CN102707009A - 一种黄连上清丸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黄连上清丸的检测方法，包括鉴别和含量测定，其中包括大黄的鉴别以及黄连、黄芩的分开鉴别。特别是大黄的鉴别在原方法的基础上增加了残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，置水浴上加热30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液的改进方法。水解萃取后，减少了干扰，可以鉴别到更多有效成分。本发明的测定方法提高了药品含量标准的可控性，确保了产品的内在含量，对促进产品销售、增加产品的市场竞争力、保证患者用药安全意义重大。

Description

一种黄连上清丸的检测方法

技术领域

本发明属于中药制剂技术领域，涉及中成药的质量检测方法，更具体地说是一种黄连上清丸的检测方法。

背景技术

长期以来，人们一直认为中药是安全、有效、无毒的。有些中药药品广告也往往片面或夸大宣传疗效，而对其毒副作用及可能发生的不良反应避而不提或避重就轻，且常以“本品系纯 天然药物，无毒副作用”误导患者；而患者在用药时也往往忽视中药的用法用量及其毒性，形成了认识的误区。正是由于人们对中药安全性问题存在片面认识，中药的毒副作用往往容易被忽视，在中药“有病治病、无病健身”的观念下，长期、过量或者不恰当使用中药情况时有发生，必然会引发中药安全性问题。应该说凡是药品,均需具有安全性、有效性和质量可控性三个基本特性。这三个特性既相互关联,又相互制约。药品的安全,关系着患者的生命安全，具有特定的功效,是药品的重要基础;同时药品质量可控,才能达到有效控制药品的安全和有效。

中药是在传统的中医理论指导下发展起来的，原料多是草根、树皮、矿物、动物等天然材料，来源广泛，成分复杂。中药和西医相比，中药含量控制确实难度更大，因为中药里面的成分十分复杂，生长地点不同、气候变化不同，都有可能导致中药成分的变化，因此，完善、提高中药的含量标准更加成为了我国迫在眉睫的事情了。

黄连上清丸是一种传统的中药制剂，主要用于清热通便，散风止痛。用于上焦风热，头晕脑胀，牙龈肿痛，口舌生疮，咽喉红肿，耳痛耳鸣，暴发火眼，大便干燥，小便黄赤的治疗。它是由黄连、姜制栀子、连翘、炒蔓荆子、防风、荆芥穗、白芷、黄芩、菊花、薄荷、酒大黄、酒炒黄柏、桔梗、川芎、石膏、旋覆花、甘草组成。处方中黄连、黄芩、黄柏、石膏清热泻火，燥湿解毒；栀子、大黄清热凉血解毒并可引热毒从二便而出，共为君药。连翘、菊花、荆芥穗、白芷、蔓荆子、川芎、防风、薄荷疏散风热，共为臣药。旋复花下气行水，桔梗清热利喉排脓，载药上行，为佐药。甘草清热解毒，调和诸药，为使药。诸药合用，扩散风清热，泻火止痛，上通下行，使火热随之而解。由于是多味中药组成的复方中成药，所含成分就更为复杂，在复方配伍和制备中有些化学成分还会互相影响，含量发生较大变化。目前，黄连上清丸药典上规定的检测主要有药材的鉴别、重金属检查、含量测定等项目。其中在药材的鉴别中对于黄芩、黄连的鉴别是同时进行的，其方法是：取黄连对照药材0.03g、黄芩对照药材0.2g,分别加甲醇3ml,超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取[鉴别]（1）项下的供试品溶液及上述对照药材溶液各3~5μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10:7:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与黄连对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；再喷以2%酸性三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与黄芩对照药材色谱相应的位置上显相同颜色主斑点。但处方中黄连、黄芩处方量相差较大，相差较大，若点样量小，看不出黄芩，增大点样量至黄芩斑点清晰可见时则黄连斑点模糊成团，看不清楚。因此点样量难以控制，效果不好。再有大黄的鉴别，处方中大黄参照中国药典2010年版一部“黄连上清丸”鉴别项下的方法进行试验：取本品2g，研细，加甲醇10ml，超声处理20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。原药典方法需用10cm×20cm的薄层板和展开缸，缺点是展开时间较长，约2小时，且展开后斑点分离效果不佳。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种新的黄连上清丸的检测方法。为实现此目的本发明公开了如下的技术内容：

一种黄连上清丸的检测方法，它是由黄连10g、姜制栀子80g、连翘80g、炒蔓荆子80g、防风40g、荆芥穗80g、白芷80g、黄芩80g、菊花160g、薄荷40g、酒大黄320g、酒炒黄柏40g、桔梗80g、川芎40g、石膏、40g、旋覆花20g、甘草40g组成，其检测方法包括鉴别、检查、含量测定，其特征在于：

一、大黄的鉴别按如下的方法进行：

1）供试品溶液的制备：取本品3g，研细，加甲醇10ml，超声处理20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，置水浴上加热30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；（原方法：取本品2g，研细，加甲醇10ml，超声处理20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。）

2）对照药材溶液的制备：取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，同供试品方法制成对照药材溶液；（原方法：取大黄对照药材0.5g，加甲醇3ml，超声处理10分钟，取上清液作为对照药材溶液。）新方法的优点在于：水解萃取后，减少干扰，展开后斑点清晰。

3）阴性对照液的制备  按处方和工艺制备不含黄连和黄柏的样品，按供试品制备法制备；

4）照薄层色谱法：吸取对照药材溶液2ul，供试品溶液和阴性对照液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比环己烷-乙酸乙酯-甲酸12：3：0.2为展开剂，展至6cm，取出，晾干，再置同一展开剂中展开8~9cm，取出，晾干；供试品按上述方法鉴别，365nm紫外光灯下检视。

二、黄连、黄芩分开鉴别

（1）黄芩的鉴别

1）供试品溶液的制备：取本品水蜜丸3g，研细，甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液低温蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

2）对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材0.2g，加甲醇3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液；

3）阴性对照液制备：按照工艺和处方制备不含黄芩的样品，取该样品按照供试品溶液制备方法制备；

4）照薄层色谱法：吸取上述三种溶液各1~2ul，分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以乙酸为展开剂 ，展开，取出，晾干；供试品按上述方法鉴别，喷以1%三氯化铁乙醇溶液；

（2）黄连的鉴别

1）供试品溶液的制备：取本品水蜜丸3g，研细，甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液低温蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

2）对照药材溶液的制备：取黄连对照药材0.03g，加甲醇3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液；

3）阴性对照液制备：按照工艺和处方制备不含黄连的样品，取该样品，加甲醇3ml，超声处理10min，取上清液作为黄连阴性样品溶液；

4）照薄层色谱法：吸取上述三种溶液各3~5μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以体积比为10：7：1：1的乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水为展开剂 ，展开，取出，晾干；供试品按上述方法鉴别，365nm紫外光灯下检视；

本发明同时还公开了盐酸小檗碱的含量测定，它是按如下的方法进行：

（1）对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20μg、的溶液，即得；

（2）供试品溶液的制备：取本品适量，研碎，取0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积比为1：100的盐酸-甲醇混合溶液10ml，密塞，称定重量，置50℃水浴中加热15分钟，取出，放冷，回流45分钟，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，迅速滤过，精密量取续滤液2ml，转移至100~200目，8g，内径为1cm碱性氧化铝柱上，用甲醇35ml洗脱，收集洗脱液，50℃蒸干，残渣用甲醇适量使溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

原方法多一步：低温挥干，残渣用甲醇适量使溶解，改进后的优点：较少步骤，并不影响效果，提高了效率

原方法为2ml，现在改变为5ml，其优点：操作更简便，更易洗涤，定量更准确。

（3）阴性对照液的制备：按处方和工艺制备不含黄连和黄柏的样品，按供试品制备法制备。

（4）色谱条件的确定：

色谱柱：Phenomenex  LUNA 5μ, C18(2), 250×4.6mm

流动相：乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾溶液，体积比为30：70

检测波长：424nm

柱温：30℃

流速：1ml/min；

理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算为9802，与相邻峰的分离度为3.01，本品每1g含黄连、黄柏以盐酸小檗碱（C₂₀H₁₇NO₄·HCl）计，不得少于0.19mg。

本发明更加详细的检测方法如下：

一、黄连、黄芩分开鉴别

黄芩的鉴别

供试品溶液的制备：取本品水蜜丸3g，研细，甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液低温蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材0.2g，加甲醇3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液。

阴性对照液制备：按照工艺和处方制备不含黄芩的样品，取该样品按照供试品溶液制备方法制备。

照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各1~2ul，分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以乙酸为展开剂 ，展开，取出，晾干。

供试品按上述方法鉴别。喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性显示无干扰，见图1。

黄连的鉴别

供试品溶液的制备：取本品水蜜丸3g，研细，甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液低温蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取黄连对照药材0.03g，加甲醇3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液。

阴性对照液制备：按照工艺和处方制备不含黄连的样品，取该样品，加甲醇3ml，超声处理10min，取上清液作为黄连阴性样品溶液。

照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验 ，吸取上述三种溶液各3~5μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10：7：1：1）为展开剂 ，展开，取出，晾干。

供试品按上述方法鉴别。紫外光灯(365nm) 下检视。供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点，且阴性显示无干扰。见图2。原药典方法中黄连、黄芩在同一薄层板中检验，分两次显色，见图3、图4，试验结果发现：

1、黄芩阴性色谱图中与对照药材相应位置存在干扰，见图4。

2、样品中黄连、黄芩斑点浓度相差较大，增大点样量至黄芩斑点清晰可见时，黄连斑点过大，见图3。故将两者分开鉴别，并对黄芩鉴别中的薄层板及展开剂进行了调整。

二、大黄鉴别中供试品及对照药材的制备方法

供试品溶液的制备：取本品3g，研细，加甲醇10ml，超声处理20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，置水浴上加热30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，同法制成对照药材溶液。

阴性对照液制备：按照工艺和处方制备不含大黄的样品，取该样品按照供试品溶液制备方法制备。

照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验 ，吸取对照药材溶液2ul，供试品溶液和阴性对照液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（12：3：0.2）为展开剂，展至约6cm，取出，晾干，再置同一展开剂中展开8~9cm，取出，晾干。

供试品按上述方法鉴别。紫外光灯(365nm) 下检视。供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同的黄色荧光主斑点，且阴性显示无干扰，见图5。 

新方法中供试品及对照药材的前处理方法采用水解萃取，此方法更加简便省时，水解萃取后，能减少干扰，使分离效果更佳。原方法大黄鉴别见图6。

本发明公开的黄连上清丸的检测方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）大黄鉴别中，展开过程节省时间。特别是增加了水解萃取后能有效地减少了杂质的干扰，斑点分离效果更好。

（3）黄连、黄芩分开鉴别便于控制点样量，操作简便，分离效果更好。

附图说明：

图1为黄芩新方法的检测结果；从左到右以此为：黄芩对照药材；样品（中间四个）；阴性；

图2 为黄连新方法的检测结果；其中1~3样品；4黄连对照药材；5阴性；

图3为黄连原方法；其中1 黄连对照药材；2黄芩对照药材；3样品；4阴性；

图4为黄芩原方法；其中1 黄连对照药材；2黄芩对照药材；3样品；4阴性；

图5为大黄新方法；其中1~4样品；5对照药材；6阴性；                      

图6为大黄原方法；其中1对照药材；2样品；3阴性。     

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定,其中所用到的药材均有市售。

实施例1

黄连上清丸组成及制备：

组成：黄连10g、姜制栀子80g、连翘80g、炒蔓荆子80g、防风40g、荆芥穗80g、白芷80g、黄芩80g、菊花160g、薄荷40g、酒大黄320g、酒炒黄柏40g、桔梗80g、川芎40g、石膏、40g、旋覆花20g、甘草40g。

制备方法：

以上十七味，粉碎成细粉，过筛，混匀。用水制丸，干燥，制成水丸；或每100g粉末用炼蜜30~40g加适量的水制丸，干燥，制成水蜜丸；或每100g粉末加炼蜜150~170g制成大蜜丸，即得。

实施例2

大黄的鉴别：

1）供试品溶液的制备：取本品3g，研细，加甲醇10ml，超声处理20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，置水浴上加热30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；

2）对照药材溶液的制备：取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，同供试品方法制成对照药材溶液；

3）阴性对照液的制备  按处方和工艺制备不含黄连和黄柏的样品，按供试品制备法制备；

4）照薄层色谱法：吸取对照药材溶液2ul，供试品溶液和阴性对照液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比环己烷-乙酸乙酯-甲酸12：3：0.2为展开剂，展至6cm，取出，晾干，再置同一展开剂中展开8cm，取出，晾干；供试品按上述方法鉴别，365nm紫外光灯下检视；

二、黄连、黄芩分开鉴别

（1）黄芩的鉴别

1）供试品溶液的制备：取本品水蜜丸3g，研细，甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液低温蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

2）对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材0.2g，加甲醇3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液；

3）阴性对照液制备：按照工艺和处方制备不含黄芩的样品，取该样品按照供试品溶液制备方法制备；

4）照薄层色谱法：吸取上述三种溶液各2ul，分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以乙酸为展开剂,展开，取出，晾干；供试品按上述方法鉴别，喷以1%三氯化铁乙醇溶液；

（2）黄连的鉴别

1）供试品溶液的制备：取本品水蜜丸3g，研细，甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液低温蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

2）对照药材溶液的制备：取黄连对照药材0.03g，加甲醇3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液；

3）阴性对照液制备：按照工艺和处方制备不含黄连的样品，取该样品，加甲醇3ml，超声处理10min，取上清液作为黄连阴性样品溶液；

4）照薄层色谱法：吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以体积比为10：7：1：1的乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水为展开剂,展开，取出，晾干；供试品按上述方法鉴别，365nm紫外光灯下检视。

实施例3

盐酸小檗碱的含量测定：

（1）对照品溶液的制备：  取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20μg、的溶液，即得；

（2）供试品溶液的制备：  取本品适量，研碎，取0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积比为1：100的盐酸-甲醇混合溶液10ml，密塞，称定重量，置50℃水浴中加热15分钟，取出，放冷，回流45分钟，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，迅速滤过，精密量取续滤液2ml，转移至200目，8g，内径为1cm碱性氧化铝柱上，用甲醇35ml洗脱，收集洗脱液，50℃蒸干，残渣用甲醇适量使溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

（3）阴性对照液的制备  按处方和工艺制备不含黄连和黄柏的样品，按供试品制备法制备。

（4）色谱条件的确定：

色谱柱：Phenomenex  LUNA 5μ, C18(2), 250×4.6mm

流动相：乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾溶液，体积比为30：70

检测波长：424nm

柱温：30℃

流速：1ml/min；

理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算为9802，与相邻峰的分离度为3.01，本品每1g含黄连、黄柏以盐酸小檗碱（C₂₀H₁₇NO₄·HCl）计，不得少于0.19mg。

Claims (1)

1. 一种黄连上清丸的检测方法，它是由黄连10g、姜制栀子80g、连翘80g、炒蔓荆子80g、防风40g、荆芥穗80g、白芷80g、黄芩80g、菊花160g、薄荷40g、酒大黄320g、酒炒黄柏40g、桔梗80g、川芎40g、石膏、40g、旋覆花20g、甘草40g组成，其检测方法包括鉴别和含量测定，其特征在于：

一、大黄的鉴别按如下的方法进行：

1）供试品溶液的制备：取本品3g，研细，加甲醇10ml，超声处理20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，置水浴上加热30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液

2）对照药材溶液的制备：取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，同供试品方法制成对照药材溶液；

3）阴性对照液的制备  按处方和工艺制备不含黄连和黄柏的样品，按供试品制备法制备；

4）照薄层色谱法：吸取对照药材溶液2ul，供试品溶液和阴性对照液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比环己烷-乙酸乙酯-甲酸12：3：0.2为展开剂，展至6cm，取出，晾干，再置同一展开剂中展开8~9cm，取出，晾干；供试品按上述方法鉴别，365nm紫外光灯下检视；

二、黄连、黄芩分开鉴别：

（1）黄芩的鉴别：

1）供试品溶液的制备：取本品水蜜丸3g，研细，甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液低温蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

2）对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材0.2g，加甲醇3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液；

3）阴性对照液制备：按照工艺和处方制备不含黄芩的样品，取该样品按照供试品溶液制备方法制备；

4）照薄层色谱法：吸取上述三种溶液各1~2ul，分别点于同一聚酰胺薄膜板上，以乙酸为展开剂 ，展开，取出，晾干；供试品按上述方法鉴别，喷以1%三氯化铁乙醇溶液；

（2）黄连的鉴别：

1）供试品溶液的制备：取本品水蜜丸3g，研细，甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液低温蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

2）对照药材溶液的制备：取黄连对照药材0.03g，加甲醇3ml，超声处理10分钟，上清液作为对照药材溶液；

3）阴性对照液制备：按照工艺和处方制备不含黄连的样品，取该样品，加甲醇3ml，超声处理10min，取上清液作为黄连阴性样品溶液；

4）照薄层色谱法：吸取上述三种溶液各3~5μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以体积比为10：7：1：1的乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水为展开剂 ，展开，取出，晾干；供试品按上述方法鉴别，365nm紫外光灯下检视。

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