CN114990020B

CN114990020B - 一种生防菌株及其应用

Info

Publication number: CN114990020B
Application number: CN202210689788.6A
Authority: CN
Inventors: 游景茂; 唐涛; 王帆帆; 段媛媛; 郭晓亮; 郭杰
Original assignee: INSTITUTE OF CHINESE HERBAL MEDICINES HUBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF CHINESE HERBAL MEDICINES HUBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2022-06-17
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2042-06-17
Also published as: CN114990020A

Abstract

本发明公开了一种生防菌株，属于生物防治领域，所述生防菌株为贝莱斯芽孢杆菌LT1，于2020年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2020023。本发明还提供了贝莱斯芽孢杆菌LT1的生防菌剂，该菌剂可应用于防治植物白绢病，对白绢病菌菌丝具有明显的抑制作用。本发明将该菌剂应用于防治黄连白绢病，同时还可以提高黄连药效成分合成基因的表达，提升土壤微生物群落的多样性，提高黄连产量和质量。

Description

一种生防菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物防治领域，具体涉及一种生防菌株及其应用。

背景技术

齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起的作物白绢病是一种毁灭性的土传病害，该菌无性态为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)，有性态为罗氏阿太菌(Atheliarolfsii(Curzi)Tu.&Kimbrough.)。该菌主要以菌核在土壤中越冬，也能以菌丝体在种苗或病残体上越冬，第二年环境适宜，菌核作为初侵染源萌发形成菌丝，然后侵染寄主，寄主上的菌丝不断产生菌核，随农事操作、水流、害虫活动进行传播造成再侵染。该菌也可以伴随繁殖体传播，如杨广玲发现花生白绢病菌可以借助种子和种壳调运、雨水飞溅、田间灌溉以及昆虫活动等进行传播。在适宜条件下，该菌也可以从菌核萌发成子囊盘，释放出子囊孢子，借助风力进行传播，感染其他健康植株。

齐整小核菌主要侵染药用植物根茎部位，造成根腐或者茎腐。发生初期，首先造成染病部位皮层变为黑褐色，环境适宜时，染病部位逐步扩大，可见白色菌丝在须根之间缠绕相连，随着菌丝的生长，菌丝可突破土壤表层。随着侵染加重，植株根茎部皮层腐烂，影响营养物质、水分等传输，最终导致植株枯死。侵染末期，在茎基部及土壤表层可见菜籽样菌核。中药材白绢病目前被广泛报道，黄连白绢病一般8月为发病高峰期，田间发病率超过30％，田间菌核萌发产生菌丝，从黄连茎基部往上缠绕，菌丝侵染的部位初期出现水浸状病斑，植株开始枯黄，最后枯死，在菌丝老熟后产生红褐色油菜籽状的菌核。中药材艾被白绢病菌侵染后，首先在茎基部与土壤交界处，出现白色菌丝，茎部坏死灶呈深褐色，地上叶片变黄，随着病情发展，植株变枯。白绢病菌侵染中药材柳叶白前后，首先在茎基部形成小的、水浸泡状凹陷病变，当温湿度适宜时，大量白色菌丝覆盖在茎基部。后期在受感染的基部茎和植株周围的土壤表面会产生大量的白色至褐色菌核。白绢病菌侵染中药材乌头后，首先在茎基部和侧根表面，形成白色菌丝，后期产生大量褐色菜籽样菌核。

目前齐整小核菌侵染导致的中药材白绢病对全国多种中药材的产量和品质造成了较大影响。种植户为了防治该病，一般选择喷施化学药剂进行白绢病防除，但这一方面增加了白绢病菌的抗药性，杀灭大量有益微生物，另一方面也增加了药材和土壤的农药残留，污染了土壤、水等生态环境。因此，为了保证药材的产量和品质，十分有必要利用生物防治的方法防治白绢病。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种生防菌株，为贝莱斯芽孢杆菌LT1，可用于防治植物白绢病，对白绢病菌菌丝具有明显的抑制作用。

本发明提供了一种生防菌株，所述生防菌株为贝莱斯芽孢杆菌LT1，于2020年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2020023。

本发明提供了上述生防菌株在防治植物白绢病中的应用。

本发明提供了一种生防菌剂，包括贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵液、贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液、贝莱斯芽孢杆菌LT1菌体悬液中的一种或几种。

优选的，菌剂中贝莱斯芽孢杆菌LT1总浓度为1×10⁸～9×10¹⁰CFU/mL。

本发明还提供了上述菌剂的制备方法，将贝莱斯芽孢杆菌LT1接种于液体培养基中进行有氧发酵，得到发酵液。

优选的，发酵液经离心过滤得到发酵滤液。

优选的，发酵液离心过滤后，菌体部分加入无菌水制得菌体悬液。

本发明还提供了上述菌剂在防治植物白绢病中的应用。

本发明还提供了上述菌剂在提高黄连产量和/或质量中的应用。

优选的，所述菌剂使用剂量为80～120mL/株。

与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果如下：

本发明所述生防菌株对白绢病菌的抑制率达78.41％，与化学药剂的功效相当，但无化学农药的弊端，也不会导致致病菌产生抗药性，种植户可以不用化学农药或减少化学农药使用量和使用频度。并且菌剂制作简单且成本低，无毒、无害、无环境污染，有利于安全有效的控制植物白绢病。

本发明所述生防菌株来源于黄连根际土壤，可与黄连自身循环系统兼容性好，可用于安全有效的控制黄连白绢病。并且本发明所述贝莱斯芽孢杆菌LT1菌剂有利于改良种植土壤，增加土壤中的微生物多样性，同时还可以提高黄连药效成分合成基因的表达，对黄连具有增产增效的功能，可为农民增加收入。

贝莱斯芽孢杆菌LT1(拉丁名Bacillus velezensis LT1)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2020023，保藏日期为2020年1月7日。

附图说明

图1：贝莱斯芽孢杆菌LT1的形态学特征；

图2：贝莱斯芽孢杆菌LT1与黄连白绢病菌平板对峙抑菌试验；

图3：pH对贝莱斯芽孢杆菌LT1生长的影响；

图4：温度对贝莱斯芽孢杆菌LT1生长的影响；

图5：培养时间对贝莱斯芽孢杆菌LT1生长的影响；

图6：菌株LT1发酵滤液对白绢病菌菌丝的抑制作用；

图7：不同温度对菌株LT1发酵滤液的影响；

图8：不同酶对菌株LT1发酵滤液的影响；

图9：扫描电镜观察白绢病菌LC1菌丝；

图10：透射电镜观察白绢病菌LC1菌丝；

图11：不同萃取剂对芽孢杆菌LT1发酵滤液影响；

图12：菌株LT1脂肽类成分MALDI-TOF-MS光谱图；

图13：SQvsLC1差异基因MA图(A)和火山图(B)；

图14：菌株LT1发酵滤液胁迫下白绢病菌细胞膜相关基因表达分析；

图15：菌株LT1发酵滤液胁迫下白绢病菌细胞壁相关基因表达分析；

图16：芽孢杆菌LT1对黄连药效成分合成基因表达的影响；

图17：黄连根际微生物群落物种韦恩图。

具体实施方式

本发明提供了一种生防菌株，所述生防菌株为贝莱斯芽孢杆菌LT1，是从健康的中药材黄连根际土壤分离得到的，通过鉴定证明其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，于2020年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2020023，保藏单位地址为：中国武汉，武汉大学。

本发明还提供了贝莱斯芽孢杆菌LT1在防治植物白绢病中的应用，所述植物优选为中药材，所述中药材更优选为黄连、艾、柳叶白前、乌头。本发明发现贝莱斯芽孢杆菌LT1可以导致白绢病菌菌丝膨大畸形，匮竭和原生质泄露，从而达到对白绢病病原菌的良好抑制效果，优选的，本发明对植物白绢病菌的抑制率可达78.41％。

本发明还提供了一种生防菌剂，包括贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵液，贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液和贝莱斯芽孢杆菌LT1菌体悬液。

本发明所述菌剂中含有生防菌株贝莱斯芽孢杆菌LT1，所述菌剂中贝莱斯芽孢杆菌LT1总浓度优选为1×10⁸～9×10¹⁰CFU/mL，更优选为1×10⁹～10×10⁹CFU/mL。

本发明还提供了所述生防菌剂的制备方法。

本发明所述贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵液的制备方法包括：将贝莱斯芽孢杆菌LT1接种于液体培养基中进行有氧发酵，得到发酵液。作为一种可选的实施方式，LT1菌株活化，然后接种于LB液体培养基中获得发酵种子液，再将发酵种子液接种于LB液体培养基得到发酵液。所述培养条件优选为150～300rmp、25～30℃，更优选为200rmp、28℃。

本发明所述贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液为贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵液经离心过滤得到的发酵滤液。作为一种可选的实施方式，将发酵液置于4℃条件下，8000～12000rmp离心15～25min，细菌过滤器(0.22μm)过滤上层发酵液，得到发酵滤液。所述离心条件更优选为10000rmp离心20min。

本发明所述贝莱斯芽孢杆菌LT1菌体悬液为贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵液离心过滤后，菌体部分加入无菌水制得菌体悬液。作为一种可选的实施方式，将发酵液置于4℃条件下，8000～12000rmp离心15～25min，细菌过滤器(0.22μm)过滤上层发酵液，用无菌水将菌体洗涤2～3次，加入等体积无菌水制成菌体悬液。本发明将发酵滤液、菌体悬液置于4℃条件下保存。

本发明还提供了贝莱斯芽孢杆菌LT1菌剂在防治植物白绢病中的应用，对植物白绢病有预防和治疗的作用，所述植物优选为中药材，最优选为黄连。

本发明还提供了贝莱斯芽孢杆菌LT1菌剂在提高黄连产量和/或质量中的应用，菌株LT1可提高黄连药效成分合成基因的表达量，增加黄连根际土壤微生物的多样性，对黄连的根茎大小和药用成分含量均有提高。

本发明还提供了贝莱斯芽孢杆菌LT1菌剂的使用剂量为80～120mL/株，优选为90～110mL/株，更优选为100mL/株。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、贝莱斯芽孢杆菌LT1的分离筛选

LT1菌株分离于湖北省恩施州利川市健康黄连根际土壤中。取3年生健康黄连根际土1g，装入40mL无菌离心管中，加入9mL无菌水，充分混合后，吸取混合液按照1:10稀释5次，涂布于固体LB平板上，28℃，培养72小时，挑取单菌落纯化培养。取直径为9cm的PDA平板，在距离平板两端距离边缘0.5cm处涂布细菌菌落，直径约1cm，平板中间放置白绢病菌菌饼。设置空白对照，3天后待空白对照长满皿，测量细菌菌落外缘到白绢菌菌丝的距离，重复3次，选取对白绢菌菌丝生长抑制最强的细菌，即为目标菌株LT1。

目标菌株LT1，经过生理生化检测及分子鉴定证明其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，于2020年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2020023，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

2、贝莱斯芽孢杆菌LT1的形态特征

将LT1菌株于LB培养基上28℃培养2d。经检测和观察，LT1菌株在LB培养基上单菌落圆形，表面粗糙，白色，边缘规则(见图1-A)，两端钝圆、细胞壁光滑，大小为0.3μm×0.39μm～0.75μm×1.53μm。革兰氏染色呈显紫色(见1-B)，即为革兰氏阳性菌。扫描电镜观察菌体为杆状(见图1-C)。

3、贝莱斯芽孢杆菌LT1的鉴定

基于API 20E试剂盒生理生化检测，结果证明LT1菌株对β-半乳糖苷酶、吲哚产生、3-羟基丁酮、葡萄糖氧化、甘露醇氧化、苦杏仁苷氧化、阿拉伯糖氧化和蔗糖氧化反应为阳性，H₂S产生和明胶酶等13个反应为阴性。

表1芽孢杆菌菌株LT1生理生化特性–酶活、碳源氧化

基于API 50CH试剂盒检测，证明LT1菌株对核糖、D-木糖、肌醇、七叶灵、麦芽糖、蜜二糖和棉子糖等反应为阳性，对葡萄糖、果糖、甘露糖和纤维二糖等反应为弱阳性；对甘油、赤癣醇、D-阿拉伯糖和L-阿拉伯糖等反应为阴性，即不能利用这些成分作为碳源产酸。

表2芽孢杆菌菌株LT1生理生化特性–利用碳源产酸

+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应

4、贝莱斯芽孢杆菌LT1抗链霉素培养

取20μL目标菌株的发酵液涂布在含有10μg/mL链霉素的固体LB平板上，28℃培养2d后，挑取单菌落，再接入100mL含有10μg/mL链霉素的液体LB培养基中，28℃，200r/min培养2d，挑取单菌落，转入下一个浓度培养，依次经过含链霉素20、40、80、160、200、300μg/mL的LB培养基中诱导，直到筛选稳定生长的抗链霉素300μg/mL的突变菌株，将抗链霉素菌株在不含抗生素的LB培养基上连续传代5次后，再回接到含有链霉素的培养基检测，以确保耐药性的遗传稳定性。培养得到的具有链霉素抗性的贝莱斯芽孢杆菌LT1菌落形态、生理生化特性及对病原菌的拮抗作用保持稳定。

4、测定贝莱斯芽孢杆菌LT1对白绢病菌的作用

实验组：将菌株LT1在固体LB平板上活化48h，无菌接种环沾挑取少量菌体在PDA平板中间划直线，28℃培养12h，在线的两侧距离培养皿侧壁约5mm处放置黄连白绢病菌菌饼(φ＝5mm)，封口后置于培养箱中培养。对照组：直接在PDA平板两侧距离培养皿侧壁约5mm处放置植物病原菌的菌饼(φ＝5mm)，封口后置于28℃培养箱中培养。

当对照组菌丝块的菌丝接触时，测定菌饼到细菌之间菌落直径，3次重复，计算抑制率。菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％。计算可知，贝莱斯芽孢杆菌LT1对白绢病菌的抑制率为78.41％。平板对峙抑菌试验结果见图2。

实施例2

贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵液的制备：

S1、将贝莱斯芽孢杆菌LT1用接种环取一环后涂布于LB培养基上，28℃培养72h。LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.0。

S2、将步骤S1活化好的目标单菌落移入100mLLB液体培养基的250mL锥形瓶中，200rmp、28℃下培养72小时，获得发酵种子液。LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠NaCl10g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.0；在121℃高压蒸汽灭菌30min。

S3、将步骤S2中发酵种子液接种量按照1:150(V:V)的比例接种于含有100mLLB液体培养基的锥形瓶，然后置于振荡器中，28℃，200rmp，发酵72h，保证活菌体浓度达到1×10¹⁰CFU/mL以上即可，然后生产后的菌剂置于4℃冰箱保存。

实施例3

1、不同pH值对贝莱斯芽孢杆菌LT1生长的影响

用1M NaOH和1M HCL将液体LB培养基的初始pH值分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。将活化24h的1mL LT1菌液接种于含有100mL液体LB培养基的容量为250mL的三角瓶中，30℃培养24h，测定各个处理的OD600的值，计算菌落数量，每处理3次重复，见图3。由图3可知，LT1菌株在pH值低于3或大于11时，均不能生长。在pH为7时菌体数量最高，说明pH7最适LT1菌株生长。

2、不同温度对贝莱斯芽孢杆菌LT1生长的影响

取活化24h的1mL的LT1菌株接种于含有100mL固体LB培养液的容量为250mL三角瓶中，分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃ 180r/min培养24h，测定各个处理的OD600的值，计算菌落数量，每处理3次重复，结果见图4。由图4可知，LT1菌株在10℃～45℃均能生长，25℃～30℃为最适生长温度。

3、不同培养时间对贝莱斯芽孢杆菌LT1生长的影响

取1mL活化24h的LT1菌株发酵液接种于含有100mL液体LB培养液的容量为250mL三角瓶中，28℃，分别在180r/min培养24h、48h、72h和96h，每处理3次重复，测定各个处理的OD600和菌体数量，每处理3次重复，结果见图5。由图5可知，不同培养时间对菌株LT1的生长有较大影响，培养72h菌体数量达到最大值，96h后菌体数量开始降低，与72h差异极显著(P＜0.05)。

实施例4

贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液和菌体悬液的制备：

将新鲜活化的LT1菌株1mL接种到100mL液体LB中，28℃，180r/min振荡培养48h，当菌体数量达到1×10¹⁰CFU/mL时得到发酵液。将发酵液置于4℃条件下，10000rmp离心20min，细菌过滤器(0.22μm)过滤上层发酵液，得到发酵滤液。用无菌水将菌体洗涤3次，加入等体积无菌水制成菌体悬液，将发酵滤液、菌体悬液置于4℃条件下保存，备用。

实施例5

1、贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液对黄连白绢病菌菌丝的抑制作用

采用固体平板法测定菌株LT1对白绢病菌菌丝的抑制效果。将LT1发酵滤液以2％、6％和10％(v/v)比例与未冷却的PDA培养基混合，充分混匀后倒入培养皿中，每皿20mL左右的混合培养基，以未接菌的PDA替代上清液为对照。将活化的白绢病菌菌丝块(

)接种于上述PDA平板中央，每处理3个重复，28℃倒置培养。待对照长满皿后利用十字交叉法测定各个菌落的直径。计算LT1菌株发酵滤液对白绢病菌菌丝的抑制率。菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％，结果见图6。由图6可知，贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液3个浓度对白绢病菌菌丝生长均有抑制效果，各浓度之间抑制率有显著性差异，随发酵滤液浓度升高，抑制效果逐渐增强，当发酵滤液浓度达到10％时，抑制率可达到100％。

2、不同培养时间对贝莱斯芽孢杆菌LT1抑菌活性的影响

取1mL活化24h的LT1菌株接种于含有100mL液体LB培养液的容量为250mL三角瓶中，28℃，分别在180r/min培养24h、48h、72h和96h，取各个时间点的发酵滤液和与PDA培养基按10％(v/v)倒入培养皿(

)中，每皿20mL左右的混合培养基，冷切后，将黄连白绢病菌菌饼(

)放于在PDA平板中央，28℃培养，对照长满皿后，计算菌株LT1滤液对黄连白绢病菌菌丝生长的抑制率，每处理3次重复。菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％。结果表明，培养不同时间的发酵滤液抑菌活性随着培养时间的增加，抑菌效果逐渐增强，培养72h和96h发酵滤液对白绢病菌菌丝抑制率达到97％，二者之间无显著性差异(P＞0.05)。

3、不同温度对贝莱斯芽孢杆菌LT1抑菌活性的影响

取30mLLT1菌株的发酵滤液于100mL无菌三角瓶中，然后置于30℃、60℃、80℃、100℃和120℃处理20min，将各个处理发酵滤液和与PDA培养基按10％(v/v)倒入培养皿中，将活化的白绢病菌菌丝块(φ＝5mm)接种于上述PDA平板中央，每处理3个重复，28℃培养3d，计算各个处理对白绢病菌菌丝抑制率，菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％，结果见图7。由图7可知，LT1菌株发酵滤液经过5种不同温度处理20min后，发酵滤液对白绢病菌菌丝生长抑制率呈现下降趋势，各处理间有显著性差异。但处理温度为121℃时，抑制率为80.59％。表明芽孢杆菌LT1菌株发酵滤液中主要抑菌成分具有耐热特性。

实施例6

贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液对酶的敏感性测定：

在30mL发酵滤液中加入蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶于100mL三角瓶中，酶的终浓度为200μg/mL，轻微振荡混合液，30℃静止3h，用0.22μm细菌过滤器过滤发酵滤液。将处理过的发酵滤液和与PDA培养基按10％(v/v)倒入培养皿中，每皿20mL左右的混合培养基，使酶的终浓度为200μg/mL。将新鲜的黄连白绢病菌菌丝块(φ＝5mm)接种于上述PDA平板中央，28℃培养3d，以未做任何处理的发酵滤液作为阳性对照，每处理3次重复，用十字交叉法测定白绢病菌在不同处理细的菌落直径，计算各个处理对白绢病菌菌丝的抑制率。菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％，结果见图8。

由图8可知，LT1菌株发酵滤液经过胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶处理后，其中胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶未影响发酵滤液的抑菌效果，与对照相比，对白绢病菌菌丝抑制效果无差异(P>0.05)，抑制率均达到100％；木瓜蛋白酶处理后的发酵滤液对白绢病菌菌丝抑制率为93.33％。结果表明酶对菌株LT1发酵滤液的抑菌活性无明显影响。

实施例7

贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液对白绢病菌菌丝形态的影响：

1、扫描电镜观察白绢病菌菌丝形态：菌株LT1的发酵滤液与PDA培养基按8:100(v/v)混合制成平板，将白绢病菌菌饼(

)接种到PDA平板中央，密封培养皿，28℃培养3d，选取菌丝迅速投入戊二醛电镜固定液固定2h，菌丝经0.1M磷酸缓冲液PB(pH7.4)漂洗3次。菌丝经酒精梯度脱水，采用临界点法干燥，喷金30s。扫描电子显微镜(HITACHI Regulus8100)观察处理和对照菌丝形态并拍照，结果见图9。

由图9可知，对照白绢病菌菌丝在正常PDA培养基上生长正常，菌丝排列有序，表面光滑、粗细均匀、细胞壁完整(图9-A)。在含有LT1菌株发酵滤液的PDA培养基上生长3d的白绢病菌菌丝变化明显，菌丝表面粗糙，干瘪、皱缩明显、部分菌丝异常变细，裂解成丝网状，菌丝外围有串珠状小颗粒渗出(图9-B)。

2、透射电镜观察白绢病菌菌丝形态：挑取上述白绢病菌及对照菌丝，加入戊二醛溶液和1％四氧化锇电镜固定液，4℃固定2h，取菌丝加入0.1M磷酸缓冲液PB(pH7.4)，漂洗。酒精梯度脱水，丙酮漂洗。样品置于812包埋剂包埋，切片机80nm超薄切片，2％醋酸铀饱和酒精溶液避光染色，再用2.6％枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色，清洗，室温干燥过夜，透射电子显微镜(HITACHI HT7800)观察菌丝形态并拍照，结果见图10。

图10中，A：正常LC1菌株菌丝横切面；B：正常LC1菌株菌丝纵切面；C：对峙培养中LC1菌株菌丝横切面；D：对峙培养中LC1菌株菌丝纵切面。CM，细胞膜；CW：细胞壁；M：线粒体；N：细胞核；n：核仁；S：隔膜。图10证明了白绢病菌菌丝细胞内部发生了较大改变。

实施例8

贝莱斯芽孢杆菌LT1产脂肽类抗生素鉴定：

1、不同萃取剂的萃取效果

各取150mL LT1菌株的发酵原液，加入20mL醋酸，将pH调整为3.0。分别用乙酸乙酯1:1(V：V)、二氯甲烷1:1(V：V)、甲醇1:1(V：V)、丙酮1:1(V：V)萃取发酵滤液，合并萃取相，减压过滤，浓缩，用二氯甲烷超声溶解，用细菌过滤器(0.22μm)过滤，过滤物与PDA培养基按1:10(v/v)混合制成平板，将白绢病菌菌饼(φ＝5mm)接种到PDA平板中央，28℃培养3d，3次重复，利用十字交叉法测定各处理菌落直径。计算萃取物对白绢病菌菌丝生长抑制率，结果见图11。由图11可知，五种萃取剂处理试验中，各萃取剂提取物抑菌效果差异达到显著水平，提取物抑菌效果最好的为丙酮，对白绢病菌菌丝抑制率达到100％，其次为石油醚，抑制率为61.28％，其他3种萃取剂的萃取产物抑制率均低于45％。

2、抑菌成分鉴定

取丙酮萃取物，点样2μL，自然风干，使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱进行质谱分析。质谱条件：Crylas FTS355-Q激光源(355nm)作为离子解析电离源，频率1000HZ，激光能量250，样品测试范围为0-2000m/z。检测结果见图12和表3。

表3 LT1菌株脂肽类物质抗菌成分检测结果

可见，m/z在1053.5、1053.6、1063.6、1069.5、1066.7、1067.5、1069.4、1069.6、1083.5、1081.5、1081.7、1083.5、1097.5、1095.5、1099.6、1099.7、1111.5、1111.6、1111.7、1109.5处有离子峰出现，对应杆菌霉素Bacillomycin D(C₁₁)、Bacillomycin D(C₁₂)、Bacillomycin D(C₁₃)、Bacillomycin D(C₁₄₎、Bacillomycin D(C₁₅)、Bacillomycin LC(C₁₄)和Bacillomycin LC(C₁₅)。在m/z为1065.5、1081.5、1079.5、1095.5、1093.5、1109.5、1066.7、1082.6、1082.7、1080.7、1096.6、1094.6、1094.7、1136.6、1150.6、1063.6、1099.6、1098.6、1098.7、1098.7，1120.6、1112.6和1134.6处有离子峰出现，对应脂肽类伊苦草菌素Itutin A(C₁₄)、Itutin A(C₁₅)、Itutin A(C₁₆)、Itutin C(C₁₁)、Itutin C(C₁₂)、Itutin C(C₁₃)、Itutin C(C₁₆)和Itutin C(C₁₇)。在m/z为1435.0、1435.8、1437.7、1457.8、1449.8、1487.7、1471.7、1471.8、1463.8、1464、1485.7、1485.8、1450.0、1501.7、1477.8、1477.9、1478.0、1499.8、1515.6、1491.9、1492.0、1513.8、1529.8、1505.8、1506、1527.8、1543.8、1519.7、1557.8、1533.8、1571.8和1547.8处有离子峰出现，对应脂肽类泛革素Fengycin A(C₁₄)、Fengycin A(C₁₅)、Fengycin A(C₁₆)、Fengycin A(C₁₇)、Fengycin A(C₁₈)、Fengycin A(C₁₉)、Fengycin A(C₂₀)、Fengycin A(C₂₁)和Fengycin A(C₂₂)。在m/z为1030.7、1046.6、1060.6、1058.7、1058.8、1059.7、1072.6、1088.6、1088.7和1102.7处有离子峰出现，对应脂肽类表面活性素Surfactin(C₁₁)、Surfactin(C₁₂)、Surfactin(C₁₃)、Surfactin(C₁₄)和Surfactin(C₁₅)。证明贝莱斯芽孢杆菌LT1含有丰富的脂肽类抑菌物质。

实施例9

贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液抑菌分子机理：

1、取菌株LT1的发酵滤液与PDA培养基按8％(v/v)倒入培养皿中(SQ)，冷却后，铺无菌玻璃纸，再将新鲜的白绢病菌菌饼接种于上述PDA平板上，28℃培养3d，设置加等量无菌水的PDA平板为空白对照(LC1)，设置3个重复。快速收集菌丝，液氮速冻，-80℃保存。采用Trizol法提取RNA，各样本RNA-seq测序由武汉迈特维尔生物科技有限公司完成。分析SQ与LC1之间差异基因表达情况，阐述在菌株LT1发酵滤液胁迫下，对白绢病菌菌丝抑制机理。使用DESeq2进行LT1菌株发酵滤液处理后的白绢病菌菌丝与对照之间差异表达分析，基于|log2Fold Change|≥1，且FDR<0.05标准进行差异基因(DEGs)筛选，共筛选得到6358个差异基因(DEGs)，包括下调的3427个和上调的2931个，见图13。

2、菌株LT1对白绢病菌细胞膜合成相关基因的影响

SQ处理组基因Cluster-877.20245(p＝2.5×10^-11)、Cluster-877.3193(p＝2.1×10^-5)和Cluster-877.20193(p＝3.5×10^-17)均编码Delta(14)甾醇还原酶(Delta(14)-sterol reductase)，3个基因均上调表达，均与高卢蜜环菌(Armillaria gallica)的ERG4/ERG24甾醇还原酶(ERG4/ERG24 ergosterol biosynthesis protein)有较高的同源性，属于麦角固醇合成基因ERG4/ERG24家族蛋白(Ergosterol biosynthesis ERG4/ERG24family)。与对照相比，Cluster-877.20245、Cluster-877.3193和Cluster-877.20193的差异表达量分别是对照的2.48倍、1.86倍和1.79倍。LT1菌株发酵滤液中脂肽类抗生素的胁迫，白绢病菌通过上调Delta(14)甾醇还原酶相关基因表达，保证细胞膜的稳定性，以抵抗生防菌脂肽类抗生素对自身的伤害作用，见图14。

3、菌株LT1对白绢病菌细胞壁合成相关基因的影响

LT1菌株发酵滤液处理后的白绢病菌菌丝中基因Cluster-877.3688(p＝1.5×10^-2)和Cluster-877.9777(p＝3.8×10^-2)上调表达，均编码几丁质合成酶1(Chitinsynthase 1)，分别和粗环点革菌(Punctulariastrigosozonata)的假定蛋白PUNSTDRAFT_141604和Fibroporiaradiculosa的预测蛋白有较高的同源性。均属于糖基转移酶家族2蛋白。Cluster-877.3688和Cluster-877.9777基因差异表达量倍数(log2FoldChange)分别为2.04和1.28。结合前期电镜观察发现芽孢杆菌LT1发酵滤液处理后的白绢病菌菌丝细胞壁有增厚现象，猜测是白绢病菌上调表达几丁质合成酶基因，维护真菌细胞壁完整性，抵御生防菌抗生素对菌丝的破坏。在转录组数据中只有基因Cluster-877.8968和Cluster-877.17285编码β-1,3葡聚糖合成酶，二者均下调表达，基因差异表达量倍数(log2FoldChange)分别为-4.52和-4.55，可见在LT1发酵滤液处理后，白绢病菌会下调β-1,3葡聚糖合成酶的表达，降低β-1,3葡聚糖，结果见图15。

实施例10

1、贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液对黄连白绢病盆栽防效：

取利川市建南镇箭竹溪村湖北省农业科学院中药材研究所黄连规范化种植试验区选择2年生黄连苗，连同根围土一起移栽于温室内，土壤pH5.5，有机质19.11mg/kg，碱解氮71.85mg/kg，速效磷137.96mg/kg，速效钾166.56mg/kg。选取活化3d的黄连白绢病菌菌株菌丝块(

)备用。

采用实施例2制备的发酵液、实施例4制备的发酵滤液和菌体悬液。

分别考察LT1菌株发酵原液、发酵滤液和菌体悬液的防效：LT1菌株菌体数量为1×10¹⁰CFU/mL的发酵原液采用无菌水稀释10倍(发酵原液1:10)和100倍(发酵原液1:100)；发酵滤液稀释10倍(发酵滤液1:10)和100倍(发酵滤液1:100)；菌体悬液稀释10倍(菌体悬液1:10)和100倍(菌体悬液1:100)；240g/L噻呋酰胺悬浮剂(SC)2500倍液(噻呋酰胺1:2500)和3500倍液(噻呋酰胺1:3500)共8个处理。进行单因素实验。

各个处理选择3种使用方式：预防、同时和治疗。预防试验中，先将上述8个处理得到的液体均匀喷雾到盆栽黄连叶片上，12h后接种白绢病菌菌株菌丝块。同时试验中，接种白绢病菌菌株菌丝块，立刻将上述8个处理得到的液体均匀喷雾到盆栽黄连叶片上。治疗试验中，先接种白绢病菌菌株菌丝块于黄连叶片上，12h后均匀喷雾上述8个处理得到的液体到盆栽黄连叶片上(90mL/株)。设置4次重复，清水喷雾作为空白对照，套袋保湿，28℃培养，3d后选择8个叶片，统计病斑大小，计算各处理防效。防效(％)＝(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100％。

菌株LT1发酵原液、发酵滤液和菌体悬液防治黄连白绢病盆栽防治试验表明，各处理浓度越高防效越好。结果见表4。

表4菌株LT1发酵物对黄连白绢病盆栽防效

注：不同字母表示差异显著性p＜0.05。小写字母表示不同处理之间差异性；大写字母表示同一处理不同用药方式之间差异显著性。

预防试验中，发酵原液1:10，平均防效最高，达到72.95％；其次是发酵滤液1:10，平均防效为61.48％；菌体悬液1:10平均防效为60.66％；三者与噻呋酰胺1:2500之间防效差异不显著(P＞0.05)。

同时试验中，发酵物总体防效低于预防试验，发酵原液1:10平均防效最高，达到67.21％，其次是发酵滤液1:10，平均防效为63.93％，菌体悬液1:10，平均防效为57.38％，其中发酵原液1:10和发酵滤液1:10与噻呋酰胺1:2500之间防效差异不显著(P＞0.05)。

治疗试验中，依然是发酵原液1:10平均防效最高，达到63.93％，发酵滤液1:10和菌体悬液1:10处理平均防效分别60.66％和49.18％，其中发酵原液1:10和发酵滤液1:10防效之间无差异(P＞0.05)，二者与噻呋酰胺1:2500之间防效差异不显著(P＞0.05)(表4-12)。

菌株LT1发酵物3种用药方式中，预防防效高于另外2种用药方式，其中发酵原液和发酵滤液的3种用药方式之间无显著性差异(P＞0.05)。菌体悬液预防和同时防效高于治疗，其中菌体悬液1:100的预防防效显著高于治疗防效(P＜0.05)。

2、贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液对黄连白绢病田间防效试验：

本试验在利川市建南镇箭竹溪村黄连GAP种植基地开展。试验地往年有白绢病零星发生，黄连为3年生，用药时间为2021年5月15日，试验地每小区50m²。试验设置9个处理：1:10和1:100的发酵原液、1:10和1:100的发酵滤液、1:10和1:100的菌体悬液、1:2500和1:3500的240g/L噻呋酰胺悬浮剂(SC)，设置清水对照，每小区50m²，喷淋茎基部，每株100mL，每处理4次重复。用药2次，间隔7d，末次药后10d和20d调查病情指数，按照5点取样法调查，每点10株，计算防效。

病情指数根据Shokes的标准稍加修改：0级：全株无发病；1级：仅茎上有病斑；2级：全株≤25％以下萎蔫和死亡；3级：全株26～50％表现萎蔫和死亡；4级：全株≥50％表现萎蔫和死亡。

病情指数＝Σ(各级病叶数×该级代表值)/(调查总叶片数×最高级代表值)×100；

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

表5菌株LT1发酵物对黄连白绢病的田间防效

由表5可见，菌株LT1发酵产物随着稀释倍数的增加，防效逐渐减低。末次药后10d，菌株LT1的6个处理，发酵原液1:10防效最好，达到61.98％，与其他5个处理防效有显著性差异，与噻呋酰胺1:3500之间防效无差异(P＞0.05)。发酵滤液1:10防效次之，平均防效为54.86％，与发酵原液1:100之间防效无显著性差异(P＞0.05)。末次药后20d各处理防效低于末次药后10d防效，其中发酵原液1:10防效最高，达到53.24％，与噻呋酰胺1:3500之间防效无显著性差异(P＞0.05)。其次为菌体悬液1:10处理，防效为49.64％，与噻呋酰胺1:3500之间防效差异不显著性(P＞0.05)。

实施例11

贝莱斯芽孢杆菌LT1对黄连药效成分合成基因表达的影响：

取1年生黄连苗，定殖20d后，均匀喷施1×10¹⁰CFU/mL菌株LT1的菌体悬液，每株100mL，然后分别在0h、3h、6h、12h、24h和36h取黄连叶片，于液氮中速冻，-80℃保存。提取黄连叶片RNA，RNA提取参考iScript^TM gDNA Clear cDNA Synthesis Kit说明书，提取得到的RNA立即用于qPCR检测。RT-qPCR检测，引物序列见表6。

表6黄连药效成分合成相关基因定量检测引物序列

qPCR反应体系：20μL，包括2×qPCR Mix 10μL，Primer 0.5μL，cDNA 0.5μL，ddH₂O补正；反应程序：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环，95℃ 15s，60℃ 60s。相对定量(ΔΔCT法)计算公式：A＝CT(目的基因，待测样本)-CT(内参基因，待测样本)；B＝CT(目的基因，对照样本)-CT(内参基因，对照样本)△△CT＝A-B相对表达量＝2-△△CT

根据RT-qPCR结果得到菌株LT1对黄连药效成分合成基因表达的影响，结果见图16(A，CNMT；B，6-OMT；C，4`-OMT；D，SMT)。表明，CNMT基因在各时间点表达量均低于对照，但施用LT1菌体悬液0h的样品表达量高于其他时间点。6-OMT基因在施用LT1菌体悬液0h的表达量约为CK的7倍，呈现陡然升高，3h降低只有CK表达量的一半，6h和12h表达量均超过CK，24h又降低约为CK的一半，36h表达量约为CK的1.5倍，呈现波浪型变化趋势。4`-OMT基因在0h的表达量约为CK的2.5倍，直到12h才超过CK的表达量，24h时表达量低于CK，36h又高于CK，同样呈现波浪型变化趋势。SMT基因表达0h和36h表达量和CK相当，但另外3个时间点的表达量低于CK。

实施例12

贝莱斯芽孢杆菌LT1对黄连根部微生物群落结构的影响：

本试验在利川市建南镇箭竹溪村黄连GAP种植基地开展。试验地往年有白绢病零星发生，黄连为3年生，施用菌株LT1发酵液(1×10¹⁰CFU/mL)每株100mL，药后10d(XJ1)，分别取用过菌株LT1发酵液和喷施清水(CK1)的黄连根际土壤利用平台为Illumina.进行宏基因组测序，分析菌株LT1对黄连根际土壤微生物群落结构的影响。

表7物种Alpha多样性分析

根据表7分析可知，施用菌株LT1发酵液后，黄连根际土壤simpson指数、chao1指数、ACE指数以及shannon指数均高于对照。表明菌株LT1的发酵液可以提高黄连根际土壤微生物菌群丰富度，菌群的多样性。

根据图17可知，施用菌株LT1后，黄连根际物种数量为29407种，而对照的为28966，菌株LT1的施用，增加了441种微生物，显然菌株LT1具有招募微生物聚集，提升土壤微生物群落结构的功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖北省农业科学院中药材研究所

<120> 一种生防菌株及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggagcgt cgaggtatg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatgcacttg tctctgtgcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgcgtggca ggtgatatgt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccttcgatt ggtactgcct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctccgatgtg cagtggaact 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggttcaagc gcgtacttct 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgggtactt cacgactggg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttacccccag gattcaacgc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccgtgaacc atcgagtctt 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagctttgat ccaccacga 19

Claims

1.一种生防菌株，其特征在于，所述生防菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)LT1，于2020年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2020023。

2.权利要求1所述生防菌株在防治植物白绢病中的应用。

3.一种生防菌剂，其特征在于，包括贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵液、贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液、贝莱斯芽孢杆菌LT1菌体悬液中的一种或几种；

所述贝莱斯芽孢杆菌LT1发酵滤液的制备方法包括：将贝莱斯芽孢杆菌LT1接种于液体培养基中进行有氧发酵，得到发酵液，发酵液置于4℃条件下，8000～12000rmp离心15～25min，细菌过滤器过滤上层发酵液，得到发酵滤液；所述发酵条件为150～300rmp、25～30℃；

所述贝莱斯芽孢杆菌LT1的保藏号为CCTCC NO：M2020023。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，菌剂中贝莱斯芽孢杆菌LT1总浓度为1×10⁸～9×10¹⁰CFU/mL。

5.权利要求3～4任意一项所述菌剂的制备方法，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌LT1接种于液体培养基中进行有氧发酵，得到发酵液；所述贝莱斯芽孢杆菌LT1的保藏号为CCTCCNO：M2020023。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，发酵液离心过滤后，菌体部分加入无菌水制得菌体悬液。

7.权利要求3或4所述菌剂在防治植物白绢病中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述菌剂使用剂量为80～120mL/株。