CN115029277A - 一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌 - Google Patents

一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌 Download PDF

Info

Publication number
CN115029277A
CN115029277A CN202210723296.4A CN202210723296A CN115029277A CN 115029277 A CN115029277 A CN 115029277A CN 202210723296 A CN202210723296 A CN 202210723296A CN 115029277 A CN115029277 A CN 115029277A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus
tobacco
soil
bacillus pseudomycoides
bacterial wilt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210723296.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115029277B (zh
Inventor
丁伟
梁辉
张淑婷
江其朋
邓力元
江连强
刘东阳
王勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SICHUAN TOBACCO Corp LIANGSHANZHOU BRANCH
Southwest University
Original Assignee
SICHUAN TOBACCO Corp LIANGSHANZHOU BRANCH
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SICHUAN TOBACCO Corp LIANGSHANZHOU BRANCH, Southwest University filed Critical SICHUAN TOBACCO Corp LIANGSHANZHOU BRANCH
Priority to CN202210723296.4A priority Critical patent/CN115029277B/zh
Publication of CN115029277A publication Critical patent/CN115029277A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115029277B publication Critical patent/CN115029277B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌DW44，分类命名：Bacillus pseudomycoides，保藏编号：CCTCC NO：M 2022676。其菌落呈白色，圆形，边缘光滑凸起有光泽，湿润，半透明。假蕈状芽孢杆菌DW44具有良好的耐酸能力，在pH 4.5‑6.0下的生长速率高于青枯菌。假蕈状芽孢杆菌DW44在pH 4.5和铝离子浓度为2.4mmol/L时的生长速率显著高于青枯雷尔氏菌，对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径分别为10.72mm，在酸性土壤中对烟草青枯病的最高防效可达到75.00％。可充分作为在酸化土壤中拮抗青枯菌，有效防治烟草青枯病的发生。

Description

一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌
技术领域
本发明属于农业微生物防治技术领域，涉及一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌，还涉及其应用。
背景技术
土壤酸化是世界范围内引起土壤退化的主要原因，在集约化农业生产模式中日益突显和严重。当前，土壤酸化已成为一个严重的全球性问题，严重制约着现代农业的可持续发展。近几十年来，中国主要农田、草原和森林也出现了显著的土壤酸化现象，受酸化影响的土地约有2亿公顷，约占中国土地总面积的23％，主要分布在长江以南地区，对我国南方农业生产造成严重影响。国际上通常将土壤酸化划分以下等级：微酸性(pH 6.0-6.5)、适度酸性(pH 5.5-6.0)、强酸性(pH 5.0-5.5)、非常强酸性(pH 4.5-5.0)和极酸性(pH<4.5)。当土壤pH低于5.5时，土壤中的活性铝离子开始从土壤中溶解释放，尤其在土壤pH低于5.0时，土壤中铝离子的含量呈指数水平上升，影响植物的正常健康生长。
青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种典型的土传病害，除了对烟草，还可以对番茄、辣椒等多种经济作物造成毁灭性的损失。田间数据调查发现强酸性土壤可加剧烟草青枯病的发生，并且烟草青枯病的发生与土壤微生物的群落组成存在密切的联系，而土壤pH值的变化会强烈影响土壤微生物的活性和群落结构。然而不同酸化水平下烟草青枯病的发病情况并未见系统研究，土壤酸化及铝离子影响烟草青枯病发生的机制也未见系统深入的研究。因此本研究系统评价了不同土壤酸化水平对烟草青枯病发生的影响，探究了不同酸化水平下根际土壤微生物的群落特征，分析根际微生物的变化与烟草青枯病发生的关系；然后探究了铝离子与烟草青枯病发生的关系，以及土壤中不同铝胁迫水平对烟草细菌群落组成的影响，以期破解不同酸化水平影响烟草青枯病发生的机制。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌，还提供该菌株的相关农业产业化应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌，所述假蕈状芽孢杆菌为DW44，分类命名：Bacillus pseudomycoides，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年5月19日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022676。
进一步，所述的假蕈状芽孢杆菌的菌落呈白色，圆形，边缘光滑凸起有光泽，湿润，半透明。
进一步，所述假蕈状芽孢杆菌在pH 4.5-6.0下的生长速率菌高于青枯菌，具有耐酸能力。
2.上述技术方案中任一项所述的假蕈状芽孢杆菌作为微生物菌剂在拮抗和/或防治青枯雷尔氏菌中的应用。
进一步，应用中的土壤环境为pH4.5-pH6.0的酸性土壤。
进一步，微生物菌剂中假蕈状芽孢杆菌的使用浓度为1×106cfu/mL-1×1012cfu/mL。
进一步，微生物菌剂中假蕈状芽孢杆菌的使用浓度为1×108cfu/mL。
3.上述技术方案中任一项所述的假蕈状芽孢杆菌在作为微生物菌剂用于促进烟株植株生长中的应用。
4.还提供一种微生物菌剂，微生物菌剂的活性成分包含假蕈状芽孢杆菌为DW44。
进一步，所述微生物菌剂中，培养假蕈状芽孢杆菌为DW44，得到菌悬液，为液态的微生物菌剂。
本发明的有益效果在于：本发明从高铝胁迫条件下的烟草根际土壤中分离出110株菌株并提取分离细菌DNA进行测序，再结合前期对烟株根际土壤的细菌群落组成进行分析，最后选定7株耐铝芽孢杆菌菌株，进一步对这7株菌株的耐铝耐酸活性、对青枯菌的拮抗活性评价，以及对烟草青枯病防控效果研究，筛选出两株耐酸、耐铝活性强且对烟草青枯病具有良好防控效果的菌株，假蕈状芽孢杆菌DW44和Bacillus panaciterrae DW68，两株菌在pH 4.5-6.0和铝离子浓度为2.4mmol/L时的生长速率显著高于青枯雷尔氏菌，对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径分别为10.72mm和13.12mm，在酸性土壤中对烟草青枯病的最高防效分别可达到75.00％和83.33％。假蕈状芽孢杆菌DW44和Bacillus panaciterrae DW68菌株，在酸化环境下均可有效增殖，为提升酸性土壤中生物防控效果提供了新的生物材料；对烟草生长也有促生作用。本发明还筛选一株耐铝菌株假蕈状芽孢杆菌DW105，对烟草生长有可显著的促生作用以及一定的烟草青枯病的防效作用，相较于空白对照，DW105号菌株处理的烟草根鲜重、根上部鲜重、根干重和根上部干重分别增加了128.36％、83.42％、136.77％和97.90％。也可将三株菌株合成群落制备复合菌剂协同使用，使合成的群落具有耐酸、耐铝、抗病以及促生的综合特性，为酸性土壤青枯病的防治和/或烟草植株生长提供新的思路。
保藏信息
菌株名称：DW44，分类命名：Bacillus pseudomycoides，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年5月19日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022676。
菌株名称：DW68，分类命名：Bacillus panaciterrae，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年5月19日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022677。
菌株名称：DW105，分类命名：Bacillus pseudomycoides，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年5月19日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022678。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为试验处理流程示意图。
图2为不同铝离子浓度对烟草青枯病发生的影响。
图3为不同铝离子浓度处理下青枯病发病率。
图4为不同铝离子浓度处理下烟草根际土壤中青枯菌的含量。
图5为各芽孢杆菌对青枯菌生长的影响。
图6为分离的各芽孢杆菌菌株的耐铝活性能力。
图7为分离的各芽孢杆菌菌株的耐酸能力。
图8为分离的各芽孢杆菌菌株对烟草的促生长能力。
图9为分离的各芽孢杆菌菌株对烟草青枯病发生的影响。
图10为各菌株的16S rDNA进化树。
图11为A44号菌株菌落形态及细胞形态。
图12为A68号菌株菌落形态及细胞形态。
图13为A105号菌株菌落形态及细胞形态。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1、供试土壤于2019年5月采集自重庆市彭水苗族土家族自治县润溪乡樱桃井村(经度：107°57.913′，纬度：29°10.008′，海拔：1315m)连作5年以上且不发生青枯病的土壤，土壤类型为粉砂壤土。采集10～20cm土层的土壤，土壤样品通过2mm的筛网过滤，去除大的土壤颗粒和植物根部组织和其他杂质，过筛后的土壤保存在4℃的冰箱中用于后续的试验。
2、供试菌株与烟草品种：本试验使用的是分离自重庆市彭水县白果坪发病烟株的CQPS-1青枯雷尔氏菌(R.solanacearum)菌株，该菌株为强致病力菌株。供试烟草为本氏烟(Nicotiana benthamiana)。
3、供试培养基：
S-LB培养基：用于菌株的分离培养，蛋白胨0.5g/L，酵母粉0.2g/L，氯化钠10g/L，加入到pH 7.0的土壤浸提液中，将pH调节至4.5，灭菌备用。
土壤浸提液的制备：取200g采集于西南大学植保园的中性土，加入到1000mL的蒸馏水中，150rpm震荡30min，10000rpm离心10min，取上清液过0.45μm的滤膜。
B液体培养基：细菌蛋白胨10g/L，酵母粉1g/L，酪蛋白水解物1g/L，121℃灭菌20min备用。
B固体培养基：细菌蛋白胨10g/L，酵母粉1g/L，酪蛋白水解物1g/L，琼脂粉15g/L，121℃灭菌20min备用。
将采集的彭水植烟健康土，平均分成4份，每份10kg，分别添加1L 2.5mmol/L、5mmol/L和10mmol/L硫酸铝溶液，使土壤铝离子浓度为低铝离子浓度LAl，中铝离子浓度MAl以及高铝离子浓度HAl，以30mmol/L硫酸钠溶液作为对照，通过添加去离子水使土壤持水量保持在60％左右，每隔一个月处理一次，连续处理6次后，每个处理取500g土壤风干保存，用于土壤理化性质检测。
将育苗盘培育1个月的本氏烟洗净根部基质分别移栽入上述处理土壤中，每个处理4个重复，每个重复8株烟，放入温室25℃±2℃，湿度75％，14h光照，10h黑暗培养。培养14天后，拔除烟株取烟株根际土，每个处理4个重复，将采集的土壤储存于-20℃直至用于土壤微生物DNA提取，检测土壤青枯菌含量。
将剩余的土壤移栽烟苗，每个处理3个重复，每个重复8株烟，7d后每株接种10mL，1×108CFU/mL的青枯菌，14d后调查不同处理烟草青枯病发生的情况。试验处理流程如图1所示。不同铝离子浓度对烟草青枯病发生的影响如图2所示，高铝胁迫对烟草的生长无显著影响，中铝浓度胁迫(MAl)处理的烟草青枯病的发病率最高，显著高于其他处理，与对照、LAl和HAl相比，青枯病发病率分别增加了69.80％、77.95％和52.15％(图3所示)。与青枯病发病率变化规律一致，MAl处理的烟草根际土壤中青枯菌的含量显著高于对照(P<0.001)、LAl(P＝0.0005)和HAl(P<0.001)，MAl处理烟草根际土壤中青枯菌的平均含量分别是对照、LAl和HAl的1.15倍、1.11倍和1.14倍(图4)。
采集HAl处理土壤种植的健康烟株的根际土壤，4℃低温保存至菌株分离完成。取1g根际土加入50mL S-LB液体培养基中制成悬浮液，并加入0.5mL 0.1mol/L的硫酸铝母液使其终浓度为1mmol/L，180rpm 28℃震荡培养12h，静置30min取含菌上清液1mL稀释至10-3、10-4浓度涂布于含终浓度为1mmol/L硫酸铝的B固体培养基上，28℃培养3～7d，直到有明显的菌落生成。挑取单菌落，平板划线法进行分离纯化，分离划线4次后将分离的菌株在25％的甘油中进行-80℃保存。
从高铝胁迫处理的健康烟株根际土壤中共分离出110株菌株，利用细菌基因组提取试剂盒提取分离细菌DNA，利用27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(CTACGGCTACCTTGTTACGA)扩增细菌16S rRNA基因，PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物送华大基因测序公司进行测序。将测序结果用BLAST软件与GenBank数据库中的序列进行同源性比较。前期对烟株根际土壤的细菌群落组成进行分析发现，芽孢杆菌属在控制烟草青枯病发生上发挥着重要的作用，并且芽孢杆菌属在高铝胁迫的烟草根际土壤中显著富集，本发明为了探究是否存在耐铝性的芽孢杆菌可以控制青枯病的发生，这里只展示筛选后的其中7株芽孢杆菌后续的研究内容。
实施例2分离菌株的分子鉴定
选取相关菌种的16S rRNA基因序列，采用MEGA4.0软件进行系统进化关系分析，按照Neighbor-joining法构建系统进化树。
将从高铝浓度处理的健康烟株根际土壤样品中分离的菌株的基因组DNA为模板扩增16SrDNA片段，将扩增的PCR片段进行测序，将测序结果通过在NCBI中与GenBank中的序列进行Blast比对，共获得了7株菌落形态不同的芽孢杆菌，比对结果如表1所示，A44、A68和A73的16S rDNA序列比对同源性均达到了100％，A64的同源性为99.72％，A75、A97和A105的同源性均为99.93％，所有菌株的16S rDNA序列比对同源性菌均达到了99％以上。结合系统进化树分析图10，最终将A44、A64、A97和A105鉴定为假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)，A68鉴定为Bacillus panaciterrae，A73鉴定为Bacillusproteolyticus，A75鉴定为蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)。
表1分离菌株16S rDNA序列比对结果
Figure BDA0003712436050000051
Figure BDA0003712436050000061
图11为A44号菌株菌落形态及细胞形态，在固体B培养基上，A44号菌株菌落呈白色，圆形，边缘光滑凸起有光泽，湿润，半透明。扫描电镜观察发现A44号菌株呈短杆状，有鞭毛，革兰氏染色为阳性。
图12为A68号菌株菌落形态及细胞形态，由图12可知，在固体B培养基上，A68号菌株菌落呈白色，圆形，边缘光滑凸起有光泽，湿润，不透明。扫描电镜观察发现A68号菌株呈细杆状，有鞭毛，革兰氏染色为阳性。
图13为A105号菌株菌落形态及细胞形态，由图13可知，在固体B培养基上，A105号菌株菌落呈白色，圆形，扁平，边缘光滑有光泽，湿润，不透明。扫描电镜观察发现A105号菌株呈细杆状，有鞭毛，革兰氏染色为阳性。
将菌株A44命名为DW44，分类命名：Bacillus pseudomycoides，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年5月19日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022676。
将菌株A68命名为DW68，分类命名：Bacillus panaciterrae，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年5月19日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022677。
将菌株A105命名为DW105，分类命名：Bacillus pseudomycoides，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年5月19日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022678。
实施例3芽孢杆菌菌株对青枯菌生长抑制的影响
采用平板拮抗的方法评价耐铝芽孢杆菌对青枯菌生长抑制的影响：将青枯菌稀释至1×107CFU/mL，取200μL均匀涂布在B固体培养基平板上，然后取2μL不同芽孢杆菌菌液滴在平板中央，以无菌水作为阴性对照，以0.5mg/mL的庆大霉素(GM)作为阳性对照，每个处理3个重复，将平板置于30℃恒温培养箱中培养24h，观察不同处理的抑菌圈大小。
利用平板拮抗的方法分析芽孢杆菌对青枯菌生长的影响结果如表2和图5所示，结果表明，分离的7株芽孢杆菌对青枯菌的生长均有一定的抑制作用，A73号菌株的抑菌圈直径最大，为16.24mm，其次为A68号菌株(13.12mm)，抑菌圈直径菌显著高于A44、A64、A75和A105号菌株。
表2芽孢杆菌对青枯菌CQPS-1的抑菌效果
Figure BDA0003712436050000071
实施例4芽孢杆菌耐铝活性、耐酸活性评价
将芽孢杆菌菌株和青枯菌CQPS-1菌株分别加入终浓度为1.2mmol/L的硫酸铝和3.6mmol/L的硫酸钠B液体培养基中，以无菌水作为阴性对照，每个处理3个重复，30℃180rpm震荡培养，每隔2h取1mL混合菌液检测OD600nm吸光度值，共检测24h，绘制不同菌株在不同铝浓度下的生长曲线。
分离的不同的芽孢杆菌菌株的耐铝活性能力如图6和表3所示，在清水对照1(Control 1)和硫酸钠对照2(Control 2)中，分离的芽孢杆菌进入对数期的时间均早于青枯菌，说明分离的芽孢杆菌在培养基中的适应期要早于青枯菌。在2.4mmol/L铝离子处理中(2.4mmol/L Al3+)，青枯菌的生长受到显著的抑制，分离的芽孢杆菌的耐铝能力均强于青枯菌，其中A73号菌的耐铝能力最强，其次为A64号菌和A105号菌，A68次之。
表3不同菌株在液体B培养基中24h的耐铝活性
Figure BDA0003712436050000072
将B液体培养基用盐酸分别调节pH值为4.5、5.0和6.0，灭菌后分别接入分离的芽孢杆菌菌株和青枯菌CQPS-1菌株，每个处理3个重复，30℃180rpm震荡培养，每隔2h取1mL混合菌液检测OD600nm吸光度值，共检测24h，绘制不同菌株在不同pH下的生长曲线。
分离的不同的芽孢杆菌菌株的耐酸能力如图7和表4所示，在pH 6.0的条件下A44、A64、A73和A75的生长速率要比青枯菌快，A97的生长速率一致，A68进入对数期的时间比青枯菌晚4个小时；在pH 5.0的条件下，芽孢杆菌的生长速率均快于青枯菌，最终的生物量A68和A73菌株与青枯菌无显著差异；在pH 4.5的条件下，除A73号菌的生长被完全抑制，说明A73号菌的耐酸能力最差，其他芽孢菌株在pH 4.5的环境下的生长速率菌显著高于青枯菌，具有一定的耐酸能力。酸化土壤一般为pH5.0-5.5，本研究挑选的菌株在pH4.5-6.0条件下均能存活，能在酸化土壤中定殖，并发挥其生物学作用。
表4不同菌株在液体B培养基中24h的耐酸活性
Figure BDA0003712436050000081
实施例5芽孢杆菌菌株对烟草生长的影响
将在育苗基质中培育30天的云烟87烟苗用去离子水洗净根部基质，然后移栽入不发生青枯病的土壤中，25℃±2℃光照12h，20℃±2℃黑暗12h，湿度75％温室条件下进行培养，一周后分别接入10mL 1×108cfu/mL，继续培养14天以后洗净根部的土壤，用吸水纸吸干水分，分别检测不同处理的烟株根部鲜重和根上部鲜重，然后在恒温干燥箱中105℃干燥6h，称量不同处理烟株的根部干重以及根上部干重。
在土壤中外源添加分离的芽孢杆菌菌株，评价分离的芽孢杆菌菌株对烟草的生长是否存在促生作用，结果如表5和图8所示，结果表明，与对照相比，A105号菌可显著增加烟草的根部鲜重(图8中A)和干重(图8中C)以及根上部鲜重(图8中B)和干重(图8中D)；A64号菌显著增加了烟草的根上部鲜重和干重以及根干重；A68号菌显著增加了根部干重。综合评价可得A105号菌可显著促进烟草的生长。相较于空白对照，A105号菌株处理的烟草根鲜重、根上部鲜重、根干重和根上部干重分别增加了128.36％、83.42％、136.77％和97.90％。
表5各处理后的植株生物量
Figure BDA0003712436050000082
Figure BDA0003712436050000091
实施例6芽孢杆菌菌株对烟草青枯病发生的影响
挑取在固体B培养基上活化的芽孢杆菌的单菌落，接入至20mL无菌液体B培养基中，在恒温震荡摇床上30℃180rpm震荡培养至OD600nm＝1.0(1×109CFU/mL)备用。
将在育苗基质中培育30天的云烟87烟苗用去离子水洗净根部基质，然后移栽入不发生青枯病的土壤中(pH 5.68)，25℃±2℃光照12h，20℃±2℃黑暗12h，湿度75％温室条件下进行培养，一周后分别接入10mL OD600nm＝0.1(1×108CFU/mL)的芽孢杆菌菌悬液，每个处理3个重复，每个重复7株烟，24h后每株烟分别接入10mL OD600nm＝0.01(1×107CFU/mL)的青枯菌菌悬液，然后放入30℃±2℃光照12h，25℃±2℃黑暗12h，湿度80％温室条件下继续培养，每天调查青枯病的发病情况，记录病害等级调查，病情指数和发病率。
病害调查参照室内烟草青枯病病情分级标准进行：
0级：烟株无发病症状；
1级：烟株1-2片叶萎蔫，或烟株茎基部褪绿条斑占整株的1/3以下；
2级：烟株2-3片叶萎蔫，或烟株茎基部褪绿条斑占整株的1/3–1/2之间；
3级：烟株1-2片健康叶，或烟株茎基部褪绿条斑占整株的1/2–2/3之间；
4级：整株萎蔫枯死，或烟株茎基部褪绿条斑占整株的2/3以上。
病害的严重程度依据病情分级计算病情指数，以发病株数计算发病率，公式如下：
Figure BDA0003712436050000092
Figure BDA0003712436050000093
表6为各菌株对烟草青枯病发生的发病率，表7为各菌株对烟草青枯病发生的病情指数，不同芽孢杆菌菌株对烟草青枯病发生的影响如图9所示，其中左图为发病率，右图为发病的病情指数。研究结果表明，A68号菌和A44号菌可以显著延迟烟草青枯病的发生，接菌后的第25天A68号菌开始发病，相较于对照，青枯病发生推迟了12天；A44号菌在第26天开始发病，相较于对照青枯病发生推迟了13天。A68号菌对烟草青枯病的防控效果最好，其次为A44号菌，调查到40天时，A68号和A44号菌的烟草青枯病发病率分别为6.67％和10.00％，相对防效分别为83.33％和75.00％。A105号可促进烟草的生长，相对于A68号和A44号菌株对烟草青枯病的防效稍微弱一点，可以单独做促进烟草生长的生物菌剂使用，也可以和其他对青枯菌有抑制作用的菌株做复配菌剂用于促进烟草的生长和防护烟草青枯病。
表6各菌株对烟草青枯病发生的发病率
Figure BDA0003712436050000101
Figure BDA0003712436050000111
表7为各菌株对烟草青枯病发生的病情指数
Figure BDA0003712436050000112
Figure BDA0003712436050000121
Figure BDA0003712436050000131
本发明分离的耐酸耐铝芽孢杆菌主要有四种，假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、Bacillus panaciterrae、Bacillus proteolyticus和蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)，有研究表明，假蕈状芽孢杆菌可以活化土壤中的结合态钾，可以用作解钾生物肥料，同时假蕈状芽孢杆菌和云母肥料混合施用可替代氯化钾肥来提升土壤中钾的有效性并增加植物对钾元素的吸收。此外研究还表明假蕈状芽孢杆菌(B.pseudomycoides C6)可有效去除水中的铜离子，阻止大量的铜进入植物而造成铜毒害。本发明筛选的鉴定出的假蕈状芽孢杆菌A105(Bacillus pseudomycoides A105)菌株对烟草表现出促生作用，可能与促进烟草植株钾的吸收有关。除了促生作用之外，研究还发现假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides DSM 12442)具有合成抗生素羊毛硫细菌素的基因簇，并且在该菌株的细胞洗涤提取物中可检测到具有抗革兰氏阳性细菌活性的抗菌物质的产生，经鉴定是一种羊毛硫细菌素抗菌肽。本发明研究分离鉴定的假蕈状芽孢杆菌菌株首次发现对青枯菌有一定的拮抗作用，且假蕈状芽孢杆菌A44菌株对烟草青枯病具有良好的防治效果，耐酸耐铝性强，可作为烟草青枯病的生防菌进行深入研究。
本发明研究分析的Bacillus panaciterrae A68菌株虽然在酸性(pH 4.5)和铝胁迫条件下其生长速率比其他芽孢杆菌菌株较慢，但是对烟草青枯病表现出良好的防治效果。研究表明Bacillus proteolyticus GT2具有溶磷作用，可促进水稻的生长。
高通量测序技术的发展为植物与土壤微生物互作的研究提供了一种解决方案，根据测序数据，可初步明确土壤微生物的群落组成，但高通量测序达到的微生物群落组成都是相对结果，要想验证其功能，需要将功能菌群进行分离，通过与植物互作验证其功能。在Liu Y.X.,Qin Y.,Bai Y.Reductionist synthetic community approaches in rootmicrobiome research[J].Current Opinion in Microbiology,2019,49:97-102.中表明合成群落(SynCom)方法可以从功能和机制上洞察植物如何调节它们的微生物群落，以及微生物群落反过来如何影响植物的生长和健康，而合成群落的可重复性，使未来的细菌群落建立和功能研究在实验室条件下即可实现成为可能。Berendsen等(Berendsen R.L.,Vismans G.,Yu K.,Song Y.,de Jonge R.,Burgman W.P.,Burmolle M.,Herschend J.,Bakker Pahm,Pieterse C.M.J.Disease-induced assemblage of a plant-beneficialbacterial consortium[J].ISME Journal,2018,12(6):1496-1507.)研究发现，分离的有益微生物，单株菌株对植物的生长和病原菌的数量无显著影响，当将三株具有协同作用的菌株混合施用时，植物中病原菌的数量显著下降，而植物表现出显著的促生作用。同样的，Lee等(Lee S.M.,Kong H.G.,Song G.C.,Ryu C.M.Disruption of Firmicutes andActinobacteria abundance in tomato rhizosphere causes the incidence ofbacterial wilt disease[J].ISME Journal,2020,15(1):330-347.)通过高通量测序结果，分离了与抑制番茄青枯病发生有关的菌株，菌株单独使用对番茄青枯病的防治效果不显著，而合成群落可显著降低番茄青枯病的发生。综上所述，本发明研究筛选出7株芽孢杆菌，尤其是具有耐酸耐铝活性强且对烟草青枯病具有良好防治效果的菌株假蕈状芽孢杆菌A44(Bacillus pseudomycoides A44)和Bacillus panaciterrae A68，以及一株对烟草生长有促生作用的耐铝菌株假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides A105)，可根据这些菌株的特性合成群落制备复合菌剂使用，使合成的群落具有耐酸、耐铝、抗病以及促生的综合特性，为酸性土壤青枯病的防治和/或烟草植株生长提供新的思路。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌，其特征在于，所述假蕈状芽孢杆菌为DW44，分类命名：Bacillus pseudomycoides，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年5月19日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022676。
2.根据权利要求1所述的假蕈状芽孢杆菌，其特征在于，所述假蕈状芽孢杆菌的菌落呈白色，圆形，边缘光滑凸起有光泽，湿润，半透明。
3.根据权利要求1所述的假蕈状芽孢杆菌，其特征在于，所述假蕈状芽孢杆菌在pH4.5-6.0下的生长速率菌高于青枯菌，具有耐酸能力。
4.权利要求1～3任一项所述的假蕈状芽孢杆菌作为微生物菌剂在拮抗和/或防治青枯雷尔氏菌中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，应用中的土壤环境为pH4.5-pH6.0的酸性土壤。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，微生物菌剂中假蕈状芽孢杆菌的使用浓度为1×106cfu/mL-1×1012cfu/mL。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，微生物菌剂中假蕈状芽孢杆菌的使用浓度为1×108cfu/mL。
8.权利要求1～3任一项所述的假蕈状芽孢杆菌在作为微生物菌剂用于促进烟株植株生长中的应用。
9.一种微生物菌剂，其特征在于，微生物菌剂的活性成分包含权利要求1-3任一项所述的假蕈状芽孢杆菌。
10.根据权利要求9所述的微生物菌剂，其特征在于，培养权利要求1-3任一项所述的假蕈状芽孢杆菌，得到菌悬液，为液态的微生物菌剂。
CN202210723296.4A 2022-06-24 2022-06-24 一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌 Active CN115029277B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210723296.4A CN115029277B (zh) 2022-06-24 2022-06-24 一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210723296.4A CN115029277B (zh) 2022-06-24 2022-06-24 一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115029277A true CN115029277A (zh) 2022-09-09
CN115029277B CN115029277B (zh) 2023-08-22

Family

ID=83127771

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210723296.4A Active CN115029277B (zh) 2022-06-24 2022-06-24 一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115029277B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117431191A (zh) * 2023-12-19 2024-01-23 中国农业大学 一种假蕈状芽孢杆菌hdcp1及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160073640A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-17 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising recombinant bacillus cells and another biological control agent
CA2961505A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-24 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising recombinant bacillus cells and a fungicide
WO2019018768A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 Spogen Biotech Inc. BIOACTIVE POLYPEPTIDES FOR PLANT PROTECTION, GROWTH AND PRODUCTIVITY ENHANCEMENTS
CN111315889A (zh) * 2017-09-08 2020-06-19 生命技术公司 提高同源重组的方法和其组合物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160073640A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-17 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising recombinant bacillus cells and another biological control agent
CA2961505A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-24 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising recombinant bacillus cells and a fungicide
WO2019018768A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 Spogen Biotech Inc. BIOACTIVE POLYPEPTIDES FOR PLANT PROTECTION, GROWTH AND PRODUCTIVITY ENHANCEMENTS
CN111315889A (zh) * 2017-09-08 2020-06-19 生命技术公司 提高同源重组的方法和其组合物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
程志强;雷少楠;熊娟;马荣琴;陈优优;李容丹;路晶晶;吴寒;龚玉杰;田宝玉;: "番茄根内生芽孢杆菌的多样性和系统发育研究", 中国农学通报, no. 08 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117431191A (zh) * 2023-12-19 2024-01-23 中国农业大学 一种假蕈状芽孢杆菌hdcp1及其应用
CN117431191B (zh) * 2023-12-19 2024-03-12 中国农业大学 一种假蕈状芽孢杆菌hdcp1及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115029277B (zh) 2023-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115029276B (zh) 一株烟草青枯菌耐酸性拮抗菌及其应用
CN109207404B (zh) 暹罗芽孢杆菌yj15及其应用
CN107164285B (zh) 一株枯草芽孢杆菌bbd012及防治番茄病害中的应用
CN111925956B (zh) 一种具有产碱、钝化重金属镉功能的高地芽孢杆菌及其应用
CN114196591B (zh) 一种对重金属镉具有钝化作用的黄质中华单胞菌菌株ky592及其应用
CN114875016B (zh) 一种适合荧光假单胞菌的制剂化载体及其菌剂
CN108795830B (zh) 一种埃吉类芽孢杆菌（Paenibacilluselgii）SWL-W8及其应用
CN115747093B (zh) 一株耐盐芽胞杆菌及其应用
CN110484478A (zh) 一种枯草芽孢杆菌jz2-1-12及其应用
CN115927034A (zh) 一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用
Silva et al. Survival of Xanthomonas campestris pv. campestris in the phyllosphere and rhizosphere of weeds
CN114940958A (zh) 一株暹罗芽孢杆菌、制备的微生物菌剂及其应用
CN115029277B (zh) 一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌
CN115161230B (zh) 一株耐酸促生长的芽孢杆菌
CN109169712B (zh) 一种复合生防菌剂及其制备方法和应用
CN114657097A (zh) 一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用
Hirsch et al. Isolation of beneficial bacteria from strawberry (Fragaria x ananassa, Duch). Potentialities for fungal disease control and plant growth promotion
CN115948287B (zh) 一株耐受重金属铜和锌的链霉菌hg2-8-2及其应用
CN114990020B (zh) 一种生防菌株及其应用
CN114107123B (zh) 一株剑菌及其应用
CN115927046A (zh) 一种金钗石斛内生皮尔瑞娥类芽孢杆菌及其制备方法
CN116179640B (zh) 一种高效筛选香蕉枯萎病拮抗菌的方法
Yin et al. Effects of grafting on rhizosphere microorganisms of eggplants
CN116064320B (zh) 一株降解烟碱的烟草内生肠杆菌cylob及其应用
CN111117936B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌tba03及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant