CN113373102A - 一种检测爆炸物的新型光合细菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测爆炸物的新型光合细菌及其制备方法和应用。所述新型光合细菌的制备方法简单，将沼泽红假单胞菌中引入外源报告基因，利用菌株体内原有的生物感应元件识别爆炸物分子，通过报告基因表达产物产生信号来实现爆炸物分子的检测。所述新型光合细菌最终被用来制备沼泽红假单胞菌生物传感器，其含有启动子基因和转录调控蛋白基因、绿色荧光蛋白基因或荧光素酶基因。所述沼泽红假单胞菌生物传感器的检测范围宽、灵敏度高、方法简便、成本低、安全性强、环境友好且适应性强，具有广泛的应用前景。

Description

一种检测爆炸物的新型光合细菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及一种检测爆炸物的新型光合细菌及其制备方法和应用。
背景技术
传统的地雷等爆炸物检测方法主要有生物探测、金属探测、电磁感应探测、x-射线/中子背散射、声波探测、雷达探测等，这些传统的探测手段具有一定的局限性，如生物探测主要基于动物对于气味的感官反应，由于动物思想不可控制，探测具有很大的不确定性；金属、声波和雷达探测主要基于探测者的主观判断，而电磁感应探测、x-射线/中子背散射虽然探测方法灵敏度较高，但需要有笨重的仪器设备，具有较高的假阳性，并且大多数情况下需要身赴雷区进行现场检测（Onsite detection），具有很大的危险性，并且无法针对目前出现的陶瓷、塑料等新型材质的地雷进行探测。
检测爆炸物的生物感应技术主要由感应元件和报告元件构成。其中感应元件可以感应被检测物质，最常见的是细胞对靶标物质感应的启动子区域或调控蛋白；报告元件可以将感应信号放大至可被计量的程度，常用的有可产生颜色、荧光或生物发光信号的lacZ,gfp, 和lux基因。生物感应技术的优点是：使用方便、简单、可实现雷区外检测（Standoffdetection），更加安全。该方法颠覆了传统检测技术，规避了地雷等爆炸物材质的问题，而且利用微生物进行群体检测可有效地避免个体主观差异对探测爆炸物的影响，提高检测的客观准确性，可与传统的爆炸物检测方法互为补充，提高爆炸物检测的准确性和安全性。大肠杆菌作为研究生命科学的外源基因表达宿主，具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作等特点，因此使用大肠杆菌对于特定化合物的检测具有更简便、更快捷的优点。
以色列科学家Shimshon Belkin报道了对爆炸物分子2,4-DNT的感应元件，即yqjF启动子，利用GFP基因作为报告元件，构建了检测2,4-DNT的生物感应系统，检测限达到0.01mg/L（New Biotechnology, 2020, 59, 65-73）。除利用大肠杆菌作为生物传感器的宿主细胞外，研究人员还开发了基于酿酒酵母（Nat. Chem. Biol., 2007. 3(6), 325-330）和微藻（Biosens. Bioelectron., 2004. 19(10), 1319-1323）的2,4-DNT检测系统。虽然利用生物感应技术检测地雷已取得一定进展，但检测限的单位仍为微克/升级，然而挥发气体中2,4-DNT的浓度仅为纳克/升级，因此亟需提高灵敏度以满足实际检测的需求。另外，大肠杆菌、酿酒酵母和藻菌在自然界环境中不易存活，尤其是大肠杆菌是一种致病菌，在环境中大量投放这些种类的微生物会对生态环境带来很大的影响，因此亟需开发环境友好型微生物作为生物传感器的宿主菌。
发明内容
本发明提供了一种检测爆炸物的新型光合细菌及其制备方法和应用。所述的新型光合细菌具有很好的检测待测样品中爆炸物分子的作用，且效果明显。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种检测爆炸物的新型光合细菌的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）根据沼泽红假单胞菌的转录调控蛋白的氨基酸序列获得其编码的核苷酸序列，再查找其上游启动该编码核苷酸序列的启动子的核苷酸序列；
（2）将所述启动子的核苷酸序列与荧光报告基因分别经纯化、回收、酶切后相互连接，并转化沼泽红假单胞菌，鉴定阳性后得到工程菌株；
（3）活化所述工程菌株，得到新型光合细菌。
进一步的，所述转录调控蛋白具有下列氨基酸序列之一：
（1）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
（2）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
（3）与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的且具有相同功能的氨基酸序列。
进一步的，所述启动子的核苷酸序列具有下列核苷酸序列之一：
（1）SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
（2）SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
（3）与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的，且能够启动沼泽红假单胞菌的转录调控蛋白的编码核苷酸序列的核苷酸序列。
进一步的，所述荧光报告基因为绿色荧光蛋白编码基因gfp，其核苷酸序列如SEDID NO.5 所示。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的新型光合细菌。
本发明还提供了所述的新型光合细菌制备得到的爆炸物分子感应生物传感器。
本发明还提供了利用所述的新型工程菌株制备得到的沼泽红假单胞菌生物传感器。
本发明还提供了所述的沼泽红假单胞菌生物传感器在爆炸物分子检测中的应用。
进一步的，所述沼泽红假单胞菌生物传感器的使用方法为：将所述沼泽红假单胞菌生物传感器活化后，加入待测样品，培养2h-8h后，于激发光是485 nm、发射光是525 nm的条件下，利用酶标仪检测待测样品的荧光强度RFU值，出现荧光，说明待测样品中存在爆炸物分子，且荧光强度越强，说明待测样品中爆炸物分子的浓度越高。
进一步的，所述沼泽红假单胞菌生物传感器能够感应到的爆炸物分子的最低检测限浓度为0.001 mg/L -0.005 mg/L。
进一步的，所述爆炸物分子为2,4-DNT。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益技术效果：
（1）本发明将沼泽红假单胞菌中引入外源报告基因，并利用沼泽红假单胞菌体内原有的生物感应元件识别爆炸物分子，得到一种含有启动子基因和转录调控蛋白基因、绿色荧光蛋白基因或荧光素酶基因的新型光合细菌（新型工程菌株），并进一步通过报告基因表达产物产生信号来实现爆炸物分子的检测。
（2）本发明同时结合感应爆炸物分子的启动子和转录调控蛋白两个生物元件，使生物传感器对爆炸物的检测更为严谨，并显著提高了检测的准确性和灵敏度，并且通过报告基因，比如绿色荧光蛋白基因或荧光素酶基因表达产物产生信号来实现爆炸物分子的检测，使具有爆炸物分子的样品在酶标仪下产生可视化的荧光，使得检测变得更加简单，也可以不受地域的限制。
（3）利用沼泽红假单胞菌作为宿主细胞构筑的生物传感器具有检测范围宽、灵敏度高、方法简便、成本低、安全性强、环境友好且适应性强等优点，适用于自然环境中爆炸物分子的检测。因此，本发明的生物传感器在环境保护、反恐防恐和维护国家安全等领域有广泛的应用前景。
附图说明
图1为载体构建过程中的核酸电泳图；A：1-4-gfp基因片段和1-11-gfp基因片段扩增电泳检测图；B：pBBR1MCS-5-1-4-gfp载体构建的大肠杆菌转化子菌落PCR鉴定电泳图；C：pBBR1MCS-5-1-11-gfp载体构建的大肠杆菌转化子菌落PCR鉴定电泳图。
图2 为含有pUC-1-4-gfp载体的沼泽红假单胞菌对不同浓度2,4-DNT检测的荧光测定图。
图3为含有pBBR1MCS-5-1-4-gfp和pBBR1MCS-5-1-11-gfp载体的沼泽红假单胞菌对不同浓度2,4-DNT检测的荧光拍照图。
图4 为沼泽红假单胞菌生物传感器对2,4-DNT检测的灵敏度图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。
实施例1：基因表达载体的构建
沼泽红假单胞菌的转录调控蛋白的氨基酸序列分别如SED ID NO.1和SED IDNO.2所示，并根据正两条氨基酸序列找到其上游的启动子：
1-4启动子基因片段，其核苷酸序列如SED ID NO.3所示，由苏州金唯智公司化学合成至pUC-GW-Kan载体上，获得pUC-1-4载体。
1-11启动子基因片段，其核苷酸序列如SED ID NO.4所示，由苏州金唯智公司化学合成至pUC-GW-Kan载体上，获得pUC-1-11载体。
绿色荧光蛋白编码基因片段gfp，其核苷酸序列如SED ID NO.5 所示，由苏州金唯智公司化学合成分别亚克隆至pUC-1-4和pUC-1-11载体上，获得pUC-1-4-gfp和pUC-1-11-gfp载体。
1、扩增1-4-gfp基因片段，PCR扩增体系如下所示：
成分 体系
Buffer 25 μl
dNTP 1 μl
引物Rpal 1-4-F 2 μl
引物Rpal 1-4-R 2 μl
505 E 1 μl
模板 1 μl
ddH<sub>2</sub>O 18 μl
总体系 50 μl
引物序列如下：
Rpal1-4-F：AACTGCAGGCGAACGTCCCCTCCCGCGA（SED ID NO.6）；
Rpal1-4-R: CCCAAGCTTTTATTTGTACAATTCATCCA（SED ID NO.7）。
PCR程序为：
温度 时间
预变性温度95℃ 5 min
变性温度95℃ 15 s
退火温度55，62℃ 15 s
延伸温度72℃ 60 s
最后延伸温度72℃ 5 min
降温16℃ ∞
其中，变性、退火、延伸三步循环30个循环。
2、扩增1-11-gfp基因片段，PCR扩增体系如下所示：
成分 体系
Buffer 25 μl
dNTP 1 μl
引物Rpal 1-11-F 2 μl
引物Rpal 1-11-R 2 μl
505 E 1 μl
模板 1 μl
ddH<sub>2</sub>O 18 μl
总体系 50 μl
引物序列如下：
Rpal1-11-F：AACTGCAGTCTGCAGGATCCGCTGCCGG（SED ID NO.8）；
Rpal1-11-R：CCCAAGCTTTTATTTGTACAATTCATCCA（SED ID NO.9）。
PCR程序为：
温度 时间
预变性温度95℃ 5 min
变性温度95℃ 15 s
退火温度55，62℃ 15 s
延伸温度72℃ 60 s
最后延伸温度72℃ 5 min
降温16℃ ∞
其中，变性、退火、延伸三步循环30个循环。
PCR产物进行核酸凝胶电泳检测，从图1A中可以看出，成功扩增得到目的基因。回收后备用。
3、酶切片段1-4-gfp、1-11-gfp分别与载体pBBR1MCS-5，酶切体系如下：
片段1-4-gfp酶切体系
成分 体系
10X Buffer 2 μl
Pst I 1 μl
HindⅢ 1 μl
1-4-<i>gfp</i> 1.2 μl
ddH<sub>2</sub>O 24.8 μl
总体系 30 μl
片段1-11-gfp酶切体系
成分 体系
10X Buffer 2 μl
Pst I 1 μl
HindⅢ 1 μl
1-11-<i>gfp</i> 1.6 μl
ddH<sub>2</sub>O 24.4 μl
总体系 30 μl
载体pBBR1MCS-5酶切体系
成分 体系
10X Buffer 2 μl
Pst I 1 μl
HindⅢ 1 μl
pBBR1MCS-5 31 μl
ddH<sub>2</sub>O 12 μl
总体系 50 μl
片段和载体都在37℃水浴2h。回收酶切产物。
4、酶连片段与载体连接，体系如下所示：
成分 体系
T4 Buffer 2 μl
T4连接酶 1 μl
ATP 2 μl
酶切载体 11.4 μl
酶切片段 3.6 μl
总体系 20 μl
16℃过夜酶连。
5、将过夜酶连的产物分别转化入大肠杆菌DH5α感受态（北京全式金有限公司）。pBBR1MCS-5-1-4-gfp载体构建的大肠杆菌转化子菌落PCR体系如下：
成分 体系
2x Taq E 10μl
Rpal1-4-F 1μl
Rpal1-4-R 1μl
无菌水 7μl
菌液 1μl
总体系 20μl
PCR程序如下：
温度 时间
预变性温度95℃ 5min
变性温度95℃ 15s
退火温度55℃ 20s
延伸温度72℃ 60s（1-4：896bp）
最后延伸温度72℃ 5min
降温16℃ ∞
其中，变性、退火、延伸三步循环30个循环。
pBBR1MCS-5-1-11-gfp载体构建的大肠杆菌转化子菌落PCR体系如下：
成分 体系
2x Taq E 10μl
Rpal1-11-F 1μl
Rpal1-11-R 1μl
无菌水 7μl
菌液 1μl
总体系 20μl
PCR程序如下：
温度 时间
预变性温度95℃ 5min
变性温度95℃ 15s
退火温度55℃ 20s
延伸温度72℃ 60s（1-11：973bp）
最后延伸温度72℃ 5min
降温16℃ ∞
其中，变性、退火、延伸三步循环30个循环。
6、菌落经PCR验证（图1B和1C）后，经核酸序列测定验证，由擎科生物基因测序公司进行测序。测序结果显示，重组菌株中含有如SED ID NO.3或者SED ID NO.4的核苷酸序列。
实施例2. 沼泽红假单胞菌生物传感器的构建
1. 制备沼泽红假单胞菌感受态
提前一天晚上接200 μL菌液入10 mL的PM培养基，放入恒温光照培养箱内，第二天早上测OD，培养至OD≈0.5停止培养。
PM培养基体积为2.5 L，根据PM培养基的配方，用分析天平分别称取Na2HPO44.43625g、KH2PO4 4.2528125g、（NH4）2SO4 2.5g、Na2S2O3 5H2O 0.0622g、对氨基苯甲酸0.005g。
准备已灭菌的水一瓶，已灭菌的甘油一瓶，两支50 mL圆底离心管，一支15 mL离心管，灭菌的10 mL枪尖些许。
将所有准备物品（除了枪尖，包括菌）置于冰上冷却，同时预冷冷冻离心机于4℃。
取4.5 mL无菌水、500 μL甘油入15 mL离心管，吹吸、摇晃均匀，放在冰上备用（共5mL 10%甘油）。
菌液从玻璃管中倒入无菌50 mL圆底离心管，关盖，10000 rpm，4℃离心10 min。去上清，加入10 mL灭菌水重悬，10000 rpm，4℃离心10 min。去上清，加入10 mL灭菌水重悬，10000 rpm，4℃离心10 min。去上清，加入2 mL10%甘油重悬，10000rpm，4℃离心10 min。去上清，加入200 μL 10%甘油重悬，40 μL分装入一支1.5 mL离心管（事先预冷），共分出六支，于-80℃保存。
2. 电转化
准备工作：将两种质粒各稀释十倍，得到浓度为8.4 ng/μL的质粒；往10 mL的PM培养基中用针打入100 μL琥珀酸钠（1M）（终浓度为10 mM），混匀；将两个电转杯及其盖子放入超净台中开风吹干，紫外灭菌，酒精灯也开着，吹10 min后放在冰上冷却10 min；拿出两支感受态放在冰上融化。
40 μL感受态加入质粒2 μL，再加入80 μL的灭菌水，混匀后转入对应的电转杯，冰浴10 min后关盖。
电转化，1250V，约5ms，立即拿出放在冰上埋好，拿入超净台中，开盖，各加入1 mL已加琥珀酸钠的PM培养基。
混匀，吸入对应的1.5 mL离心管，关盖，塞进漂里，放进光照培养箱，养整晚（12-20h），第二天涂板。
第二天涂板：两支离心管经过20 h的复苏，壁上长出细密的红色小菌，6000 rpm，2min离心收菌，菌量较多。去上清，剩余150 μL上清进行重悬，吹吸混匀后转入之前倒的已加琥珀酸钠、抗生素的厚板进行涂布，一种菌涂一个板。最后封口，标记，倒置于暗箱中30℃培养。
实施例3. 沼泽红假单胞菌生物传感器对2,4-DNT的检测
1、前一天下午接种沼泽红假单胞菌（含有pBBR1MCS-5-1-4-gfp和pBBR1MCS-5-1-11-gfp质粒载体），第二天测OD在0.3左右，加入2,4-DNT，终浓度分为0 mg/L、0.05 mg/L、0.01 mg/L、0.005 mg/L、0.001 mg/L，每个梯度各3个平行。在培养0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h取菌测荧光，激发光是485 nm，发射光是525 nm。
结果如图2和3所示，随着培养时间的延长，荧光值逐渐增加。当2,4-DNT浓度是0.05 mg/L，0.01 mg/L，0.005 mg/L，0.001 mg/L时，荧光值都明显高于无2,4-DNT的菌液，而且随着DNT浓度的升高，荧光值也逐渐增加。
2. 前一天下午接种两株沼泽红假单胞菌（分别含有pBBR1MCS-5-1-4-gfp质粒载体和pBBR1MCS-5-1-11-gfp质粒载体），第二天测OD在0.3左右，加入2,4-DNT，终浓度分为0mg/L，0.05 mg/L，0.01 mg/L，0.005 mg/L，0.001 mg/L，每个梯度各3个平行。在培养10 h取菌测荧光，激发光是485 nm，发射光是525 nm。结果使用EC200表示，EC200的含义是荧光强度是无2,4-DNT条件下荧光强度两倍以上时的2,4-DNT浓度。
结果如图4所示，含有pBBR1MCS-5-1-4-gfp载体的沼泽红假单胞菌生物传感器的检测限度为0.001 mg/L，即1000 ng/L，比已报道的最低检测限低10倍；含有pBBR1MCS-5-1-11-gfp载体的沼泽红假单胞菌生物传感器的检测限度为0.005 mg/L，即5000 ng/L，比已报道的最低检测限低2倍。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种检测爆炸物的新型光合细菌及其制备方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 208
<212> PRT
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 1
Met Arg Arg Thr Lys Leu Glu Ala Glu Thr Thr Arg Glu Thr Ile Leu
1 5 10 15
Ala Val Ala Glu Arg Leu Phe Leu Glu Ser Gly Val Thr Glu Val Ser
20 25 30
Leu Glu Gln Ile Ala Val Ala Ala Gly Phe Thr Arg Gly Ala Val His
35 40 45
Trp His Phe Gln Asn Lys Gln Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu Asp Arg
50 55 60
Met Gly Leu Pro Leu Glu Gln Leu Ala Gly Gln Leu Glu Ile Asp Asp
65 70 75 80
Thr Leu Asp Pro Met Asp Glu Leu Val Arg Asp Met Thr Gly Arg Leu
85 90 95
Cys Glu Leu Glu Met Asp Pro Lys Arg Lys Arg Leu Ser Thr Tyr Leu
100 105 110
Val Asn Phe Ala Ala Val Glu Ala Pro Glu Arg Gln Arg Asn Phe Asp
115 120 125
Arg Lys Phe Arg Ser Ser Val Thr Ile Ile Phe Arg Leu Ala Glu Lys
130 135 140
Arg Gly Arg Leu Ala Pro His Trp Arg Pro Glu Ile Ala Ala Leu Ala
145 150 155 160
Phe Cys Gly Met Val Met Gly Leu Ile Asn Gln Trp Leu Asn Gly Glu
165 170 175
Thr Glu Phe Asp Met Arg Asn Asp Val Thr Ala Ala Val Arg Ala Phe
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Arg Ala Gln Pro Asp Asp Pro Lys Arg Pro Gly Ala
195 200 205
<210> 2
<211> 182
<212> PRT
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 2
Thr Ser Ser Asn Arg Ile Thr Ser Pro Ala Met Thr Ala Ser Lys Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Lys Pro Thr Arg Ala Gly Arg Lys Ala Pro Ala Val
20 25 30
Glu Thr Ala Pro Glu Ala Ser Glu Leu Lys Met Gly Glu Leu Ser Glu
35 40 45
Leu Leu Gly Tyr Ala Leu Lys Arg Ala Gln Leu Arg Val Phe Glu Asp
50 55 60
Phe Leu His Cys Val Ala Pro Val Gln Leu Thr Pro Ala Gln Phe Ser
65 70 75 80
Val Leu Leu Leu Leu Asp Ala Asn Pro Gly Arg Asn Gln Thr Glu Ile
85 90 95
Ala Thr Thr Leu Gly Ile Leu Arg Pro Asn Phe Val Ala Met Leu Asp
100 105 110
Ala Leu Glu Gly Arg Gly Leu Cys Val Arg Thr Arg Ser Pro Ser Asp
115 120 125
Arg Arg Ser His Ile Leu Met Leu Thr Asp Lys Gly Arg Ala Thr Leu
130 135 140
Ala Arg Ala Lys Lys Leu Val Ala Thr Arg His Glu Asp Arg Leu Thr
145 150 155 160
Glu Leu Leu Gly Arg Asp Asn Arg Asp Ala Leu Leu Ser Met Leu Ala
165 170 175
Thr Ile Ala Arg Glu Phe
180
<210> 3
<211> 131
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 3
gcgaacgtcc cctcccgcga aggcgcgtcg ttgcgcacct ccagctgccg gcagttgaat 60
tctgctcagg ctatttgata tggtgcataa caattatcga ttataagcgc aaggcccgcg 120
aggcgttcgc g 131
<210> 4
<211> 78
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 4
cgctgccggc agcggaaatg acttgaatgg gatttacata cgtttagtat gtatgtcaat 60
ggatgaggta aagacgcc 78
<210> 5
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180
gtcactactt tcgcgtatgg tcttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240
catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300
aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360
aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420
ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660
cttgagtttg taacagctgc tgggattacc catggtatgg atgaattgta caaataa 717
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aactgcaggc gaacgtcccc tcccgcga 28
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccaagcttt tatttgtaca attcatcca 29
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aactgcagtc tgcaggatcc gctgccgg 28
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccaagcttt tatttgtaca attcatcca 29

Claims (10)

1.一种检测爆炸物的新型光合细菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）根据沼泽红假单胞菌的转录调控蛋白的氨基酸序列获得其编码的核苷酸序列，再查找其上游启动该编码核苷酸序列的启动子的核苷酸序列；
（2）将所述启动子的核苷酸序列与荧光报告基因分别经纯化、回收、酶切后相互连接，并转化沼泽红假单胞菌，鉴定阳性后得到工程菌株；
（3）活化所述工程菌株，得到新型光合细菌。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转录调控蛋白具有下列氨基酸序列之一：
（1）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
（2）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
（3）与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的且具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列具有下列核苷酸序列之一：
（1）SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
（2）SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
（3）与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的，且能够启动沼泽红假单胞菌的转录调控蛋白的编码核苷酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述荧光报告基因为绿色荧光蛋白编码基因gfp，其核苷酸序列如SED ID NO.5 所示。
5.权利要求1所述的制备方法制备得到的新型光合细菌。
6.利用权利要求5所述的新型光合细菌制备得到的沼泽红假单胞菌生物传感器。
7.权利要求6所述的沼泽红假单胞菌生物传感器在爆炸物分子检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌生物传感器的使用方法为：将所述沼泽红假单胞菌生物传感器活化后，加入待测样品，培养2h-8h后，于激发光是485 nm、发射光是525 nm的条件下，利用酶标仪检测待测样品的荧光强度RFU值，出现荧光，说明待测样品中存在爆炸物分子，且荧光强度越强，说明待测样品中爆炸物分子的浓度越高。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌生物传感器能够感应到的爆炸物分子的最低检测限浓度为0.001 mg/L -0.005 mg/L。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述爆炸物分子为2,4-DNT。
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