CN111909871A - 一种拮抗桃细菌性穿孔病菌的粪产碱杆菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物病害的生物防治，属于植物保护学科中的生物防治研究与应用领域。具体公开一种拮抗桃细菌性穿孔病菌的粪产碱杆菌及应用，该菌株分类命名为粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis，于2020年6月17日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为GMCC No.20098。在温室盆栽和田间防效试验中，YZ19菌液能较好地降低桃细菌性穿孔病病叶率或病情指数达到控制病害发展的目的。因此可以用粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)YZ19研发新型生物农药，用于桃细菌性穿孔病的生物防治。

Description

一种拮抗桃细菌性穿孔病菌的粪产碱杆菌及应用

技术领域

本发明涉及植物病害的生物防治，属于植物保护学科中的生物防治研究与应用领域。具体涉及一株拮抗桃细菌性穿孔病菌的粪产碱杆菌及应用。

背景技术

桃细菌性穿孔病是桃上发生最为重要的病害之一，在世界上广泛分布和传播。该病害在我国的分布范围较广，在全国各个主要桃产区都有发生。细菌性穿孔病主要为害桃树叶片，也能侵染枝梢和果实，能致使叶片、枝梢和果实出现穿孔状病斑或水渍状溃疡斑，减弱桃树的树势，降低产量和果品的质量，造成减产和较严重的经济损失。目前生产上尚未有防治该病害的特效药剂，主要是利用含铜制剂如波尔多液、氢氧化铜等以及噻唑锌等。而一直用于该病防治的生物农药农用硫酸链霉素因可能会在人体富集产生风险，不再登记和续展。但使用化学药剂容易存在环境污染和农药残留等问题，而且已有研究发现桃对铜离子敏感，因此含铜制剂在该病的防治上已经有所受限。而生物防治的研究及其应用避免了化学农药带来的负面影响，成为目前植物病害综合或生态治理中的重要手段。目前桃细菌性穿孔病生物防治的研究鲜有报道，从病害防治角度，还需开发其它有效药剂特别是生物菌剂供农业生产选择使用。自然界含有许多有益微生物，从环境中大量筛选得到生防微生物是生物药剂研制的基础工作，也是业内筛选有益微生物的惯用工作模式。生防细菌一般是一类可产生抗菌物质(如抗生素、抗菌蛋白、多肽等)的细菌，以桃细菌性穿孔病菌为目标细菌，从土壤或植物根际根围土壤中筛选能抑制该菌的细菌，是一种效率较高的筛选生防微生物的方法。

发明内容

本发明为了给研制新型生物农药提供基础，丰富防治桃细菌性穿孔病的药剂种类，本发明的目的在于提供一株生防菌株，该菌株能有效抑制桃细菌性穿孔病菌(Xanthomonas arboricola pv.pruni)的生长。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一株粪产碱杆菌YZ19，该菌株分类命名为粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis，于2020年6月17日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为GMCC No.20098。

上述的粪产碱杆菌YZ19在制备防治桃细菌性穿孔病菌生物农药中的应用。

一种防治桃细菌性穿孔病菌的生物农药，该生物农药包含上述的粪产碱杆菌YZ19。优选的，该生物农药由权利要求1所述的粪产碱杆菌YZ19的菌液制成的。进一步优选的，所述菌液的浓度不低于1×10⁹cfu/mL。

在田间防效实验中，该菌株对桃细菌性穿孔病菌的抑制效果与生物农药四霉素、化学农药噻唑锌相当。可弥补桃细菌性穿孔病防控中缺乏的生物防治手段，该菌可部分替代化学农药或与化学农药交替使用，在不影响防效的情况下能明显减少化学农药使用，减少农药残留和对环境造成的污染，同时也可延缓病菌产生抗药性，有助于保证桃果的安全性，提升桃果的优质果品率和质量。因此可以用粪产碱杆菌YZ19研发新型生物农药，用于桃细菌性穿孔病的生物防治。另外，利用该菌的生物防治还可辐射到其他产区，用于桃细菌性穿孔病的防治。因此，该发明及其应用，不仅能够防治病害减少经济损失，而且还能推动桃产业的绿色可持续发展，减少农药对环境造成的污染。

本发明的有益效果：

本发明粪产碱杆菌YZ19能有效抑制桃细菌性穿孔病菌，效果与生物农药四霉素与化学农药噻唑锌相当，有防治细菌性穿孔病病的潜力。该菌株也可产生脂肽类抗生素，对桃细菌性穿孔病菌产生抑制作用。与化学药剂相比，使用YZ19菌株防治植物病害没有环境污染、农药残留等问题。

附图说明

图1是粪产碱杆菌YZ19菌株对桃细菌性穿孔病菌的拮抗效果。

图2是YZ19菌株的菌落形态。

图3是YZ19菌株16S rDNA序列PCR扩增电泳图。

图4是基于YZ19的16S rDNA构建的系统发育进化树。

图5是YZ19菌株脂肽抗生素合成相关基因PCR扩增电泳图。

图6是YZ19菌株对桃叶、枝条的离体防治效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1粪产碱杆菌YZ19的筛选和鉴定

(1)土壤样本来自扬州、无锡、大连等多个桃产区桃树根际，采用随机取样的方法选定采土地点后，铲去表层5cm土层，取新鲜土样500g，用保鲜袋保存，并记录取样地点和日期。

(2)称取10g土样加入装有90mL无菌水的三角瓶中，28℃、160r/min振荡30min，静置后获得10^-1浓度的土壤悬液。

(3)取上清液1mL加入到盛有9mL无菌水的试管中，振荡摇匀，再取1mL加入到另一支盛有9mL无菌水的试管中，以此类推，依次将土壤悬液浓度稀释到10^-5、10^-6、10^-7。

(4)吸取不同稀释度的土壤悬液100μL涂布于牛肉浸膏蛋白胨(NA)平板上，每个梯度重复3次，28℃下培养24h。

(5)根据培养皿中长出的菌落形态，尽量挑取形态有差异的单一菌落，分别编号，在新的NA平板上划线纯化后保存。

(6)取100μL OD₆₀₀＝0.6的桃细菌性穿孔病菌(菌株由本实验室分离、鉴定和保存，为本领域技术人员公知的常规病菌)菌液加入融化并冷却至45℃左右NA培养基中，摇匀后倒制平板，平板凝固晾干后，在NA平板中央接种待测细菌悬浮液5μL，置于28℃恒温箱培养24h后观察抑菌活性，根据在待测细菌处理位置是否有抑菌圈确定菌株的拮抗活性。

(7)对初筛有拮抗活性的菌株进行复筛，复筛方法同(6)。根据抑菌圈的大小确定菌株拮抗活性的大小，挑取有较好拮抗抑菌作用的菌株连续转接多代后按上述方法再测菌株的拮抗性，确定拮抗稳定性。获得一株拮抗性强且稳定的菌株，命名为YZ19。如图1，平板中靠近接种YZ19菌落的桃细菌性穿孔病菌生长受到了抑制，可形成明显的抑菌圈，说明YZ19能产生抑菌物质，使附近的病菌不能生长。

(8)采用形态特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析对菌株进行种类鉴定。

形态和培养特征：菌落呈圆形、略带淡黄色、边缘模糊、表面湿润、半透明状，略微凸起(图2)，有些许水果香味(粪产碱杆菌的特征之一)。

生理生化特征：菌株的生理生化特征见表1。

表1菌株YZ19的生理生化特征

注：“+”表示阳性，“﹣”表示阴性。

以上YZ19的主要理化特征参数与粪产碱杆菌基本一致。

16S rDNA基因序列分析：提取YZ19基因组DNA，采用细菌16S rDNA基因通用引物扩增，扩增出一条特异性条带，大小约1500bp(图3)。将目的条带回收、测序，将获得的序列在GenBank中进行BLAST比对，结果表明菌株YZ19的16S rDNA基因序列与粪产碱杆菌的序列相似性高达99.93％，同时构建了系统发育树，结果显示YZ19和粪产碱杆菌Alcaligenesfaecalis ARD39等4株粪产碱杆菌聚在同一支，亲缘关系最近(图4)。因此，YZ19菌株为粪产碱杆菌。YZ19菌株的16S rDNA基因序列已在GenBank进行登录，accession No.为MT579857。

(9)脂肽抗生素合成相关基因序列分析。

利用分子生物学手段对YZ19基因组中脂肽类抗生素合成相关基因进行检测，以明确YZ19是否具有代谢产生脂肽抗生素的可能性。利用特定菌株的特定基因序列设计出四对引物，分别对fenB(丰原素合成酶基因)、ituA(伊枯草菌素合成酶基因)、mycB(抗霉枯草菌素合成酶基因)、sfp(脂肽抗生素合成调控基因)进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，仅ituA基因扩增出符合条件的条带，推测菌株YZ19基因组中可能存在伊枯草菌素合成酶相关基因，调控伊枯草菌素的合成参与拮抗作用，而无丰原素等其他脂肽抗生素的合成有关基因(图5)。

本发明筛选的菌株YZ19于2020年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为粪产碱杆菌，拉丁名为：Alcaligenes faecalis，保藏编号为CGMCC No.20098。

实施例2粪产碱杆菌YZ19病害抑制效果

(1)离体接种病害抑制效果：

将YZ19菌株接种至pH7.0的牛肉浸膏蛋白胨细菌液体培养基(NB)中，28℃、180r/min振荡培养36h，即获得浓度不小于1×10⁹cfu/mL的YZ19菌液(OD₆₀₀＝1.2)。

叶片和枝条接种均采用悬滴法。选取健康、大小和粗细一致的桃树叶片和新梢，经酒精消毒处理后，在叶片和新梢上用无菌针头制造伤口，在伤口处先悬滴2μL YZ19菌液(浓度为1×10⁹cfu/mL)，设置清水对照处理，1d后在同样位置悬滴2μL桃细菌性穿孔病菌菌液(浓度1×10⁹cfu/mL)，每处理3次重复，叶片叶柄处用湿棉球包裹进行保湿处理，枝条则通过增加空气湿度进行保湿，将处理好的叶片/新梢置于28℃恒温箱中，定期观察发病情况。5d后观察实验结果发现，经过YZ19菌液保护处理的叶片和新梢枝条，相较于清水对照处理，发病情况均有所减轻。YZ19菌液处理的叶片表现为病斑较小、病斑颜色较浅；枝条表现为表面有白色物质生成，抑制了病斑的扩散(图6)。

(2)温室盆栽防治试验：

选取健康、未经过任何药剂处理的盆栽桃苗，选取部分枝条(带叶)，用硬毛刷刷一遍制造微小伤口，先均匀喷雾YZ19菌液(浓度为1×10⁹cfu/mL)，设置清水作为对照处理，1d后喷雾桃细菌性穿孔病菌菌液(浓度1×10⁹cfu/mL)，注意喷雾时做好隔离，防止交叉污染，处理完后挂牌标示。7d后重复上述处理，第2次接种病菌后每隔5d调查一次发病情况，共调查三次，调查记录总叶片数、病叶数和叶片的病情指数(分级标准见表2)，用邓肯氏新复极差法(DMRT)在5％水平检验不同处理间的差异显著性。

表2桃细菌性穿孔病分级标准(叶)

根据下述公式计算病叶率及病叶防效，病情指数及病指防效。

由表3和表4可以看出，相比于清水CK，YZ19菌液处理的三次调查病叶率和病情指数都显著降低，病叶防效53.81％～69.70％，病指防效为56.67％～67.41％。因此，盆栽试验说明YZ19菌液对桃细菌性穿孔病有显著的防治效果。

表3温室盆栽试验YZ19菌液对桃细菌性穿孔病的病叶防效

注：同列小写字母数值间差异显著(P<0.05)。

表4温室盆栽试验YZ19菌液对桃细菌性穿孔病的病指防效

注：同列小写字母数值间差异显著(P<0.05)。

(3)田间防治试验：

选取发病程度基本一致、通风良好、地理位置一致的相同品种桃树，选取部分枝条(带叶)，均匀喷雾YZ19菌液(浓度1×10⁹cfu/mL)，设置清水CK及0.3％四霉素水剂(生物农药制剂)、20％噻唑锌悬浮剂(化学农药制剂)作药剂对照处理，每个处理3次重复，注意做好喷雾隔离及挂牌标示。7d后进行YZ19及上述药剂第2次喷雾处理，第2次菌(药)后15d和30d进行病情指数调查，数据处理计算等同上温室盆栽防治试验。

从表5的结果可知，2次喷施后15d生防菌YZ19菌液处理的叶片病情指数显著低于两种药剂处理，对桃细菌性穿孔病的病指防效达到40.00％，2次喷施后30d与四霉素和噻唑锌的叶片病指差异不显著，病指防效为40.82％，较为稳定。因此，田间试验说明YZ19菌液对桃细菌性穿孔病的防效与四霉素和噻唑锌相当。

表5田间试验YZ19菌液对桃细菌性穿孔病的防治效果

注：同列小写字母数值间差异显著(P<0.05)。

补充说明：四霉素又称梧宁霉素，为本发明申请人实验室筛选出的对桃细菌性穿孔病有较好防治效果的生物农药，可替代生产上不再登记的农用硫酸链霉素进行桃细菌性穿孔病的防治。噻唑锌是目前唯一在桃上登记用于防治桃细菌性穿孔病的化学农药。选用四霉素和噻唑锌作为药剂对照，可以比较本发明粪产碱杆菌YZ19菌液的防治效果，结果表明YZ19具有防治桃细菌性穿孔病的应用潜力。

Claims (5)

1.一株粪产碱杆菌YZ19，该菌株分类命名为粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis，于2020年6月17日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为GMCC No.20098。

2.权利要求1所述的粪产碱杆菌YZ19在制备防治桃细菌性穿孔病菌生物农药中的应用。

3.一种防治桃细菌性穿孔病菌的生物农药，其特征在于，该生物农药包含权利要求1所述的粪产碱杆菌YZ19。

4.根据权利要求3所述的防治桃细菌性穿孔病菌的生物农药，其特征在于，该生物农药由权利要求1所述的粪产碱杆菌YZ19的菌液制成的。

5.根据权利要求4所述的防治桃细菌性穿孔病菌的生物农药，其特征在于，所述菌液的浓度不低于1×10⁹cfu/mL。

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