CN117625475B - 防治tmv的微生物代谢物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治TMV的微生物代谢物的制备方法、筛选方法及筛选物，所述微生物代谢物为沼泽红假单胞菌GJ‑22，保藏编号为CGMCC NO：17356，拉丁文为Rhodopseudomonas sp，其菌株GJ‑22保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明通过对沼泽红假单胞菌GJ‑22进行超声及代谢组分析，从中筛选出五种代谢物并得到防治TMV的配方，以期为农业生产中生防微生物源病毒抑制成分的研究和TMV的防治提供新的方向。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种防治TMV的微生物代谢物的制备方法。
背景技术
烟草花叶病毒tobacco mosaic virus 缩写TMV，为RNA病毒，是烟草花叶病等的病原体，属于Tobamovirus群。侵染茄科等超过36科400多种植物，至今仍无有效的化学治疗方法能抑制病毒的复制和繁殖。微生物源次生代谢产物具有丰富的种类和生物活性。本发明方法是对生防菌沼泽红假单胞菌GJ-22进行超声及代谢组分析，并通过诱导心叶烟抗TMV试验从而筛选并得到五种代谢物成分及配比用以诱导烟草抵抗TMV的侵染。有别于传统的化学农药防治和生物农药防治，其符合我国农业可持续发展和环境保护的最大需求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种防治烟草花叶病毒TMV的微生物代谢物的制备方法。
本发明的目的通过以下的技术方案来实现：
一种防治TMV的微生物代谢物的制备方法，包括：
所述微生物代谢物为沼泽红假单胞菌GJ-22，其菌株GJ-22保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：17356，拉丁文为Rhodopseudomonas sp。
上述沼泽红假单胞菌GJ-22，已于2019年03月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，红假 单 胞 菌 Rhodopseudomonas sp，保藏编号为CGMCC NO：17356。
进一步地，以2%的接种量接种沼泽红假单胞菌GJ-22到液体培养基中，于30±1℃的恒温培养室，在2500lx-3000lx的白炽灯下光照培养；每24小时于40khr、80w条件下超声5分钟；
培养5天后，细菌过滤器过滤后去除菌体，得到滤液；
对滤液进行代谢组分析；
得到43种差异物代谢物，其中5种代谢物累积量下调，38种代谢物累积量上调，并有13种累积量上调超过0.6倍。
与现有技术相比，本发明的一个或多个实施例可以具有如下优点：
超声处理增强了沼泽红假单胞菌GJ-22菌液诱导心叶烟抗烟草花叶病毒TMV的有效成分。
附图说明
图1是超声处理的沼泽红假单胞菌GJ-22菌液诱导心叶烟抗TMV试验示例图；
图2是13种代谢物复配处理诱导心叶烟抗TMV试验示例图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。
实施例一
超声处理沼泽红假单胞菌GJ-22菌液并进行诱导心叶烟抗TMV效果试验：
1、沼泽红假单胞菌GJ-22的培养及超声处理：
按2%的接种量接种沼泽红假单胞菌GJ-22到液体培养基中，于30±1℃的恒温培养室，在2500lx-3000lx的白炽灯下光照培养。
每24小时于40khr、80w条件下超声5分钟；培养5天。
2、诱导心叶烟抗TMV试验
心叶烟，移栽6-8周后，选长势均匀一致的心叶烟植株，每株灌根5mL超声处理的沼泽红假单胞菌GJ-22菌液，连续灌根三天，采用未超声处理的沼泽红假单胞菌GJ-22菌液作阳性对照，无菌水作为阴性对照。连续处理三天后，第三、四片叶接TMV病毒粒子。叶面撒金刚砂，每片叶接25μL TMV病毒粒子(浓度为0.74 mg/ml)，TMV接种后洗瓶冲洗。25℃光照培养，每10株为一个处理，重复三次。72h后统计枯斑数。
结论：试验数据显示，超声处理的沼泽红假单胞菌GJ-22菌液处理组植株接毒72h后，心叶烟叶面枯斑数均明显低于阴性对照组及阳性对照组叶面枯斑数。表1为超声处理后沼泽红假单胞菌GJ-22菌液诱导心叶烟抗TMV试验平均枯斑数统计，图1为超声处理的沼泽红假单胞菌GJ-22菌液诱导心叶烟抗TMV试验图，即超声处理增强了沼泽红假单胞菌GJ-22菌液诱导心叶烟抗TMV作用效果。
表1
实施例二
沼泽红假单胞菌GJ-22菌液代谢物病毒抑制成分的筛选：
1、超声处理的沼泽红假单胞菌GJ-22滤液代谢组分析：
按2%的接种量接种沼泽红假单胞菌GJ-22到其液体培养基，于30±1℃的恒温培养室，在2500lx-3000lx的白炽灯下光照培养。
每24小时于40khr、80w条件下超声5分钟；培养5天后，细菌过滤器过滤后去除菌体，得到滤液。
将上述滤液进行代谢组分析显示：以未做超声处理的样品滤液作为对照，共筛选到43种差异代谢物，5种代谢物累积量下调，38种代谢物累积量上调，其中13种代谢物累积量变化倍数超过0.6倍，如表2所示为沼泽红假单胞菌GJ-22滤液中差异代谢物，分别取上述13种累积量上调的代谢物的原药粉粉剂，按照代谢组中所测物质含量进行复配，上调0.6倍以上的差异代谢物及在各处理中的配比如表3所示。
表2
表3
注： “×”代表13种代谢物组合中去掉该物质。
2、菌液代谢物诱导心叶烟抗TMV成分筛选试验一
A处理：将13种代谢物质纯品按超声代谢组中检测到的含量进行复配即，γ-氨基丁酸0.01221μg/L+3-吲哚乙腈0.00030μg/L+天冬氨酸0.00261μg/L+β-丙氨酸0.00908μg/L+莽草酸 0.08842μg/L+二十四烷 0.04196μg/L+绿原酸0.01333μg/L+α-酮戊二酸0.00043μg/L+1-蔗果三糖0.01781μg/L+D-果糖-6-磷酸0.00750μg/L+葡萄糖-6-磷酸 0.01214μg/L+D-果糖-1-磷酸 0.18224μg/L+胞嘧啶0.00675μg/L；
阳性对照：超声处理的沼泽红假单胞菌GJ-22滤液；
阴性对照：无菌水。
心叶烟，移栽6-8周后，选长势均匀一致的心叶烟植株，上述处理每株灌根5mL，采用无菌水作对照。连续灌根三天后，第三、四片叶接TMV病毒粒子。叶面撒金刚砂，每片叶25μL TMV病毒粒子(浓度为0.74 mg/ml)，TMV接种后洗瓶冲洗。25℃光照培养，每10株为一个处理，重复三次。72h后统计枯斑数。
结论：诱导心叶烟抗TMV试验数据显示，A处理各植株接毒72h后，心叶烟叶面平均枯斑数为32.25个与阳性对照组的31.20个差异不显著，但A处理心叶烟叶面平均枯斑数显著低于阴性对照组62.00个。表4为13种代谢物复配A处理诱导心叶烟抗TMV试验平均枯斑数统计，图2为13种代谢物复配A处理诱导心叶烟抗TMV试验示例图，即A处理13种代谢物中包含超声处理的沼泽红假单胞菌GJ-22滤液中诱导心叶烟抗TMV的有效成分。
表4
3、菌液代谢物诱导心叶烟抗TMV成分筛选试验二
如表3，每次去掉一种代谢物质，然后进行诱导心叶烟抗TMV试验，计算与阳性对照病斑的差异显著性。
B处理：A处理组合中去掉γ-氨基丁酸；
C处理：A处理组合中去掉3-吲哚乙腈；
D-N处理：以此类推；
阳性对照：A处理；
阴性对照：无菌水。
心叶烟，移栽6-8周后，选长势均匀一致的心叶烟植株，上述处理每株灌根5mL，采用无菌水作对照。连续灌根三天后，第三、四片叶接TMV病毒粒子。叶面撒金刚砂，每片叶25μL TMV病毒粒子(浓度为0.74 mg/ml)，TMV接种后洗瓶冲洗。25℃光照培养，每10株为一个处理，重复三次。72h后统计枯斑数。
诱导心叶烟抗TMV的代谢物复配及筛选试验结果显示，各处理组植株接毒72h后，与阳性对照相比心叶烟叶面枯斑数差异显著的处理分别为处理B、C、F、H和I。与阳性对照相比心叶烟叶面枯斑数差异不显著的处理分别为处理D、E、G、K、L、M和N，表5为菌液代谢物诱导心叶烟抗TMV成分筛选及复配试验平均枯斑数统计。发生显著差异的处理其组合中去掉的成分为有效成分记为“√”，反之差异不显著的为无效成分记为“×”。结果显示，0.01221μg/L γ-氨基丁酸、0.00030 μg/L 3-吲哚乙腈、0.08842 μg/L莽草酸、0.01333 μg/L绿原酸和0.01781 μg/L 1-蔗果三糖为有效成分如表5所示：
表5
注：表中同列不同小写字母表示处理间差异显著（P＜0.05）；“√”代表判断为有效成分，“×”代表判断为无效成分。
4、菌液代谢物诱导心叶烟抗TMV成分筛选试验三
有效成分复配组： 0.01221μg/L γ-氨基丁酸、0.00030μg/L 3-吲哚乙腈、0.08842μg/L莽草酸、0.01333μg/L绿原酸和0.01781μg/L 1-蔗果三糖；
阳性对照：A处理；
阴性对照：无菌水。
心叶烟，移栽6-8周后，选长势均匀一致的心叶烟植株，上述处理每株灌根5mL，采用无菌水作对照。连续灌根三天后，第三、四片叶接TMV病毒粒子。叶面撒金刚砂，每片叶25μL TMV病毒粒子(浓度为0.74 mg/ml)，TMV接种后洗瓶冲洗。25℃光照培养，每10株为一个处理，重复三次。72h后统计枯斑数。
试验数据显示，有效成分复配组植株接毒72h后，心叶烟叶面枯斑数均明显低于阴性对照组且与阳性对照A处理差异不显著，表6为有效成分复配组诱导心叶烟抗TMV试验平均枯斑数统计，即本方法筛选到的有效成分复配组能有效的诱导心叶烟抗TMV侵染。
表6
虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容只是为了便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属技术领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式上及细节上作任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
Claims (1)
1.一种防治TMV的微生物代谢物的制备方法，其特征在于，
所述微生物代谢物是通过沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas sp）GJ-22培养得到，菌株GJ-22保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：17356；
以2%的接种量接种沼泽红假单胞菌GJ-22到液体培养基中，于30±1℃的恒温培养室，在2500lx-3000lx的白炽灯下光照培养；每24小时于40khr、80w条件下超声5分钟；
培养5天，得到沼泽红假单胞菌GJ-22菌液；
所述沼泽红假单胞菌GJ-22菌液可诱导烟草的心叶抗TMV。
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