酸与连翘酯苷A的含量变化
6、金英注射剂成型工艺路线
综上，筛选出的成型工艺路线为：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，原料药中加入50％～60％乙醇浸泡25～35min，随后回流提取2～3h，多层纱布过滤；药渣加50％～60％乙醇回流提取1～2h，多层纱布过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到75％～85％，进行醇沉，在4℃下放置16～20h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液；混合液中加入明胶溶液至不产生沉淀为止，放置2～3h，过滤去除沉淀，在滤液中加入无水乙醇至乙醇浓度>75％，放置2～3h，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，残渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到药液，随后加入亚硫酸钠，调节pH值至7.0～7.5，再加入活性炭，煮沸15～30min，采用0.22μm的水系无菌滤膜过滤至热源处理后的容器中，得到注射剂。三、金英黄归注射剂的检查
1、安全性试验
1.1、溶血试验：取健康大白鼠血液放于烧杯中，用玻璃棒搅动血液(以除去纤维蛋白质)，加入0.90％氯化钠溶液约10倍量摇匀，每分钟1500转离心15min，除去上清液。沉淀的红细胞再用0.9％氯化钠溶液按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9％氯化钠溶液制成2％的混悬液，供试验用。将洁净玻璃试管5支，编号为1、2、3、4、5号，其中1、2号为供试品(本发明注射剂)管，3号为阴性对照管，4号为阳性对照管，5号为供试品对照管。按下列方法加样，混匀后，立即置37±0.5℃的恒温箱中进行温育，3h后观察溶血与凝聚反应。试验方案见表5。
表5
实验结果：如试管中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或少量红细胞残留，表明有溶血现象。如红细胞全部下沉，上清液无色澄明，或上清液虽有色澄明，表明无溶血发生。若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。结果显示，1、2号和5号肉眼观察无明显差异，供试品管(本发明注射剂)与阳性对照管相比，虽有轻微的溶血现象，但溶血现象不是很明显，表明该注射剂符合肌肉注射溶血性试验要求。
1.2、急性毒性试验
(1)腹腔给药：选取体重20±2g的健康SPF级小鼠20只，雌雄各半。按5g/Kg的量腹腔注射浓度为0.50g·mL-1的本发明注射剂。正常饲养2个星期，观察小鼠的死亡率。实验结果显示，20只小鼠死亡数为0，表明本发明注射剂没有表现出急毒现象。
(2)尾静脉给药：选取体重20±2g的健康SPF级小鼠20只，雌雄各半。每只尾静脉缓慢注射0.2mL的本发明注射剂。正常饲养2个星期，观察小鼠的死亡率。实验结果显示，20只小鼠死亡数为0，表明本发明注射剂没有表现出急毒现象。
2、初步稳定性考察
取本发明注射剂，分别进行影响因素试验、加速试验和留样观察。
2.1、影响因素试验
2.1.1、强光照射试验
取本发明注射剂，除去外包装后分别置于培养皿中，使药液面﹤1cm，在(4500±500)LX光照度下放置10d，分别于第5d、10d取样测定，并与0d结果比较，分别考察本发明注射剂的澄明度、性状、pH值和含量测定，进行三个平行实验，结果取平均值。结果表明，本发明注射剂在光照条件下放置10d，pH值和外观澄明度指标则未发生明显改变，但绿原酸和连翘酯苷A的含量降低了，且连翘酯苷A的含量变化比绿原酸的含量变化大，说明强光对连翘酯苷A的影响较绿原酸大。实验结果见图1、表6。
表6强光照射试验结果
2.1.2、高温试验
取本发明注射剂，除去外包装后置于试管中，在60℃条件下放置10d，分别与第5d、10d取样测定，并与0d结果比较，分别考察本品的澄明度、性状、pH值和含量测定，进行三个平行实验，结果取平均值。实验结果表明，本发明注射剂在高温条件下放置10d，高温能明显降低绿原酸的含量，但不会随着时间的增加而一直降低，高温对连翘酯苷A的影响比较小，其含量降低比较少，此外，高温也对pH值有一定的影响使其降低。实验结果见图2、表7。
表7 60℃高温试验结果
2.2、加速试验
取本发明注射剂三批(样1：20150421、样2：20150429、样3：20150506)，置于35℃、相对湿度为75％条件下放置6个月，分别于0、1、2、3、6月时分别取样测定，并与0月时样品数据比较。实验结果见表8、图3-5。
表8加速实验结果
2.3、留样考察
取本发明注射剂三批(样1：20150421、样2：20150429、样3：20150506)，分别置于4℃和室温条件下放置6个月，分别于0、1、2、3、6月时分别取样测定，并与0月时样品数据比较。实验结果见表9-10、图6-11。
表9冰箱4℃实验结果
表10室温留样实验结果
本发明注射剂经强光照射、高温、低温等影响因素试验及加速试验，留样考察6个月，表明本发明注射剂对光和热敏感，应在避光低温的条件下保存，其性状、溶液的澄明度与颜色、有关物质、含量等指标才无明显变化。
四、工艺改进前、后生物活性和有效成分含量对比
传统的金英黄归注射剂的制备方法为：将8味中药按比例混合，称取一定量，加入50％乙醇浸泡30min，回流提取2h，多层纱布过滤。药渣再加50％乙醇，回流提取1.5h，多层纱布过滤，合并滤液，旋转蒸发至无醇味后定容至1.00g·mL-1。加入石油醚萃取，水相浓缩至1.00g·mL-1。加乙醇于溶液中连续进行3次醇沉，溶液中乙醇的浓度依次为70％、75％及80％，于4℃进行醇沉24h，取80％乙醇醇沉后的上清进行52℃旋转蒸发，回收乙醇，将无醇的浓缩液加入注射用水，制备成1.00g·mL-1的溶液，为澄明透亮的淡黄色液体状。加0.50％活性炭，煮沸，搅拌15min，过滤到热源处理后的容器中，制备成1.00g·mL-1的注射成品，调pH值为7.2，然后过0.22μm滤膜除菌，即得传统工艺金英黄归注射剂。
1、工艺改进前后注射剂的抑菌试验
1.1、金黄色葡萄球菌标准菌液准备
菌液准备主要包括复壮与计数，操作过程全部在超净工作台内进行。
(1)将金黄色葡萄球菌菌种接种于10％NaCl胰酪胨大豆肉汤培养基中，37℃下在恒温培养箱静置培养24h。
(2)移液枪吸取1.00mL菌液用灭菌生理盐水进行十倍梯度稀释，稀释8个梯度，每个梯度吸取100.00μL于营养琼脂平板上，用L棒轻轻摊匀，培养24h,进行菌落计数。
(3)通过计算，选出每毫升菌液的活细菌数量级为108/mL的菌液保存待用。本实验所选出每毫升菌液的活细菌数为3.08×108/mL(原菌液稀释五倍)。
1.2、最小抑菌浓度(MIC)的测定
采用试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，此试验需在无菌操作台上进行，具体操作如下：
(1)取无菌10.00mL小试管9支分成A、B组,每管中加入10％NaCl胰酪胨大豆肉汤培养基1.00mL，在A组第1支试管中加金英黄归汤1.00mL，用微量移液器混匀，吸取混匀液1.00mL至第2管混匀，依次到第7管，再从第7管吸出1.00mL混合液弃之，第8管做阳性对照(加菌液不加中药)，第9管做阴性对照(加中药不加菌液)，B组操作同A组，只是将药液换成金英注射剂。此时1到7号管内药液的浓度分别相当于500.00mg·mL-1、250.00mg·mL-1、125.00mg·mL-1、62.50mg·mL-1、31.25mg·mL-1、15.63mg·mL-1、7.81mg·mL-1生药浓度。
(2)分别向各组的1至8号试管中加入0.10mL菌液，第9支试管中加入0.10mL普通肉汤培养基。
(3)将各组1至9号试管置于37℃条件下培养18h，观察并记录结果。若有絮状沉淀，则有细菌生长，若无絮状沉淀，则细菌生长受到抑制。与对照组比较，以肉眼观察无絮状沉淀的试管药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。
(4)结果的判断标准:由于中草药对细菌的MIC国内目前尚无统一的标准，本实验参照同类实验的标准作为判断标准。即当MIC<7.81mg·mL-1生药浓度时为高度敏感；当MIC在15.63mg·mL-1～62.50mg·mL-1生药浓度时为中度敏感；当MIC为62.50mg·mL-1～250.00mg·mL-1生药浓度时为较敏感；当MIC>250.00mg·mL-1生药浓度时为不敏感。
在本试验中，传统工艺金英黄归注射剂对金黄色葡萄球菌表现为较敏感，其MIC为125.00mg·mL-1。而本发明的注射剂对金黄色葡萄球菌表现为不敏感，其MIC为500.00mg·mL-1。
1.3、最低杀菌浓度(MBC)的测定
(1)测出最低抑菌浓度(MIC)后，从没有絮状沉淀生成的试管中，用移液枪分别吸取0.10mL涂抹于营养琼脂平板上(每个浓度做3个平行试验)，在电热恒温培养箱内，37℃培养24h，观察细菌生长情况。
(2)结果判定标准：LB平板中，生长的菌落数小于5个菌落的药液最低浓度，即为最低杀菌浓度(MBC)。
在本试验中，传统工艺金英黄归注射剂的MBC为250.00mg·mL-1，本发明注射剂的MBC>500.00mg·mL-1
2、工艺改进前后注射剂的抗炎试验：
2.1、对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀抑制实验：取体重20±2g的昆明小白鼠80只，随机分成4组，每组20只，分别为空白组、阳性组、实验组1(传统工艺金英黄归注射剂)、实验组2(本发明注射剂)。空白组每天灌胃0.30mL的生理盐水，阳性组每天灌胃浓度为0.30g·mL-1的地塞米松0.30mL，实验组1每天灌胃浓度为0.30g·mL-1的传统工艺金英黄归注射剂0.30mL，实验组2每天灌胃浓度为0.30g·mL-1的本发明注射剂0.30mL。连续灌胃7天。在第7天给药1h后，以每只小鼠二甲苯用量为0.03mL，均匀涂于左耳前后两面，右耳作为对照。致炎后30min将小鼠处死，沿耳廓线剪下两耳，用直径9mm的不锈钢打孔器在同一部位分别打下耳片，随即用电子分析天平称重，以左右耳的重量之差为肿胀度，并计算各组肿胀抑制率，用肿胀抑制率表示各中药抗炎强度。计算公式：肿胀抑制率＝(空白组平均两耳重量差-药物组平均两耳重量差)/空白组平均两耳重量差×100％。数据均以平均数±标准差表示，采用SPSS17.0统计分析软件进行处理，组间数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05表示差异有统计学意义。实验结果见表11。
表11
注：“*”表示与空白组差异显著(P<0.05)。
2.2、对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加实验
取体重20±2g的昆明小白鼠80只，随机分成4组，每组20只，分别为空白组、阳性组、实验组1(传统工艺金英黄归注射剂)、实验组2(本发明注射剂)。空白组每天灌胃0.30mL的生理盐水，阳性组每天按4mg·kg-1的剂量灌胃扑尔敏，实验组1每天灌胃浓度为0.30g·mL-1的传统工艺金英黄归注射剂0.30mL，实验组2每天灌胃浓度为0.30g·mL-1的本发明注射剂0.30mL。连续灌胃7天。在第7天给药1h后于尾静脉注入0.5％伊文思蓝生理盐水溶液0.10mL/10g体重，随即腹腔注射0.6％醋酸生理盐水0.20mL/只，20min后小鼠脱劲处死，剪开腹腔皮肤肌肉，用6.00mL生理盐水数次洗涤腹腔，吸管吸出洗涤液。合并后加入生理盐水至10.00mL，3000r·min-1离心15min，取上清液于酶标仪590nm波长处测吸光值(OD值)，并计算各组抑制率。抑制率＝(空白组平均伊文思蓝量-药物组平均伊文思蓝量)/空白组平均伊文思蓝量×100％。数据均以平均数±标准差表示，采用SPSS17.0统计分析软件进行处理，组间数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05表示差异有统计学意义。实验结果见表12。
表12
注：“*”表示与空白组差异显著(P<0.05)。
通过两个抗炎试验结果可以看出，本发明注射剂与传统工艺的注射剂相比，具有显著的抑制作用(P<0.05)，表明本发明注射剂具有较好的抗炎活性。
3、工艺改进前后注射剂的有效成分含量
通过HPLC测定工艺改进前后注射剂中绿原酸、连翘酯苷A含量。结果如表13所示。
表13
成分 传统工艺注射剂 本发明注射剂
绿原酸(μg·mL-1) 32.45 50.84
连翘酯苷A(μg·mL-1) 37.50 48.18
由表13可知，与传统制备工艺相比，采用本发明制备方法的注射剂，其有效成分含量高。表明本发明的制备方法能够显著减少成品中有效成分的损失。
本发明的有益之处在于：本发明提供的一种金英黄归注射剂的制备方法，工艺简单，试剂用量少，降低成本，节约时间，能够显著减少成品中有效成分的损失。采用本发明制备方法制备得到的金英黄归注射剂，成品稳定性好，不易生成沉淀，有效成分含量高，治疗效果好，不具任何化学毒性，安全性高，克服了经皮给药导致有效成分挥发或减少、口服给药剂量大，且药物在胃肠道易被破坏的“首过效应”及某些药物难以通过“血乳屏障”等缺点。
附图说明
图1是在强光照射下本发明注射剂中绿原酸和连翘酯苷A的含量变化图；
图2是在高温下本发明注射剂中绿原酸和连翘酯苷A的含量变化图；
图3是本发明注射剂(20150421)加速实验中绿原酸、连翘酯苷A的含量变化图；
图4是本发明注射剂(20150429)加速实验中绿原酸、连翘酯苷A的含量变化图；
图5是本发明注射剂(20150506)加速实验中绿原酸、连翘酯苷A的含量变化图；
图6是本发明注射剂(20150421)冰箱4℃实验中绿原酸、连翘酯苷A的含量变化图；
图7是本发明注射剂(20150429)冰箱4℃实验中绿原酸、连翘酯苷A的含量变化图；
图8是本发明注射剂(20150506)冰箱4℃实验中绿原酸、连翘酯苷A的含量变化图；
图9是本发明注射剂(20150421)室温放置实验中绿原酸、连翘酯苷A的含量变化图；
图10是本发明注射剂(20150429)室温放置实验中绿原酸、连翘酯苷A的含量变化图；
图11是本发明注射剂(20150506)室温放置实验中绿原酸、连翘酯苷A的含量变化图；
图中附图标记含义：图1和图2:1-绿原酸，2-连翘酯苷A。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。
实施例1
一种金英黄归注射剂的制备方法，包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，其中，原料药的用量，按照重量份数计为：金银花80～100份、蒲公英80～100份、瓜蒌80～100份、连翘60～80份、芙蓉花40～60份、大黄20～40份、黄芪20～40份和当归10～30份。原料药中加入乙醇浸泡，随后回流提取，过滤；药渣加乙醇回流提取，过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到75％～85％，进行醇沉，在4℃下放置16～20h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液，混合液的浓度为1.00g·mL-1，再加入辅料制成注射剂。
实施例2
一种金英黄归注射剂的制备方法，包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，其中，原料药的用量，按照重量份数计为：金银花80份、蒲公英80份、瓜蒌80份、连翘60份、芙蓉花40份、大黄20份、黄芪20份和当归10份。原料药中加入60％乙醇浸泡30min，其中原料药与乙醇的料液比为1g︰15mL。随后回流提取3h，多层纱布过滤；药渣加55％乙醇回流提取1h，其中药渣与乙醇的料液比为1g︰10mL，多层纱布过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到75％，进行醇沉，在4℃下放置20h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液，混合液的浓度为1.00g·mL-1；混合液中加入浓度为0.05g·mL-1的明胶溶液至不产生沉淀为止，放置2.5h，过滤去除沉淀，在滤液中加入无水乙醇至乙醇浓度>75％，放置3h，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，残渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到药液，随后加入亚硫酸钠，亚硫酸钠的加入量为药液总质量的0.10％，调节pH值至7.0，再加入活性炭，活性炭的加入量为药液总质量的0.10％，煮沸20min，采用0.22μm的水系无菌滤膜过滤至热源处理后的容器中，得到注射剂。
实施例3
一种金英黄归注射剂的制备方法，包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，其中，原料药的用量，按照重量份数计为：金银花100份、蒲公英100份、瓜蒌100份、连翘80份、芙蓉花60份、大黄40份、黄芪40份和当归30份。原料药中加入55％乙醇浸泡30min，其中原料药与乙醇的料液比为1g︰9mL。随后回流提取2.5h，多层纱布过滤；药渣加60％乙醇回流提取2h，其中药渣与乙醇的料液比为1g︰12mL，多层纱布过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到85％，进行醇沉，在4℃下放置18h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液，混合液的浓度为1.00g·mL-1；混合液中加入浓度为0.08g·mL-1的明胶溶液至不产生沉淀为止，放置3h，过滤去除沉淀，在滤液中加入无水乙醇至乙醇浓度>75％，放置2.5h，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，残渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到药液，随后加入亚硫酸钠，亚硫酸钠的加入量为药液总质量的0.20％，调节pH值至7.5，再加入活性炭，活性炭的加入量为药液总质量的0.20％，煮沸30min，采用0.22μm的水系无菌滤膜过滤至热源处理后的容器中，得到注射剂。
实施例4
一种金英黄归注射剂的制备方法，包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，其中，原料药的用量，按照重量份数计为：金银花90份、蒲公英90份、瓜蒌90份、连翘70份、芙蓉花50份、大黄30份、黄芪30份和当归20份。原料药中加入50％乙醇浸泡30min，其中原料药与乙醇的料液比为1g︰10mL。随后回流提取2h，多层纱布过滤；药渣加50％乙醇回流提取1.5h，其中药渣与乙醇的料液比为1g︰8mL，多层纱布过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到80％，进行醇沉，在4℃下放置16h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液，混合液的浓度为1.00g·mL-1；混合液中加入浓度为0.10g·mL-1的明胶溶液至不产生沉淀为止，放置2h，过滤去除沉淀，在滤液中加入无水乙醇至乙醇浓度>75％，放置2h，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，残渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到药液，随后加入亚硫酸钠，亚硫酸钠的加入量为药液总质量的0.15％，调节pH值至7.2，再加入活性炭，活性炭的加入量为药液总质量的0.50％，煮沸15min，采用0.22μm的水系无菌滤膜过滤至热源处理后的容器中，得到注射剂。
实施例5
一种金英黄归注射剂的制备方法，包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，其中，原料药的用量，按照重量份数计为：金银花85份、蒲公英95份、瓜蒌90份、连翘75份、芙蓉花55份、大黄25份、黄芪30份和当归10份。原料药中加入58％乙醇浸泡30min，其中原料药与乙醇的料液比为1g︰11mL。随后回流提取2.2h，多层纱布过滤；药渣加55％乙醇回流提取1.6h，其中药渣与乙醇的料液比为1g︰9mL，多层纱布过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到82％，进行醇沉，在4℃下放置17h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液，混合液的浓度为1.00g·mL-1；混合液中加入浓度为0.05g·mL-1的明胶溶液至不产生沉淀为止，放置2.6h，过滤去除沉淀，在滤液中加入无水乙醇至乙醇浓度>75％，放置2.5h，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，残渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到药液，随后加入亚硫酸钠，亚硫酸钠的加入量为药液总质量的0.16％，调节pH值至7.4，再加入活性炭，活性炭的加入量为药液总质量的0.40％，煮沸25min，采用0.22μm的水系无菌滤膜过滤至热源处理后的容器中，得到注射剂。
实施例6
一种金英黄归注射剂的制备方法，包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，其中，原料药的用量，按照重量份数计为：金银花96份、蒲公英82份、瓜蒌88份、连翘65份、芙蓉花45份、大黄35份、黄芪22份和当归15份。原料药中加入55％乙醇浸泡30min，其中原料药与乙醇的料液比为1g︰12mL。随后回流提取2.8h，多层纱布过滤；药渣加50％乙醇回流提取1.1h，其中药渣与乙醇的料液比为1g︰11mL，多层纱布过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到77％，进行醇沉，在4℃下放置19h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液，混合液的浓度为1.00g·mL-1；混合液中加入浓度为0.05g·mL-1的明胶溶液至不产生沉淀为止，放置2.3h，过滤去除沉淀，在滤液中加入无水乙醇至乙醇浓度>75％，放置3h，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，残渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到药液，随后加入亚硫酸钠，亚硫酸钠的加入量为药液总质量的0.12％，调节pH值至7.3，再加入活性炭，活性炭的加入量为药液总质量的0.30％，煮沸18min，采用0.22μm的水系无菌滤膜过滤至热源处理后的容器中，得到注射剂。

Claims (10)

1.一种金英黄归注射剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，原料药中加入乙醇浸泡，随后回流提取，过滤；药渣加乙醇回流提取，过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到75％～85％，进行醇沉，在4℃下放置16～20h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液，再加入辅料制成注射剂。
2.根据权利要求1所述的金英黄归注射剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，原料药中加入50％～60％乙醇浸泡25～35min，随后回流提取2～3h，多层纱布过滤；药渣加50％～60％乙醇回流提取1～2h，多层纱布过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到75％～85％，进行醇沉，在4℃下放置16～20h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液；混合液中加入明胶溶液至不产生沉淀为止，放置2～3h，过滤去除沉淀，在滤液中加入无水乙醇至乙醇浓度>75％，放置2～3h，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，残渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到药液，随后加入亚硫酸钠，调节pH值至7.0～7.5，再加入活性炭，煮沸15～30min，采用0.22μm的水系无菌滤膜过滤至热源处理后的容器中，得到注射剂。
3.根据权利要求2所述的金英黄归注射剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：按量称取原料药金银花、蒲公英、瓜蒌、连翘、芙蓉花、大黄、黄芪和当归，原料药中加入50％乙醇浸泡30min，随后回流提取2h，多层纱布过滤；药渣加50％乙醇回流提取1.5h，多层纱布过滤；合并滤液，蒸发至无醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入无水乙醇至乙醇浓度达到80％，进行醇沉，在4℃下放置16h，过滤，回收滤液；取药渣按照上述步骤进行第二次醇沉，过滤，合并两次滤液，蒸发乙醇至无醇味，随后加入注射用水，制备得到混合液；混合液中加入明胶溶液至不产生沉淀为止，放置2h，过滤去除沉淀，在滤液中加入无水乙醇至乙醇浓度>75％，放置2h，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，残渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到药液，随后加入亚硫酸钠，调节pH值至7.2，再加入活性炭，煮沸15min，采用0.22μm的水系无菌滤膜过滤至热源处理后的容器中，得到注射剂。
4.根据权利要求1～3任一项所述的金英黄归注射剂的制备方法，其特征在于：原料药中加入乙醇浸泡，原料药与乙醇的料液比为1g︰9～15mL。
5.根据权利要求1～3任一项所述的金英黄归注射剂的制备方法，其特征在于：药渣加乙醇回流提取，药渣与乙醇的料液比为1g︰8～12mL。
6.根据权利要求1～3任一项所述的金英黄归注射剂的制备方法，其特征在于：所述混合液的浓度为1.00g·mL-1。
7.根据权利要求2或3所述的金英黄归注射剂的制备方法，其特征在于：所述明胶溶液的浓度为0.05～0.10g·mL-1。
8.根据权利要求2或3所述的金英黄归注射剂的制备方法，其特征在于：所述亚硫酸钠的加入量为药液总质量的0.10％～0.20％。
9.根据权利要求2或3所述的金英黄归注射剂的制备方法，其特征在于：所述活性炭的加入量为药液总质量的0.10％～0.50％。
10.根据权利要求1～3任一项所述的金英黄归注射剂的制备方法，其特征在于：所述原料药的用量，按照重量份数计为：金银花80～100份、蒲公英80～100份、瓜蒌80～100份、连翘60～80份、芙蓉花40～60份、大黄20～40份、黄芪20～40份和当归10～30份。
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