CN111218416A - 一种复合菌发酵菌剂、组合物、发酵方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种复合菌发酵菌剂、组合物、发酵方法及其应用，一种复合菌发酵菌剂主要成分是嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、酿酒酵母，所述的嗜酸乳杆菌、粪肠球菌以及酿酒酵母的菌种按质量比为0.5～2：6～8：0.5～1比例混合；所述粪肠球菌为粪肠球菌菌粉，自行制备并保藏成活，所述酿酒酵母为酿酒酵母菌粉，自行制备并保藏成活，与提前筛选的嗜酸乳杆菌商品菌以及载体按照质量比混合即为本发明的一种复合发酵菌剂，菌剂发酵简单，通过进行临床试验，初步确定该复合发酵菌是一款能够提供甲壳类水产养殖塘口的环境友好型生态水质改良剂。

Description

一种复合菌发酵菌剂、组合物、发酵方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物复合发酵领域，具体涉及微生物混合发酵菌株组方筛选及其在甲壳类水产养殖上的应用。

背景技术

近年来，随着民众对健康饮食的理念逐年提升，水产类食品越来越受到青睐，其中甲壳类水产品的养殖规模的逐年提升，高密度以及集约化的养殖模式也逐步在养殖团体中推广开来，随之而来的是高蛋白的饲料投入，这些到高蛋白的饲料残留以及养殖对象的排泄物大量积聚于水体中，超过了天然水体的自净能力，随之而来的就是大量高蛋白、高脂肪有机质大量积聚于养殖水体底部，一方面是养殖水体底部“氧债”的“罪魁祸首”，同时它们在水底部不完全分解产生大量的氨氮、亚硝酸盐、活性氧自由基等致使养殖对象缺氧以及中毒死亡的时间频频发生，给养殖户带来极大的经济损失。

此外，生活污水排放、畜牧业污水排放以及养殖过程抗生素、功能性杀虫剂、消毒剂等不合理用药进一步加剧了自然水体环境的恶化。水环境的恶化一方面导致养殖对象中毒死亡，给养殖户带来极大的经济损失；另一方面恶化的水环境养殖出来的水产产品常常处于亚健康状态，体内可能存在的药残、重金属残留等也会成为人们潜在的健康杀手。根据农业部颁布的《渔业用水水质标准》，养殖水体中的氨不高于0.02mg/L。

发明内容

本发明的第一个目的，旨在提供一种能够在甲壳类养殖水体中大量提供抑制有害病原微生物的生长繁殖，减少养殖水体中高蛋白、高脂肪有机质残留，进而减少养殖水体氨氮的产生，同时在分解有机质的过程中将营养物质反哺水体，提供浮游生物生长繁殖所需的营养物质，为养殖对象的苗种提供饵料的一种微生物复合发酵菌剂。

一种复合菌发酵菌剂，主要成分是嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、酿酒酵母，所述的嗜酸乳杆菌、粪肠球菌以及酿酒酵母的菌种按质量比为0.5～2：6～8：0.5～1比例混合。优选地，所述粪肠球菌为粪肠球菌菌粉，通过如下方法制备：将粪肠球菌菌种从斜面接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下恒温摇床120r/min培养36h时获取种子液，随即将种子液直接接种于事先高温灭菌完成的常温液体发酵培养基中，接种比例1.5％，密闭厌氧发酵，发酵温度37℃，搅拌转速120r/min，间断性搅拌，间断时间12h，发酵36h后得到的发酵液与事先灭菌完毕的第一半固态培养基中按照比重1:0.3至1:0.5混合均匀后进行37℃发酵48h，发酵后的物料放置于人工流化床系统进行37℃恒温干燥，干燥后低温粉碎得到的活菌数在5×109～8×109cfu/g之间的粪肠球菌菌粉。

优选地，所述第一半固态培养基为次粉和统糠1:1物料比混合物。

优选地，所述酿酒酵母为酿酒酵母菌粉，通过如下方法制备：将酿酒酵母菌种从斜面接种至YPDA培养基中，在28℃条件下150r/min摇床培养24h获取种子液，随即将种子液直接接种于事先高温灭菌完成的常温液体培养基中密闭发酵36h后直接接种于事先已经高温灭菌的第二半固态培养基中混合发酵72h后放置于人工流化床系统进行37℃恒温干燥，干燥后低温粉碎得到6.0×109～8.0×109cfu/g之间的酿酒酵母菌菌粉。

优选地，所述第二半固态培养基为麸皮：糖蜜：统糠＝3：1：6，料水比1：0.4混合。

本发明的第二个目的，提供上述一种复合菌发酵菌剂的组合物及其发酵方法。

一种复合菌发酵菌剂组合物，包括所述复合菌发酵菌剂和发酵培养基，所述发酵培养基通过如下方法制备：

发酵剂营养液的制备：将氯化钠10g、尿素5g、硫酸亚铁0.2g、磷酸二氢钾0.35g、硫酸镁0.18、硫酸锰0.05g、酵母硒0.5g、氯化钙20与0.2L自来水中加热完全溶解并与市售的氨基酸营养液0.8L完全混合，用氢氧化钠与盐酸调节pH值至6～7之间灭菌备用；

营养碳源的制备：糖蜜、发酵剂营养液以及统糠按照2～3：1～3：2～7比例进行逐级混合，混合均匀后流化床高温烘干粉碎；

将植物氮源、骨粉、营养碳源以及次粉按照1～3：1～3：5～10：84～93比例均匀混合即为发酵培养基。

一种复合菌发酵菌剂的发酵方法，在可遮光可密闭的容器内，将复合菌发酵菌剂：发酵培养基(培养基可根据养殖对象实际情况进行调整)：阳光暴晒的自来水或者地下水按照 1:4～8:100的比例进行均匀混合后密闭发酵。

一种复合菌发酵菌剂的发酵方法，发酵环境温度15～45℃，发酵pH值3.6～4.8，发酵液最高菌含量1.5×10¹⁰cfu/ml。具体可以选择在室内或养殖塘口(夏季高温期间需要避免阳光直接照射)作为发酵地点，发酵时间随环境温度的变化灵活调整，夏秋两季发酵36～48小时，春冬两季发酵3～5天。

本发明的第三个目的，提供上述一种复合菌发酵菌剂在水产养殖上的应用。

一种复合菌发酵菌剂的应用，所述一种复合菌发酵菌剂应用于甲壳类水产品。

优选地，所述一种复合菌发酵菌剂应用于河蟹、小龙虾养殖。

本发明的有益效果包括：

1)发酵简单，该发酵剂使用方式极为便利，摒弃了长期以来的发酵罐发酵模式，仅仅需较为洁净的可遮光可密闭的容器，对容器的材质不做要求；发酵地点可以是室内也可是养殖塘口，夏秋两季发酵36～48小时即可，春冬两季室内发酵3～5天即可。

2)该方案已经在甲壳类水产品的养殖塘口进行临床试验，初步确定该复合发酵菌是一款能够提供甲壳类水产养殖塘口的环境友好型生态水质改良剂，旨在通过向养殖水体提供大量有益微生物及有机酸代谢产物，矿物元素、小分子蛋白、氨基酸等营养物质，通过分解养殖水体中残留的饵料及粪便、中和水体重金属残留、重金属农药残留；定期使用可以维持养殖水体生态系统稳定性，增强水体抗应激性并通过培养养殖水体浮游动物及浮游生物量进而间接降低并维持养殖水体氨氮含量在一个较低的范围内。

附图说明

图1应用实施例1实验组与对照组养殖水体浮游动物对照；

图2应用实施例1实验组与对照组养殖水体浮游植物对照；

图3应用实施例1复合菌添加对养殖水体氨氮的影响曲线；

图4应用实施例2雌蟹增长情况；

图5应用实施例2雄蟹增重图。

具体实施方式

以下对本发明作的实施例进行详细的说明，以便于本领域技术人员理解本发明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

该菌剂分别在2017～2018年的湖南益阳南县的临床实验基地、浙江宁波河蟹养殖基地上进行试用显示出较强的提高水产动物存活率和产量的能力，在降解水体氨氮、亚硝酸盐以及提高小龙虾养殖水体浮游动物及浮游生物含量上也有明显的效果，具备较强的工业化开发和推广应用的价值。

实施例1

一种复合菌发酵菌剂的制备方法包括以下步骤：

粪肠球菌菌粉制备：将粪肠球菌菌种从斜面接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下恒温摇床120r/min培养36h时获取种子液，随即将种子液直接接种于事先高温灭菌完成的常温液体发酵培养基中，接种比例1.5％，密闭厌氧发酵，发酵温度37℃，搅拌转速120r/min，间断性搅拌，间断时间12h，发酵36h后得到的发酵液与事先灭菌完毕的半固态培养基中(次粉和统糠1:1)物料比混合物按照比重1:0.3～1:0.5混合均匀后进行37℃发酵48h，发酵后的物料放置于人工流化床系统进行37℃恒温干燥，干燥后低温粉碎得到的活菌数在5×109～8× 109cfu/g之间的粪肠球菌菌粉；

酿酒酵母菌粉制备：将酿酒酵母菌种从斜面接种至YPDA培养基中，在28℃条件下150r/min摇床培养24h获取种子液，随即将种子液直接接种于事先高温灭菌完成的常温液体培养基中密闭发酵36h后直接接种于事先已经高温灭菌的半固态培养基中(麸皮：糖蜜：统糠＝3：1：6，料水比1:0.4，)混合发酵72h后放置于人工流化床系统进行37℃恒温干燥，干燥后低温粉碎得到6.0×109～8.0×109cfu/g之间的酿酒酵母菌菌粉；

将制备好的粪肠球菌、酿酒酵母与提前筛选的嗜酸乳杆菌商品菌以及载体按照质量比为 0.5～2：6～8：0.5～1混合即为本发明的一种复合发酵菌剂；

所制备的粪肠球菌和酿酒酵母菌已保藏，所述的粪肠球菌菌分类命名为Enterococcus faecalis CDW-01，保藏日期为2020.1.10，保藏单位为CCTCC：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉，保藏中心编号为CCTCC M 2020032 CDW-01；所述的酿酒酵母分类命名为Saccharomyces cerevisiae CDW-02，保藏日期为2020.1.10，保藏单位为CCTCC：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉，保藏中心编号为CCTCC M2020033。

一种复合菌发酵菌剂与专用的发酵培养基组合出售，所述发酵培养基的制备方法包括以下步骤：

发酵剂营养液的制备：将氯化钠10g、尿素5g、硫酸亚铁0.2g、磷酸二氢钾0.35g、硫酸镁0.18、硫酸锰0.05g、酵母硒0.5g、氯化钙20与0.2L自来水中加热完全溶解并与市售的氨基酸营养液0.8L完全混合，用氢氧化钠与盐酸调节pH值至6～7之间灭菌备用；

营养碳源的制备：糖蜜、发酵剂营养液以及统糠按照2～3：1～3：2～7比例进行逐级混合，混合均匀后流化床高温烘干粉碎；

将植物氮源、骨粉、营养碳源以及次粉按照1～3：1～3：5～10：84～93比例均匀混合即为发酵培养基。

将本发明的一种复合菌发酵菌剂与专用的发酵培养基按照1:4～8比例进行组合使用，独立包装1kg菌剂和独立包装4kg培养基作为一组作为商品进行出售，使用者直接采用事先洁净可密闭容器用定量洁净自来水或者地下水将菌剂、培养基充分溶解，密闭自行发酵后即可直接泼洒或者混合饲料投喂，具体使用方法如下：

使用洁净的可遮光可密闭的容器，对容器的材质不做要求，将复合发酵菌剂：发酵培养基：阳光暴晒的自来水或者地下水按照1:4～8:100的比例进行均匀混合后密闭即可，发酵地点可以是室内也可是养殖塘口，夏秋两季发酵36～48小时即可，春冬两季室内发酵3～5天即可，发酵初期有明显的酒香味并伴随剧烈的气体释放，发酵后去气体释放减弱直至消失，发酵成功后的发酵液带有明显的乳香，发酵pH值3.6～4.8，实验基地模拟临床发酵的发酵液最高菌含量1.5×1010cfu/ml。

应用实施例1

复合菌发酵剂在小龙虾养殖上的应用：

2017年4月中旬在湖南益阳南县一小龙虾养殖场，选取四个养殖塘口做该发酵菌剂的临床对比试验，其中实验塘口2个、对照塘口2个，水域面积均为30亩，环沟水深1.5米，浅水区0.4米，龙虾养殖密度均为200kg/亩，30％蛋白含量龙虾料：黄豆按照8:2比例根据龙虾养殖密度的5％投喂。实验时，对照组养殖塘口定期泼洒复合发酵菌剂现场发酵的新鲜发酵液 (复合菌剂：培养基：地下水＝1:4:100)，通用使用量2kg/亩，对照组塘口不投该发酵液。实验开始时间2017年4月16日上午九点初次使用本发酵液，定点投料时间下午4点，实验截止时间为2017年10月。实验组塘口投放发酵液的时间分别为4月16号、4月28号、5月 18号、6月2号、6月27号、7月20号、8月19号、9月11号、10月18号。试验周期为6 个月，期间自投料第一天起，定期观察水色、取水样检查对照组与实验组水体透明度、氨氮、溶氧、亚硝酸盐、酸碱度以及浮游生物量。

实验结果如附图1～3及表1所示，实验结果表明：实验组养殖塘口水体酸碱度相对稳定，氨氮、亚硝酸盐含量明显下降，在突发应激天气情况下，溶氧有轻微变化外，各种理化指标基本在《渔业用水水质标准》可控范围，且浮游动物与浮游植物的含量有明显的提高并与投放复合菌剂发酵液的量呈正相关。

表1—实验塘口与对照塘口水质指标(上午9时检测结果)

应用实施例2

复合菌发酵剂在河蟹养殖上的应用：

2017年5月中旬，浙江宁波某河蟹养殖合作社，总养殖水域面积2000亩，苗种60～120 只/斤，放苗量900～120只/亩，实验开始前河蟹平均重量8钱左右(40g)。随机挑选21个5 亩左右的小塘口进行实验，其中编注A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1为空白组，投料不做任何处理，A2、B2、C2、D2、E2、F2、G2为实验组1，A3、B3、C3、D3、E3、F3、G3 为实验组2，复合菌发酵剂塘口临时发酵的发酵液1kg拌料40kg投喂蟹池，实验组1、实验组2每天上午7点～8点、下午4点～5点准点投喂。3个月以后分别对对照组、实验组进行捕捞称重。3个月后可明显发现实验组的塘口所捕捞的螃蟹体重普遍高于空白组。雌蟹增重上：实验组的雌蟹分别比空白组的雌蟹平均增重3.97g和3.37g，而对于雄蟹方面：实验组分别比空白组体总增加7.97g和15.14g，实验结果如附图4～5所示。

以上实施例仅用于说明本发明的具体实施方式，而不是用于限定本发明，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明所要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种复合菌发酵菌剂，其特征在于，主要成分是嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、酿酒酵母，所述的嗜酸乳杆菌、粪肠球菌以及酿酒酵母的菌种按质量比为0.5～2：6～8：0.5～1比例混合。

2.根据权利要求1一种复合菌发酵菌剂，其特征在于，所述粪肠球菌为粪肠球菌菌粉，通过如下方法制备：将粪肠球菌菌种从斜面接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下恒温摇床120r/min培养36h时获取种子液，随即将种子液直接接种于事先高温灭菌完成的常温液体发酵培养基中，接种比例1.5％，密闭厌氧发酵，发酵温度37℃，搅拌转速120r/min，间断性搅拌，间断时间12h，发酵36h后得到的发酵液与事先灭菌完毕的第一半固态培养基中按照比重1:0.3至1:0.5混合均匀后进行37℃发酵48h，发酵后的物料放置于人工流化床系统进行37℃恒温干燥，干燥后低温粉碎得到的活菌数在5×109～8×109cfu/g之间的粪肠球菌菌粉。

3.根据权利要求2一种复合菌发酵菌剂，其特征在于，所述第一半固态培养基为次粉和统糠1:1物料比混合物。

4.根据权利要求1～3任一一种复合菌发酵菌剂，其特征在于，所述酿酒酵母为酿酒酵母菌粉，通过如下方法制备：将酿酒酵母菌种从斜面接种至YPDA培养基中，在28℃条件下150r/min摇床培养24h获取种子液，随即将种子液直接接种于事先高温灭菌完成的常温液体培养基中密闭发酵36h后直接接种于事先已经高温灭菌的第二半固态培养基中混合发酵72h后放置于人工流化床系统进行37℃恒温干燥，干燥后低温粉碎得到6.0×109～8.0×109cfu/g之间的酿酒酵母菌菌粉。

5.根据权利要求4一种复合菌发酵菌剂，其特征在于，所述第二半固态培养基为麸皮：糖蜜：统糠＝3：1：6，料水比1:0.4混合。

6.一种复合菌发酵菌剂组合物，其特征在于，包括根据权利要求1～5任一所述复合菌发酵菌剂和发酵培养基，所述发酵培养基通过如下方法制备：

发酵剂营养液的制备：将氯化钠10g、尿素5g、硫酸亚铁0.2g、磷酸二氢钾0.35g、硫酸镁0.18、硫酸锰0.05g、酵母硒0.5g、氯化钙20与0.2L自来水中加热完全溶解并与市售的氨基酸营养液0.8L完全混合，用氢氧化钠与盐酸调节pH值至6～7之间灭菌备用；

营养碳源的制备：糖蜜、发酵剂营养液以及统糠按照2～3：1～3：2～7比例进行逐级混合，混合均匀后流化床高温烘干粉碎；

将植物氮源、骨粉、营养碳源以及次粉按照1～3：1～3：5～10：84～93比例均匀混合即为发酵培养基。

7.一种复合菌发酵菌剂的发酵方法，其特征在于，使用根据权利要求6所述一种复合菌发酵菌剂组合物，在可遮光可密闭的容器内，将复合菌发酵菌剂：发酵培养基：阳光暴晒的自来水或者地下水按照1:4～8:100的比例进行均匀混合后密闭发酵。

8.根据权利要求7所述一种复合菌发酵菌剂的发酵方法，一种复合菌发酵菌剂的发酵方法，其特征在于，发酵环境温度15～45℃，发酵pH值3.6～4.8，发酵液最高菌含量1.5×1010cfu/ml。

9.一种复合菌发酵菌剂的应用，其特征在于，根据权利要求1～5任一所述一种复合菌发酵菌剂或权利要求6所述一种复合菌发酵菌剂组合物应用于甲壳类水产品的养殖。

10.根据权利要求9所述一种复合菌发酵菌剂的应用，其特征在于，所述一种复合菌发酵菌剂应用于河蟹、小龙虾养殖。

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