CN116064320B - 一株降解烟碱的烟草内生肠杆菌cylob及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株烟草内生肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB，其对烟草烟碱具有较好的降解能力，能够能在4.0g/L尼古丁的LB培养基中生长，最高耐受力达到8g/L尼古丁。将此内生菌定植于烟草中，侵染40天后检测烟草叶片中尼古丁的含量下降54％。可用于烟草尼古丁的降解。

Description

一株降解烟碱的烟草内生肠杆菌CYLOB及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株降解烟碱的烟草内生菌及其应用。
背景技术
烟草中高含量的烟碱(nicotine，又称尼古丁)一直是吸烟者健康问题的重大隐患。尼古丁是烟草的主要成分，其本质是存在于茄科植物中的一类生物碱，它能与人脑中的烟碱乙酰胆碱受体结合，刺激脑中兴奋性神经递质多巴胺的分泌量增加。因此，人吸烟后，摄入体内的尼古丁会使人产生愉悦感，从而形成对尼古丁生理上和心理上的依赖性。但是，长期吸烟会导致人各种系统的功能损害，大大增加罹患肺癌和严重的心血管疾病的几率。此外，烟草废弃物中的烟碱还会污染环境。因此，降低烟草和烟草废弃物中的烟碱含量对人体健康和环境保护有着重大的现实意义。
目前降低烟草内烟碱的含量，主要可从烟草的生长过程和加工过程两方面着手。在烟草加工过程中，通过物理(增加过滤作用)或化学手段(加入与生物碱结合的添加剂)来降低烟碱含量。在烟草生长过程中，可通过1)调整烟草种植条件；2)利用遗传育种培养低含量烟碱的烟草品种；3)利用微生物降解烟草里的烟碱含量。用物理或化学的方法处理烟叶中的烟碱可以达到一定的分解和降低效果，但同时也损失了烟草中一些其他的化学成分，使烟草质量下降；通过改变环境降低烟草内烟碱含量，应用范围窄，成本高。利用微生物降解烟草烟碱可以在不改变烟草内在其他化学成分的同时，降低烟叶中尼古丁的含量。然而，目前研究发现的降解烟草烟碱的微生物大部分是从种植烟草的土壤、烟草废弃物中找到的，筛出来的菌不能在烟草叶中生存，或者会对烟草植株致死，没有从烟草叶本身解决烟碱含量高的问题。
近年来，利用烟草内生菌来降低烟草中的烟碱含量，日益受到国内外研究人员的重视。赵丽萍等从烟叶样品中分离出一株内生巴氏微杆菌(Microbacterium barkeri)11L140,该菌株在烟碱浓度为1‰和2‰的条件下培养54h后,烟叶中烟碱的降解效率高达98.76％和89.52％。张天栋等从云南烤烟B2F烟叶中分离出一株内生粗糙脉孢霉菌(Neurospora crassa)HBBB201,其发酵液添加到玉溪上部烟叶中,经恒温恒湿处理5d后,玉溪上部烟叶中的烟碱和亚硝酸盐含量分别降低33.9％和19.2％。苏丹等从福建三明烟区的烟草植株中筛选得到一株具有高效降烟碱特性的内生菌假单胞菌Y5。当烟碱浓度为1.5,2.0,3.0g·L-1，菌株Y5在48h基本完全降解烟碱，降解率分别为99％、99％和96％。林智慧等从烟叶样本中筛选出一株具有高效烟碱降解功能的内生菌G16，经过24h的培养可达到约90％的降解率。申星等从湖南浏阳官渡烟草基地烟草植株中分离了菌株T11，经鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其烟碱降解为75.2％。
目前，烟草内生菌降解烟碱的研究，所用的烟碱起始浓度较低(≤3.0g·L-1)，且关于烟草内生肠杆菌对于烟碱的降解研究还未有报道。目前大部分研究都停留在菌种鉴定，生理生化特性分析和尼古丁降解实验，没有进行烟草活体实验。由于内生细菌的特殊性，只有通过将其定殖回烟草植株，才能直观地确定它们是否具有致病性或降低尼古丁含量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一株能够耐高尼古丁浓度并具有高降解效率的烟草内生肠杆菌。
本发明的技术方案为：一株肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221712，保藏日期为2022年11月02日。
肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB的16S rDNA序列如序列表1所示。
肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB在降解尼古丁中的应用。
肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB在调整烟草尼古丁含量中的应用。
进一步地，所述烟草为烟草活体植株。
进一步地，通过注射的方式使肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB侵染烟草活体植株，从而降低烟草活体植株中尼古丁的含量。
本发明相较于目前已发现的降解烟碱的方法最大的不同在于用来降解烟碱的是烟草内生菌。因此可避免烟草中其他化学成分的损失从而导致的烟草质量下降。内生菌降解烟草烟碱的应用范围广，成本低，且具有高效性，高选择性以及专一性，对环境的污染也相对减少。目前研究发现的降解烟草烟碱的微生物大部分是从种植烟草的土壤、烟草废弃物中找到的，筛出来的菌不能在烟草叶中生存，没有从烟草叶本身解决烟草烟碱含量高的问题。但是内生菌与植物宿主之间可以通过基因重组、信息交流或协同宿主植物合成次级代谢物促使宿主植物表现出一定的应激耐受性、促生性、固氮作用等，所以通过从烟草组织中筛出有降解烟碱特性的内生菌，来实现从烟草叶降低烟碱含量是有很大发展空间的。此外，目前对能够降解烟碱的烟草内生菌也有过相关研究报导，但都未能确保将内生菌侵染到烟草植株不会对其生长造成不良影响。故本发明除了筛选出能够降解烟碱的烟草内生菌外，还进行了内生菌侵染烟草植株的实验，确保其对植株生长不会造成不良影响，同时也通过测量烟草植株在注射内生菌后的烟碱含量变化验证了该内生菌实际应用于降解烟草内烟碱含量的可行性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB对烟草烟碱具有较好的降解能力，能够能在4.0g/L尼古丁的LB培养基中生长，最高耐受力达到8g/L尼古丁，可用于尼古丁的降解。肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB来源于烟草植株组织内，为烟草内生菌，可以用于调整烟草植株的烟碱含量。
保藏信息：
肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号：CCTCC NO:M 20221712，保藏日期为2022年11月02日。
附图说明
图1.菌株Enterobacter sp.CYLOB的菌落形态(A)和SEM图(B)。
图2.菌株Enterobacter sp.CYLOB的16S rDNA基因序列系统发育树。
图3.菌株Enterobacter sp.CYLOB在正常条件和含有4g/L尼古丁浓度胁迫下的生长曲线图及其对尼古丁的降解。
图4.烟草苗盆栽后在露天自然条件下的生长状况(A)和注射接种后15天的生长状况(B)。
图5.烟叶中烟碱含量的检测报告。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施案例中涉及到的培养基组分：
(1)NB培养基配制:牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、调pH为7.2，加水至1L。
(2)NA培养基配制:在NB培养基中加入琼脂17g即为NA培养基。
(3)LB培养基配制：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，调pH为7.2，加水至1L。
(4)半固体培养基配制：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，琼脂5g，调pH为7.2，加水至1L，直立试管凝固。
(5)筛选降解烟碱细菌的培养基配制(以尼古丁为唯一碳源和氮源)：尼古丁2.0g，K2HPO4·3H2O 13.3g，MgSO4·7H2O 0.2g，微量元素溶液(MnSO4·7H2O 0.4g，CaCl2·2H2O0.2g，FeSO4·7H2O 0.2g,使用0.1mol/L HCl定容至100mL)0.5mL。加水定容至1000mL，pH为7.0，于121℃灭菌20min。上述培养基中加入18g琼脂即为固体培养基。
实施例1耐烟碱烟草内生菌CYLOB的筛选
本发明菌株采用了NB培养基和以尼古丁为唯一碳源培养基两种方法来筛选。NB培养基能够做到较全面的筛选抗高浓度尼古丁的内生菌，而以尼古丁为唯一碳源的培养基则保证了筛选出的内生菌能够对尼古丁起到一定程度的降解利用。具体操作步骤如下：
(1)烟草内生菌的获取与富集培养
本发明将采集到的四川省攀枝花市烟田烟草植株的根，茎，叶作为实验材料，其中茎分别取顶端茎，中端茎和底端茎，叶分别取顶端叶，中部叶和底端叶，每一部分分别取四个样本。获取烟草内生菌并对其进行富集培养的操作步骤如下：
①先用清水洗涤烟草根、茎、叶表面至清洁干净、无泥土；
②在无菌操作台中将清洗过的材料用0.1％升汞溶液消毒，叶片浸泡1min，根、茎浸泡1.5min，处理完成后用无菌水冲洗3-4次，取最后一次洗涤液，涂在NA平板上37℃培养过夜。无菌落生长,表明烟草样本表面杀菌充分，可以继续往下做。如有菌落生长，表明烟草样本表面杀菌不充分，重复步骤2；
③将灭好菌的叶用无菌刀切掉边缘，只取叶片中间部分，剪成0.5cm的方块，茎部和根部切成薄片，将切好的组织块放入NA培养基平板表面，37℃培养箱倒置培养3-7天。
④将NA培养平板上组织块周围的细菌菌落挑出，分明別类地接种到50mLNB培养基内，37℃,250rpm摇床培养24h。然后每类取0.85mL,与灭菌甘油混合，使甘油的最终浓度为30％。振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的保存管内，放-80度冰箱中保存。
(2)降解烟碱的烟草内生菌的筛选
①将上面富集培养的细菌菌液按1:100比例接种到含0.4g/L尼古丁的NB培养基中，37℃，250rpm摇床培养过夜。
②培养过夜后，按1:100比例依次接种到含1.0g/L，2.0g/L和3.0g/L尼古丁的NB培养基中，37℃，250rpm摇床培养过夜。
③收集能在3.0g/L尼古丁的NB培养基中生长的细菌，按照稀释法稀释细菌。然后在10-9-10-10稀释样品中分别取50,100、200μL涂布在含4.0g/L尼古丁的NA固体平板上。作好标识，37℃培养箱中倒置培养过夜。
④挑选不同形态特征(菌落形状、菌落颜色、菌落大小、菌落光滑等)单菌落(每个类型要有至少3个重复),分别接种至5mL以尼古丁为唯一碳源和氮源的筛选培养基中，37℃,250rpm摇床培养过夜。
⑤测试细菌的尼古丁耐受性，分别将不同形态特征的菌株接种至含有1.0g/L-10.0g/L尼古丁的NB培养基中37℃培养12h后，检测细菌生长的OD600值。
最终获得一株以尼古丁为唯一碳源和氮源的培养基中生长的菌株,它能在含有4.0g/L尼古丁的NB培养基中生长，最高能耐受8g/L尼古丁(最大抑制浓度)。我们将此菌株编号为CYLOB，即为本专利菌株。
实施例2烟草内生肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB的鉴定
(1)细菌形态特征观测
利用平板划线法将菌株CYLOB接种于牛肉膏蛋白胨平板上，37℃恒温培养48h后，观测菌落形态。
取2-3mL培养至稳定期的菌液，离心收集菌体。加入40倍菌体体积的2.5％戊二醛溶液，并置于4℃下保存固定3h以上，并用PBS缓冲液洗涤菌体3次。然后依次用乙醇水溶液按30％、50％、70％、80％、90％的浓度梯度对样品进行脱水，每步约15min。离心后在100％乙醇中脱水2次，每次15min；离心弃上清，再将样品置于乙醇和叔丁醇1:1的混合液中15min；弃上清后，用纯叔丁醇置换酒精2次，每次15min；最后用乙醇和醋酸异戊酯脱水。置换后将样品经过冷冻真空干燥，干燥的样品进行喷金制样。利用扫描电子显微镜(SEM)观察菌体形态特征并拍照。
如图1-A所示，CYLOB菌落呈2-3mm圆形，边缘光滑，白色不透明；如图1-B所示,该菌株菌体呈短杆状，两端钝圆，大小约为(0.4～0.8)μm×(0.6～1.6)μm。
(2)生理生化特征鉴定
实验方法及具体操作步骤参照文献《伯杰氏鉴定细菌学手册》。
经鉴定，该菌株还有如下特征:革兰氏染色阴性，以周身鞭毛运动，无芽孢形成，不抗酸。兼性厌氧，发酵产酸，产气，可以还原硝酸盐，淀粉酶反应阴性，接触酶实验阳性，甲基红阴性，V-P反应阳性。
(3)16S rDNA分子鉴定
抽提烟草内生细菌CYLOB的基因组DNA，并利用PCR技术以此基因组DNA为模板，进行16S rDNA的扩增并测序。
①引物序列为：F27:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和R1492:5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
②PCR体系建立(50μL)：Template DNA2μL、Forward Primer(10μM)2μL、ReversePrimer(10μM)2μL、ExTaq DNA聚合酶混合试剂25μL、无菌水19μL。
③PCR反应设定程序参数为：94℃预变性5min，94℃变性15s，55℃复性15s，72℃延伸90s，共34个循环，72℃延伸5min，最后放12℃保存。
④PCR结束后，取5μLPCR产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小约1.5kb。将PCR产物回收后送至武汉金开瑞生物科技有限公司进行测序。所测序列长度为1405bp(如SEQ ID No.1所示)。
⑤将获得的菌株的16S rDNA序列进行Blast比对，结果显示序列与菌株CYLOB相似性达99％的有克雷伯氏菌属和肠杆菌属。肠杆菌属的细菌具有运动性，而克雷伯氏菌属的细菌无运动性。细菌的运动性实验证明该菌株是具有运动性的，所以排除了该菌株为克雷伯氏菌的可能。下载相关性较高的16S rDNA序列，再用MEGA5进行NJ法构建系统发育树，结果如图2所示。
结合菌株形态、生理生化特征和16S rDNA序列比对分析，最终确定烟草内生菌CYLOB是一株肠杆菌(Enterobacter sp.)。将其16SrDNA序列在NCBI网站上进行注册，登录号为OP740806。于2022年11月02日将其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号：CCTCC NO:M 20221712。
实施例3烟草内生肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB促生长能力检测
(1)产IAA能力
定量测定时先测定菌悬液的OD600值，然后12000rpm离心3min，取上清液并加入一倍体积Salkowski比色液，避光静置25min，测定溶液的OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积菌悬液中细菌分泌的IAA量。
结果表明，肠杆菌能使Salkowski比色液变成粉红色，产IAA含量为10.4mg/L。
(2)溶磷能力
将肠杆菌接种于Pikovskaya固体培养基中(1L培养基中含0.5g酵母提取物、10g葡萄糖、5g Ca3PO4、0.5g(NH4)2SO4、0.3g KCl、0.3g NaCl、0.03g MgSO 4·7H2O、0.03g MnSO4、0.003g FeSO4·7H2O、18g琼脂，调节pH 7.0-7.5)，于37℃培养3-5天，观察菌落生长情况。
结果显示肠杆菌菌落周围有透明晕圈，表明肠杆菌具有溶磷能力。
(3)产铵态氮能力
将肠杆菌接种于肉汁胨培养基中(10g蛋白胨，5g NaCl，ddH2O补至1L)，37℃培养2天，加萘氏试剂观察颜色变化。
结果显示肠杆菌能使萘氏试剂变红，表明肠杆菌能产生铵态氮。
(4)产嗜铁载体能力
将肠杆菌接种于CAS检测平板中，30℃培养3天后，观察菌落周围有无黄色晕圈。
结果显示肠杆菌菌落出现黄色晕圈，表明肠杆菌有嗜铁载体。
(5)固氮酶活性
将肠杆菌分别接种于无氮培养基Ashby和JNFb中，置37℃培养箱中培养，观察细菌生长情况。
结果显示肠杆菌可使在含有溴百里酚蓝JNFb培养基由绿色变为蓝色，表明肠杆菌有固氮酶活性。
综上所述，烟草内生肠杆菌CYLOB具有产IAA、溶磷、固氮、产铵态氮、产嗜铁载体等多种促进植物生长发育的功能。
实施例4烟草内生肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB生长曲线的测定
将菌株CYLOB活化培养至OD600为1.0，按1％的接种量(为LB培养基的体积1％)转接至100mL(250mL锥形瓶)的含有或不含有尼古丁浓度为4g/L的LB培养基中，于30℃、220r/min条件下培养一周，定时取样，测定OD600 nm的吸光值。设置3个平行实验，用于绘制烟草内生肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB的生长曲线以及菌株CYLOB在尼古丁浓度为4g/L的培养基中的生长情况。
结果如图3所示，在全营养培养基中，菌株CYLOB的OD值在0～42h生长较快，在42h之后OD值保持在2.0左右，此时培养液中菌体含量已到达最高，进入平稳期；而在60h之后，菌株进入衰亡期。
在尼古丁浓度为4g/L的全营养培养基中，菌株CYLOB的OD值在0～12h升高较缓慢，在之后的12h～18h增长较快，在18h开始进入对数增长期；30h之后OD值保持在0.39左右，此时培养液中菌体含量已到达最高，进入平稳期。38h之后，菌株逐渐衰亡。
实施例5烟草内生肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB降解烟碱效果的测定
为了评价本发明菌株对烟草烟碱的降解能力，按1％的接种量将活化好的CYLOB培养肠杆菌接至100mL(250mL锥形瓶)含有4g/L尼古丁浓度LB培养基中，于30℃、220r/min条件下培养一周，定时取样。取样后，发酵液先通过高速离心，12000r/min，10min；取上清再利用0.22μm过滤器去除细菌，进行高效液相色谱(HPLC)检测。以上实验设置三个平行对照，连续测定肠杆菌CYLOB对尼古丁的降解情况。色谱条件为Ultimate LP-C18柱(4.6mm×250mm)，流动相为甲醇(色谱纯)与20mM KH2PO4体积比为5:95，流速为1mL/min，进样量为5μL，检测波长为262nm。
结果如图3所示，烟草内生肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB在4天(96h)内，能将培养基中最初4g/L的尼古丁降低至2.46g/L，降解了1.54g/L尼古丁，降解率为38.5％。结合菌体的生长曲线，结果表明，尼古丁的降解率与菌体的生长量呈正相关。
实施例6烟草内生肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB降解烟碱效果的测定
将烟草种子在穴盘中温室培养，待其长出3～4片叶片后移栽于盆钵并于自然条件下培养。移栽培养15天后将OD600值为0.8的内生肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB菌液注射到烟草植株，每株100μl。实验分一个对照组，2个实验组，每组30株。注射感染细菌15和30天后，测量烟草株高和叶片数量并进行统计分析，使用△△值(实验组△值─对照组△值)评估细菌是否有植物促生作用。△值＝测量时的平均值─注射前的平均值。注射感染细菌后观察生长周期内是否出现病斑或病症以判断内生菌侵染是否具有致病性。注射感染细菌后40天摘下各组后顶部第5张叶片，委托武汉复达检测集团检测烟叶中烟碱含量。
对烟草植株生长情况的观测结果显示，烟草内生菌肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB对烟草植株无明显的致病性。通过注射接种后15和30天检测烟草叶片数和株高的统计分析，与对照组相比，各实验组的△△值＜1或为负值(见表1)，说明这种烟草內生菌在侵染定殖阶段并没有表现出任何植物生长促进作用，它们定值后需要寄主提供营养。
表1注射接种后30天检测烟草叶片数和株高的统计分析
注：C为对照组，未感染任何细菌。表中每组的叶片数和株高为30株烟草苗的平均数。
在肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB侵染烟草40天后检测叶片中尼古丁的含量，结果如图5所示，两个实验组的尼古丁含量分别为119.9μg/g和141.0μg/g，相比较于对照组的276.8μg/g，烟草叶片中尼古丁的含量下降54％。

Claims (5)

1.一株肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221712，保藏日期为2022年11月02日。
2.权利要求1所述的肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB在降解尼古丁中的应用。
3.权利要求1所述的肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB在调整烟草尼古丁含量中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述烟草为烟草活体植株。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过注射的方式使肠杆菌(Enterobacter sp.)CYLOB侵染烟草活体植株，从而降低烟草活体植株中尼古丁的含量。
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