CN108949792A - 一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光gfp标记载体的构建及其电转化方法 - Google Patents

一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光gfp标记载体的构建及其电转化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种载体重组及其构建方法，一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体的构建及其电转化方法，所述重组载体包括光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体包括PBBR1MCS‑2穿梭载体和绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段，融合了光合细菌基因组表达启动子PpckA基因和终止子TpckA基因，以及被广泛应用的GFP基因，基因GFP全长片段序列，基因GFP全长片段位于PBBR1MCS‑2穿梭载体ECORⅠ和SACⅠ两限制性内切酶位点之间，其构建方法包括：抽提基因组DNA、设计引物、PCR扩增、酶切、连接等步骤。本发明还包括含有上述重组载体得到工程菌，由上述重组载体经电击转化至感受态细胞得到。该工程菌稳定性高，工艺简单且对环境友好，可应用于光合细菌在植物中定殖行为的研究。

Description

一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体的构建及其 电转化方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种重组载体及其构建方法、荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌工程菌及制备方法和应用。
背景技术
光合细菌，作为地球上最早出现，在自然界广泛存在的且具有原始光能合成体系的原核生物。光合细菌均为革兰氏阴性菌，其能在厌氧光照和好氧黑暗条件下利用自然界无机物和有机物作为营养生长和繁殖。近年来，光合细菌因其独特的生理功能和丰富的菌体在水产养殖，有害物质降解，废水处理，畜禽生产以及环境保护等方面取得了广泛应用。很多研究表明，光合细菌菌剂不仅能增加土壤肥力，促进植物生长，还具有抗病的功效。光合细菌菌剂作为一种药肥，其无毒，无残留，其与农业可持续发展的要求想符合。光合细菌在农业上具有促生、诱抗、农药降解、重金属吸附等作用，其极具应用开发潜力。但是长期以来缺乏直观有效的技术手段对其定殖规律及作用机制进行深入的研究。
绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因，以其折叠效率高，对细胞无害，稳定性好等优点，已被广泛应用于微生物的环境示踪。近年来，生防菌定殖能力的研究已经成为目前研究生防菌的重要内容，与其他放射性同位素标记和抗生素标记方法相比，GFP标记其性能稳定，灵敏度高，检测方便，已被成功用于研究各种微生物在植物中定殖。但对于光合细菌，在植物中定殖动态还未有报道。本发明研究目的是为了揭示这种具有生防及促生作用的有益微生物在自然界中的生态分布以及在植物体表和体内的定殖、扩展和分布规律，阐明其生防及促生作用机制并提高作用效果。
本发明提供了一种重组载体构建方法，所述重组载体包括PBBR1MCS-2克隆载体和包含光合细菌CGA009基因组启动子和终止子的绿色荧光标记基因GFP全长片段；所述包含光合细菌基因组启动子和终止子的GFP基因全片段DNA序列为SEQ ID NO.1所示的序列；所述荧光标记基因GFP全长片段位于所述PBBR1MCS-2克隆载体的Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ两限制性酶切位点之间。通过电击转化方法将重组质粒转化至光合细菌CGA009感受态细胞，构建光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记的工程菌，通过其在植物上定殖来揭示光合细菌在自然界中的生态分布以及在植物体表和体内的定殖、扩展和分布规律，以阐明其生防及促生作用机制并提高其作用效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体的构建及其电转化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种重组载体，所述重组载体包括光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体包括PBBR1MCS-2穿梭载体和绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段(PpckA+GFP+TpckA)，所述绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段包含光合细菌启动子和终止子，所述绿色荧光蛋白基因GFP全长位于所述PBBR1MCS-2穿梭载体的ECORⅠ和SAC Ⅰ两限制性内切酶位点之间。
一种重组载体的构建方法，包含以下步骤：
S1，抽提光合细菌沼泽红假单胞菌的基因组DNA；
S2，根据所述步骤S1的基因组DNA设计基因PpckA和TpckA的扩增引物；
S3，根据载体pRK415载体序列设计基因GFP的扩增引物；
S4，以所述S1的基因组为模板，以步骤S2的扩增引物进行多重PCR扩增得到扩增产物PpckA和TpckA片段；
S5，将所述步骤S4中扩增产物TpckA连接到T载体上，得到重组载体；
S6，以载体PRK415为模板，以步骤S3的扩增引物进行PCR扩增得到扩增产物；
S7，酶切S4所述扩增产物PpckA和S5重组载体，得到酶切后的扩增产物和重组载体；
S8，连接酶切后的扩增产物和重组载体，得到重组基因片段载体；
S9，酶切S8重组片段基因载体的扩增产物和原始载体，得到重组基因片段和酶切后的原始载体；
S10，连接重组基因片段和原始载体得到前重组载体；
S11，单酶切S6扩增产物和S10前重组载体；
S12，将所述酶切后的扩增产物连接到所述酶切后的前重组载体上得到重组载体。
优选的，S4中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性45s,54℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环，最后延伸10min。
优选的，S6中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性45s,55℃复性30s,72℃延伸45s,35个循环，最后延伸7min。
优选的，S7中，采用限制性内切酶Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切所述片段和载体，S8中，将酶切后扩增产物用T4DNA连接酶将两个扩增片段连接在一起并连接到T载体上，S9中，采用限制性内切酶Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切所述扩增片段和原始载体，S10中，用T4DNA连接酶将所述酶切后的扩增产物连接到原始载体上得到前重组载体，S11中，采用限制性内切酶Bgl Ⅱ单酶切所述扩增产物和前重组载体，S12中，将所述酶切后扩增片段用T4 DNA连接酶连接到所述酶切后的前重组载体上得到重组载体(工程菌)。
一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记的工程菌，所述荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌含有权利要求1或2所述的重组载体
优选的，所述工程菌在大肠杆菌培养基中培养至OD660为0.6-0.8，通过喷施，注射和灌根方法将所述工程菌施用于植物叶面，茎部和根部，观测工程菌在植物中定殖行为。
优选的，所述大肠杆菌培养基为LB培养基，所述培养基为光合细菌专用培养基，培养时间为7-9天，培养温度为30℃,培养光照强度为7500Lx。
荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备光合细菌沼泽红假单胞菌感受态细胞；
S1，将重组载体电击转化至光合细菌沼泽红假单胞菌感受态细胞中得到荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌工程菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明结构设置合理，功能性强，具有以下优点：
1.利用荧光GFP标记的光合细菌在植物中定殖行为观测，为工业化生产提供一直荧光表达稳定的工程菌；
2.利用光合细菌GFP的蛋白表达，观测光合细菌在植物体内定殖行为；
3.利用构建的工程菌生产带有荧光GFP标记的光合细菌菌株，不仅产量高，而且荧光表达稳定，对环境友好，满足其在植物定殖行为研究的要求。
附图说明
图1为本发明重组质粒PBBR1MCS-2-GFP的构建过程图；
图2为本发明限制性内切酶Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切原始载体PBBR1MCS-2琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明用限制性内切酶Bgl Ⅱ单酶切GFP片段琼脂糖凝胶电泳图；
图4为本发明重组载体PBBR1MCS-2-GFP PCR验证电泳图；
图5为本发明光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记工程菌PCR验证电泳图；
图6(6.1-6.2)为本发明光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记工程菌荧光验证显微镜图；
图7(7.1-7.8)为本发明光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记工程菌在植物上定殖检测图。
图3中1，2，3，4，5，6均为GFP条带
图4中1，2，3，4，5，6，7，8，9均为重组载体GFP验证条带
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例(请参阅图1-7)
一种重组载体，所述重组载体包括光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体包括PBBR1MCS-2穿梭载体和绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段(PpckA+GFP+TpckA)，所述绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段包含光合细菌启动子和终止子，所述GFP全长片段的DNA序列为SEQ ID NO.1所示的序列，所述绿色荧光蛋白基因GFP全长位于所述PBBR1MCS-2穿梭载体的ECOR Ⅰ和SAC Ⅰ两限制性内切酶位点之间。
一种重组载体的构建方法，包括以下步骤：
S1，抽提光合细菌沼泽红假单胞菌的基因组DNA；
S2，根据所述步骤S1的基因组DNA设计基因PpckA和TpckA的扩增引物；
S3，根据载体pRK415载体序列设计基因GFP的扩增引物；
S4，以所述S1的基因组为模板，以步骤S2的扩增引物进行多重PCR扩增得到扩增产物PpckA和TpckA片段；
S5，将所述步骤S4中扩增产物TpckA连接到T载体上，得到重组载体；
S6，以载体PRK415为模板，以步骤S3的扩增引物进行PCR扩增得到扩增产物；
S7，酶切S4所述扩增产物PpckA和S5重组载体，得到酶切后的扩增产物和重组载体；
S8，连接酶切后的扩增产物和重组载体，得到重组基因片段载体；
S9，酶切S8重组片段基因载体的扩增产物和原始载体，得到重组基因片段和酶切后的原始载体；
S10，连接重组基因片段和原始载体得到前重组载体；
S11，单酶切S6扩增产物和S10前重组载体；
S12，将所述酶切后的扩增产物连接到所述酶切后的前重组载体上得到重组载体。
S1和S2中的扩增引物为图1中所示。
S4中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性45s,54℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环，最后延伸10min。
S6中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性45s,55℃复性30s,72℃延伸45s,35个循环，最后延伸7min。
S7中，采用限制性内切酶Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切所述片段和载体，S8中，将酶切后扩增产物用T4DNA连接酶将两个扩增片段连接在一起并连接到T载体上，S9中，采用限制性内切酶Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切所述扩增片段和原始载体，S10中，用T4DNA连接酶将所述酶切后的扩增产物连接到原始载体上得到前重组载体，S11中，采用限制性内切酶Bgl Ⅱ单酶切所述扩增产物和前重组载体，S12中，将所述酶切后扩增片段用T4 DNA连接酶连接到所述酶切后的前重组载体上得到重组载体(工程菌)。
所述荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌含有权利要求1或2所述的重组载体。
所述工程菌在大肠杆菌培养基中培养至OD660为0.6-0.8，通过喷施，注射和灌根方法将所述工程菌施用于植物叶面，茎部和根部，观测工程菌在植物中定殖行为。
所述大肠杆菌培养基为LB培养基，所述培养基为光合细菌专用培养基，培养时间为7-9天，培养温度为30℃,培养光照强度为7500Lx。
荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备光合细菌沼泽红假单胞菌感受态细胞；
S1，将重组载体电击转化至光合细菌沼泽红假单胞菌感受态细胞中得到荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌工程菌。
一种荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌CGA009的工程菌，其构建方法包括以下步骤：
1.光合细菌CGA009沼泽红假单胞菌基因组DNA的抽提：采用CTAB法抽提液体培养的光合细菌，将液体培养的光合细菌CGA009离心后收集，采用CTAB法抽提DNA,后采用琼脂糖凝胶来检验DNA浓度和完整性，具体操作如下：
1.1.将光合细菌沼泽红假单胞菌CGA009按照接种量1％(v/v)接种至CGA009液体培养基中(培养基半充满培养瓶后密封)，在30℃，光照强度为7500xl的光照条件下培养7d，该液体培养基成分为：19g/L Trypton,3g/L Soytone,2.5g/L Dextrose,5.0g/L NaCl和2.5g/L K2HPO4，PH为7.3，在121℃灭菌50min
1.2.取出2ml生长期在对数期的光合细菌菌液，1000rpm转速下离心2min,收集菌体。
1.3.用500uL TE缓冲液溶解S2中收集的菌体，然后加30uL、浓度为10％(w/v)的SDS,蛋白酶K为3mL，混匀后，于37℃下培养1h得到培养液。
1.4.向S3的培养液中加入浓度为5M的NaCl 100uL，混匀后加入10％的CTAB/NaCl溶液80uL(CTAB/NaCl溶液中CTAB的浓度为10g/L,NaCl的浓度为0.7M)，混匀后得到混合液。
1.5.将等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比为25：24：1)加入到S4的混合溶液中，混匀后，于1200rpm离心5min，收集离心后的上清液。
1.6.将等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)加入到S5的上清液中，混匀后，于1200rpm离心5min，收集离心后的上清液。
1.7.将3/5体积的异戊醇加入到S6的上清液中，沉淀DNA，沉淀完成后于10000rpm下离心10min。
1.8.用70％(v/v)乙醇将沉淀洗涤2次，室温下干燥后加TE溶解。
1.9.37℃温度下，用RNase消化S8中的沉淀1小时，即得到光合细菌CGA009的基因组DNA。
2.荧光GFP基因的克隆
2.1.根据光合细菌CGA009基因组序列设计基因PpckA和TpckA的扩增引物，PpckA基因两端设置Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ两个酶切位点，TpckA基因两端设置Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ两个酶切位点,酶切位点Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ位于原始载体PBBR1MCS-2中，且Bgl Ⅱ在原始载体PBBR1MCS-2中不存在,所设计引物序列如下：
Ppck-F:CGGGGTACCCCGACGGAATGACTTGAGCCAG
Ppck-R:GGAAGATCTTCCACCGCGTCGCTGAAGTAAT
Tpck-F:GGAAGATCTTCCCTGTCCACACAATCTGCC
Tpck-R:CCGGAATTCCGGCCCTTCGTATTTCGTTCGAT
下划线部分为引入的酶切位点
2.2.根据载体pRK415载体序列设计基因GFP的扩增引物,引物两端引入Bgl Ⅱ酶切位点,酶切位点Bgl Ⅱ在原始载体PBBR1MCS-2中不存在,所设计引物序列如下：
F:GGAAGATCTTCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC
R:GGAAGATCTTCCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC
下划线部分为引入的酶切位点
2.3.利用上述S1设计的引物对光合细菌CGA009基因组DNA进行多重PCR扩增，得到光合细菌CGA009启动子基因PpckA和终止子基因TpckA扩增产物。
具体的扩增体系为：11.1uL ddH2O,2uL10×PCR buffer，1.6uL dNTP(2,5mM)，0.3uL Easy Taq DNA polymerase，PpckA和TpckA上游引物/下游引物各位1uL，DNA样品为1uL，总体积为20uL。
扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性45s,54℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环，最后延伸10min。
将扩增产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，显示在和有单一条带，与预期序列大小一致。
2.4.以载体PRK415为模板，以S2的扩增引物进行PCR扩增得到扩增产物。
具体的扩增体系为：ddH2O:13.1uL，10×PCR buffer：2uL，dNTP(2.5mM)：1.6uL，上游引物/下游引物各1uL，载体PRK415：1uL，总体积为20uL。
扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性45s,55℃复性30s,72℃延伸45s,35个循环，最后延伸7min。
将扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，显示在750bp有一单一条带，与预期大小一致。
前荧光GFP表达载体的构建，如图1所示，重组质粒的构建按以下步骤进行：
3.1.将S2中扩增回收到的TpckA连接到TI载体上，得T-TpckA载体。
将PCR扩增片段PpckA和T-TpckA载体利用限制性内切酶Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切，酶切位点位于基因PpckA的首尾，并同时酶切T-TpckA载体。
将双酶切后的PCR扩增片段和载体进行琼脂糖凝胶电泳，并回收PCR扩增片段和酶切载体大片段。
将回收得到的PCR扩增片段和酶切后载体片段用T4 DNA连接酶在16℃过夜连接，得到PpckA-TpckA,命名为载体T-pckA。
利用限制性内切酶Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切载体T-pckA和原始载体PBBR1MCS-2,酶切位点位于pckA(PpckA+TpckA)基因两端，且两个酶切位点存在于原始载体PBBR1MCS-2中。
回收酶切后的T-pckA载体小片段和原始载体PBBR1MCS-2大片段，得到pckA基因片段和PBBR1MCS-2载体片段。
将回收得到的pckA片段和PBBR1MCS-2载体用T4DNA连接酶在16℃条件下过夜连接，得到前重组载体，命名为PBBR1MCS-2-pckA。
4.荧光标记GFP重组载体的构建。
4.1.使用限制性内切酶Bgl Ⅱ单酶切GFP PCR扩增片段，37℃条件下过夜酶切,酶切位点位于GFP基因的首尾。
具体的单酶切体系为：ddH2O:12.0uL，10×H Buffer:2.0uL,Bgl Ⅱ限制性内切酶：1.0uL，GFP片段为5.0uL,总体积为20uL。
4.2.回收上述酶切产物，即得到GFP基因片段。
4.3.同样使用限制性内切酶Bgl Ⅱ单酶切前重组载体PBBR1MCS-2-pckA，酶切位点位于前重组载体PBBR1MCS-2-pckA中PpckA和TpckA之间，这样GFP与前重组载体PBBR1MCS-2-pckA两端的粘性末端相同，利用同一个限制性内切酶单酶切时，为了保证片段和载体连接的高效性，须进行去磷酸化处理，以防止载体自连。
4.4.对前重组载体进行去磷酸化处理，去磷酸化反应体系为：目的片段为100.0uL，10×Buffer为12.0uL，ddH2O为7.0uL，CIAP为1.0uL，总反应体系为120.0uL，具体操作如下：
4.4.1.前处理，在65℃水浴反应液20-30min，灭活内切酶。
4.4.2.将反应体系置于50℃水浴锅中，反应30-60min。
4.4.3.向反应液中加入280uL，使反应液至400uL，利用酚/氯仿/异戊醇(比例为25：24：1)抽提2次，不进行涡旋处理，只需上下颠倒40-50次，1000rpm离心10min，第一次吸取上清380uL，并补加ddH2O至400uL，第二次吸取上清360uL，继续补加ddH2O至400uL。
4.4.4.加入等体积氯仿/异戊醇(比例为24:1)，抽提1次，吸取350uL上清。
4.4.5.加入上清体积1/10倍(约35uL)的3M NaOAc，并混匀。
4.4.6.加入此时反应液体积2.5倍(约875uL)的冷的无水乙醇，在-20℃条件下保存30-60min(可过夜沉淀，以保证沉淀效果)。
4.4.7.在4℃条件下，13000g离心25min，弃去上清。
4.4.8.利用70％冷乙醇1mL悬浮沉淀，上下颠倒离心管10次，4℃条件下，13000g离心25min，弃去上清。
4.4.9.室温下将沉淀干燥，时间为20min左右。
4.4.10.沉淀用10uL的灭菌ddH2O溶解，并利用紫外分光光度计测其浓度。
4.5.回收经过单酶切处理过的GFP片段和前重组载体，得到GFP片段和前重组载体。
4.6.将回收得到的GFP片段和前重组载体用T4DNA连接酶在16℃条件下过夜连接，得到重组载体,命名为PBBR1MCS-2-GFP。
4.7.重组载体的验证，以重组载体为模板，以Kpn Ⅰ-PpckA F和TpckA-EcoR Ⅰ R为引物，进行PCR扩增，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在900bp左右有明亮条带，与预期结果相符。
4.8.将验证好的载体送至湖南擎科公司测序，测序结果显示和预期结果相符。
GFP全长片段基因序列(SEQ ID NO.1)：
CGTTCGCCACTATTCAGTCGCCCCACTGGATCAGGGCGGTATATATTGACGTTACCGCGGCCAGTGATGCGCGTTGGCGGCAATCGCGCGATCGAGACAACGCGGATTCGAGGAGGATCTATTCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGGTTATGGTGTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAAGCGCGCCGGCGATCGAACGAAATACGAAGGGCGGCCCGCAAGGCCGCCCTT。
5.制备工程菌感受态
5.1.将500uL光合细菌CGA009加入到50mL不含抗生素的光合细菌培养基中，光照耗氧条件下培养至菌液OD660值为0.4，培养温度为30℃，光照强度为7500xL。
5.2.取50mL光合细菌菌液，4℃,10000rpm离心10min，去上清。
5.3.菌体用50mL预冷无菌水悬浮洗涤，4℃,10000rpm离心10min，去上清，重复洗涤3次。
5.4.将沉淀溶于10％甘油，后分装于1.5mL无菌离心管中，每管100uL，于-80℃冰箱保存。
6.制备工程菌：
6.1.从-80℃冰箱取出光合细菌感受态细胞，放置冰浴上融化20min。
6.2.用无水乙醇洗涤2mm电击杯，并吹干电击杯里残留的乙醇。
6.3.取50uL已制备好的感受态，加入340uL预冷无菌水和7uL重组质粒PBBR1MCS-2-GFP。
6.4.将以上三样放入2mm电击杯中，在冰上静置10min。
6.5.静置完，将电击杯表面擦干，放入电击槽，设置电压2450KV，进行电击。
6.6.电击完，取出电击杯，常温下静置2min，在10ml螺口玻璃试管中加入5ml光合细菌培养基，加入电转化的细胞，在30℃，光照强度为7500xl培养箱中培养20h。
6.7.将已培养20h的光合细菌涂布于含有卡那抗生素的光合细菌固体培养基中，在30℃，光照强度为7500xl培养箱中培养。
6.8.培养7d后，观测到有红色菌体长出，经过PCR验证和测序结果显示，重组质粒已成功转入光合细菌CGA009细胞中。
6.9.挑取已长出来单菌落，在共聚焦荧光显微镜下观测其荧光表达，镜检结果显示，荧光表达良好，荧光表达图片为图1所示。
7.荧光GFP标记光合细菌工程菌荧光稳定性测试：
7.1.挑取已长出来单菌落，再次划线培养，培养至6代，观测其荧光表达稳定性。
7.2.镜检结果显示，6代后，荧光表达依旧稳定，证明荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌构建成功，其稳定性高。
8.荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌在植物上定殖行为8.1.将培养至OD值为0.6左右的荧光GFP标记的光合细菌菌剂喷施在本氏烟草，三生烟草，黄瓜和辣椒叶部和根部。
8.2.三天后观测每株植物叶面，茎部，和根部荧光定殖情况。
8.3.荧光观测结果于图6-7显示，根据图片显示的结果，可以看出光合细菌荧光标记菌株已成功在植物上定殖，更多结果表明，光合细菌定殖在植物表层细胞以及少许存在于细胞间隙内，在少量气孔中也发现了光合细菌荧光标记菌株的存在。
8.4.在喷施光合细菌荧光标记菌株五天后，分别做每种植物叶面，茎部，和根部的切片，十天后再次观测。
8.5.通过观测光合细菌荧光标记菌株在植物上随着时间的变化，可以看出，在第三天时，光合细菌大部分存在于细胞表层细胞以及细胞间隙中，第五天观测结果表明光合细菌菌株已进入细胞气孔内，然而在第十天观测结果，只看到有少量荧光标记菌株存在。
8.6.由上述结果表明，运用荧光标记菌株最优观测时间为喷施后第五天，观测效果最佳。
根据实验要求而设计，作为标记光合细菌荧光GFP的基因序列如下：
GFP全长片段基因序列(SEQ ID NO.1)
CGTTCGCCACTATTCAGTCGCCCCACTGGATCAGGGCGGTATATATTGACGTTACCGCGGCCAGTGATGCGCGTTGGCGGCAATCGCGCGATCGAGACAACGCGGATTCGAGGAGGATCTATTCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGGTTATGGTGTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAAGCGCGCCGGCGATCGAACGAAATACGAAGGGCGGCCCGCAAGGCCGCCCTT。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 湖南省植物保护研究所
<120> 一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体的构建及其电转化方法
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 892
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 1
cgttcgccac tattcagtcg ccccactgga tcagggcggt atatattgac gttaccgcgg 60
ccagtgatgc gcgttggcgg caatcgcgcg atcgagacaa cgcggattcg aggaggatct 120
attcatgagt aaaggagaag aacttttcac tggagttgtc ccaattcttg ttgaattaga 180
tggtgatgtt aatgggcaca aattttctgt cagtggagag ggtgaaggtg atgcaacata 240
cggaaaactt acccttaaat ttatttgcac tactggaaaa ctacctgttc catggccaac 300
acttgtcact actttcggtt atggtgttca atgctttgcg agatacccag atcatatgaa 360
acagcatgac tttttcaaga gtgccatgcc cgaaggttat gtacaggaaa gaactatatt 420
tttcaaagat gacgggaact acaagacacg tgctgaagtc aagtttgaag gtgataccct 480
tgttaataga atcgagttaa aaggtattga ttttaaagaa gatggaaaca ttcttggaca 540
caaattggaa tacaactata actcacacaa tgtatacatc atggcagaca aacaaaagaa 600
tggaatcaaa gttaacttca aaattagaca caacattgaa gatggaagcg ttcaactagc 660
agaccattat caacaaaata ctccaattgg cgatggccct gtccttttac cagacaacca 720
ttacctgtcc acacaatctg ccctttcgaa agatcccaac gaaaagagag accacatggt 780
ccttcttgag tttgtaacag ctgctgggat tacacatggc atggatgaac tatacaaata 840
agcgcgccgg cgatcgaacg aaatacgaag ggcggcccgc aaggccgccc tt 892

Claims (9)

1.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包括光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体包括PBBR1MCS-2穿梭载体和绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段(PpckA+GFP+TpckA)，所述绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段包含光合细菌启动子和终止子，所述绿色荧光蛋白基因GFP全长位于所述PBBR1MCS-2穿梭载体的ECORⅠ和SACⅠ两限制性内切酶位点之间。
2.根据权利要求1所述的一种重组载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，抽提光合细菌沼泽红假单胞菌的基因组DNA；
S2，根据所述步骤S1的基因组DNA设计基因PpckA和TpckA的扩增引物；
S3，根据载体pRK415载体序列设计基因GFP的扩增引物；
S4，以所述S1的基因组为模板，以步骤S2的扩增引物进行多重PCR扩增得到扩增产物PpckA和TpckA片段；
S5，将所述步骤S4中扩增产物TpckA连接到T载体上，得到重组载体；
S6，以载体PRK415为模板，以步骤S3的扩增引物进行PCR扩增得到扩增产物；
S7，酶切S4所述扩增产物PpckA和S5重组载体，得到酶切后的扩增产物和重组载体；
S8，连接酶切后的扩增产物和重组载体，得到重组基因片段载体；
S9，酶切S8重组片段基因载体的扩增产物和原始载体，得到重组基因片段和酶切后的原始载体；
S10，连接重组基因片段和原始载体得到前重组载体；
S11，单酶切S6扩增产物和S10前重组载体；
S12，将所述酶切后的扩增产物连接到所述酶切后的前重组载体上得到重组载体。
3.根据权利要求2所述的一种重组载体的构建方法，其特征在于：S4中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性45s,54℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环，最后延伸10min。
4.根据权利要求2所述的一种重组载体的构建方法，其特征在于：S6中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性45s,55℃复性30s,72℃延伸45s,35个循环，最后延伸7min。
5.根据权利要求2所述的一种重组载体的构建方法，其特征在于：S7中，采用限制性内切酶KpnⅠ和BglⅡ双酶切所述片段和载体，S8中，将酶切后扩增产物用T4 DNA连接酶将两个扩增片段连接在一起并连接到T载体上，S9中，采用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切所述扩增片段和原始载体，S10中，用T4 DNA连接酶将所述酶切后的扩增产物连接到原始载体上得到前重组载体，S11中，采用限制性内切酶BglⅡ单酶切所述扩增产物和前重组载体，S12中，将所述酶切后扩增片段用T4 DNA连接酶连接到所述酶切后的前重组载体上得到重组载体(工程菌)。
6.根据权利要求1-5所述的一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记的工程菌，其特征在于：所述荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌含有权利要求1或2所述的重组载体。
7.根据权利要求6所述的一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记的工程菌，其特征在于：所述工程菌在大肠杆菌培养基中培养至OD660为0.6-0.8，通过喷施，注射和灌根方法将所述工程菌施用于植物叶面，茎部和根部，观测工程菌在植物中定殖行为。
8.根据权利要求7所述的一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记的工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌培养基为LB培养基，所述培养基为光合细菌专用培养基。
9.一种权利要求6所述的荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，制备光合细菌沼泽红假单胞菌感受态细胞；
S1，将重组载体电击转化至光合细菌沼泽红假单胞菌感受态细胞中得到荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌工程菌。
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