CN113234748B - Rxr酵母转录激活系统及其加标沉积物毒理实验方法 - Google Patents

Abstract

RXR酵母转录激活系统及其加标沉积物毒理实验方法，包括将栉孔扇贝维甲酸受体基因RXRa分别连接到载体pGBT9和pGADT7上，分别构建pGBT9‑RXRa和pGADT7‑RXRa酵母表达质粒，将pGBT9‑RXRa及pGADT7‑RXRa共转化入Y187酵母细胞构建RXRa/RXRa二聚体酵母转录激活系统，筛选培养阳性克隆。制备有机锡加标沉积物模拟真实环境中有机锡污染样品，通过构建的酵母转录激活系统检测有机锡加标沉积物对栉孔扇贝RXR二聚体的诱导效应，操作简单便捷，为有机锡类污染物的新型检测技术开发提供了可能，为加标沉积物毒理实验提供了新的实验思路。

Description

RXR酵母转录激活系统及其加标沉积物毒理实验方法

技术领域

本发明涉及一种RXR酵母转录激活系统及其加标沉积物毒理实验方法，具体是通过构建重组质粒获得包含RXR二聚体的酵母转录激活系统，以及利用制备的加标沉积物检测此系统转录激活效应。

背景技术

环境中的许多内分泌干扰物(EDCs)通过大气沉降、城市与农业径流以及工业废水等途径进入水环境，有相当一部分污染物会吸附在悬浮颗粒物表面，最后附着在沉积物上，长时间连续沉降过程将污染物积聚在上部沉积物表层，从而使其成为二次扩散的潜在污染源。水生生物通过与亲脂性EDCs物理性接触或直接摄食这些颗粒物等途径暴露于污染环境中，因此，沉积物对营滤食性及底栖生活的软体动物产生长期的威胁，影响水体生态系统的稳态平衡。

沉积物加标毒理实验是一种基于沉积物中污染物浓度与生物效应之间关系的方法。其实质是向清洁的沉积物中加入已知数量的特定污染物，建立污染物与受试生物之间的剂量效应关系，以此来预测沉积物中污染物对生物的危害，并达到监测和科学管理沉积物污染的目的。OECD已经针对摇蚊幼虫(Chironomus tentans)与端足类淡水虾(Hyalellaazteca)等生物建立起沉积物加标测试标准，但常受生物繁殖与实验需时长等因素的影响，相比单细胞生物试验更费时费力。真核微生物如原生动物和微真菌为沉积物中第一营养级，为包括污染物在内的各种有机化合物提供营养，因此，它们可以作为评价水生系统生态毒性的有利指示生物。除了广泛使用的梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)之外，酿酒酵母作为研究背景清晰的单细胞真核生物，是基础生物学研究的优秀模型，也是环境水体或沉积物中外源物质毒性测试的重要生物工具，适合对污染物及污水的生态毒性进行生物测试。

发明内容

本发明的目的在于RXR酵母转录激活系统及其加标沉积物毒理实验方法，能够较为灵敏的检测沉积物中有机锡等污染物对RXR二聚体的干扰效应，操作简便，以克服现有技术的缺点与不足。

本发明通过以下技术方案实现：

一种RXR酵母转录激活系统，该系统含有pGBT9-RXRa酵母表达质粒和pGADT7-RXRa酵母表达质粒；所用宿主细胞为酿酒酵母Y187菌株；

所述两种酵母表达质粒所用载体分别为pGBT9与pGADT7，其中，pGBT9载体含有GAL4因子的DNA结合结构域(DNA-BD)以及营养缺陷型筛选标记Trp，pGADT7载体含有GAL4因子的激活结构域(AD)以及营养缺陷型筛选标记Leu。

其中，所述的pGBT9-RXRa和pGADT7-RXRa酵母表达质粒均融合了序列为SEQ IDNo.1的栉孔扇贝维甲酸X受体基因RXRa。

一种RXR酵母转录激活系统的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)酵母表达质粒pGBT9-RXRa的构建

利用Primer Premier 5.0软件设计受体基因RXRa的特异性引物，在引物两端添加特异性酶切位点及与载体pGBT9同源的15-20个核苷酸序列；

利用上述引物扩增靶基因保守区域片段：利用栉孔扇贝性腺组织cDNA模板及高保真酶进行PCR反应，胶回收纯化获得RXRa的目的插入片段；

选择载体pGBT9用于表达酵母转录因子DNA-BD，该载体的筛选标志为Trp，使用该载体的目的在于可以识别上游激活序列，并与之结合，利用限制性内切酶线性化处理克隆载体pGBT9；

利用凝胶电泳分离、纯化后，经无缝克隆反应连接目的片段RXRa，构建酵母表达质粒pGBT9-RXRa；

(2)酵母表达质粒pGADT7-RXRa的构建

利用Primer Premier 5.0软件设计受体基因RXRa的特异性引物，在引物两端添加特异性酶切位点及与载体pGADT7同源的15-20个核苷酸序列；

利用上述引物扩增靶基因保守区域片段：利用栉孔扇贝性腺组织cDNA模板及高保真酶进行PCR反应，胶回收纯化获得RXRa的目的插入片段；

选择载体pGADT7用于表达酵母转录因子AD，该载体的筛选标志为Leu，使用该载体的目的是表达AD之后可以启动酵母下游基因进行转录；利用限制性内切酶线性化处理克隆载体pGADT7；

利用凝胶电泳分离、纯化后，经无缝克隆反应连接目的片段RXRa，构建酵母表达质粒pGADT7-RXRa；

(3)酵母表达质粒共同转化进入Y187

将步骤(1)构建的酵母表达质粒pGBT9-RXRa及pGADT7-RXRa共转化入Y187酵母感受态细胞中，经SD/-Leu/-Trp固体培养基筛选得到RXR/RXR二聚体转录激活酵母菌株。

具体是利用醋酸锂转化法将上述构建成功的pGBT9-RXRa及pGADT7-RXRa酵母表达质粒共转化入酵母感受态细胞中，经SD/-Leu/-Trp固体培养基筛选得到RXR/RXR二聚体转录激活酵母菌株，确认RXR/RXR酵母转录激活系统构建成功。

所述的酵母菌株为酿酒酵母Y187，含有双拷贝子的编码β-半乳糖苷酶的报告基因(Lac Z)。

所述的RXR酵母转录激活系统的加标沉积物毒理实验方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备沉积物洗出液：

(1.1)阴性对照组空白沉积物洗出液的制备

将取自海洋的空白沉积物样品与YPDA酵母培养基混合置于烧杯中，磁力搅拌器搅拌后将其静置，吸出上清液并离心以进一步去除杂质，过滤去除杂菌后用作下一步实验；

(1.2)有机锡加标沉积物洗出液的制备

将有机锡用丙酮进行梯度稀释，将空白沉积物样品与有机锡稀释溶液混合均匀，静置使有机溶剂蒸发，依次得到梯度浓度的有机锡加标沉积物；

随后与YPDA培养基混合置于烧杯中，磁力搅拌器搅拌后将其静置，吸出上清液并离心以进一步去除杂质，过滤去除杂菌后，得到用作下一步实验的不同浓度的有机锡加标沉积物洗出液；

(2)利用制备的加标沉积物洗出液检测其激活效应：

(2.1)将所述的RXR/RXR转录激活酵母菌株于YPDA酵母培养基中培养，有机锡加标沉积物洗出液混合振荡诱导培养；

(2.2)待诱导培养结束，液氮冻融使酵母内容物释放，加入邻硝基苯-β-D-半乳糖苷溶液，通过测定Y187酵母菌株中双拷贝Lac Z基因编码的β-半乳糖苷酶的活性来表征待测有机锡加标沉积物对酵母转录激活系统的诱导效应。

所述的方法中，作为待测化学品的有机锡加标沉积物洗出液中，有机锡包括但不限于TBT、TPT、TBTO、TPrT。

本发明相对于现有技术具有以下有益效果：

有机锡化合物如TBT或TPT作为防污漆的活性成分而被大量引入水环境中，由于TBT在水环境中的溶解度较低，与固相颗粒物和悬浮物的亲和力较强，因此极易在沉积物中进行沉积聚集。沉积物多呈厌氧环境，在这种条件下，TBT的降解非常缓慢，其半衰期可长达几十年。基于这些原因，海洋沉积物被认为是TBT等有机锡在环境中的载体与最终归宿地，其也可以通过沉积物重悬等因素而重新扩散到水体中，因而本发明中制备的有机锡加标的沉积物可模拟真实自然生活环境，有利于进一步研究污染沉积物对生物体的干扰效应。

栉孔扇贝是中国重要的水产养殖种类，具有较高的经济价值，因其营滤食性和底栖生活的习性，受到长期暴露于EDCs的风险，目前已被广泛用作毒理学研究的模式生物和环境监测项目的哨点物种，本发明选用栉孔扇贝为研究对象，为有机锡等污染物干扰其RXR相关信号通路增添进一步的体外实验证据。

前人研究已将酿酒酵母作为受试生物进行加标沉积物毒理实验，依据酵母自身的遗传性能或发酵性能建立污染物的毒性剂量效应。本发明中构建的RXR/RXR酵母转录激活系统是基于酵母双杂交GAL4因子的原理构建而成，选用酿酒酵母Y187为宿主菌株，简化传统酵母双杂交技术中报告质粒的构建，免去繁琐的底物比色等步骤，通过检测Y187自身携带的Lac Z报告基因的表达表征污染物对RXR二聚体的诱导效应，检测方法简便快速，因而将其应用在实际环境样品中不仅可以用于检测干扰物与RXR的结合潜力，还可以初步表征其对RXR二聚体的干扰效应。

附图说明

图1TBT加标沉积物诱导酵母转录激活系统β-半乳糖苷酶的相对活性。

图2TPT加标沉积物诱导酵母转录激活系统β-半乳糖苷酶的相对活性。

图3TPrT加标沉积物诱导酵母转录激活系统β-半乳糖苷酶的相对活性。

图4TBTO加标沉积物诱导酵母转录激活系统β-半乳糖苷酶的相对活性。

具体实施方式

以下通过实施例及附图对本发明进行详细描述，以实施例1、实施例2与实施例3分别说明转录激活系统的构建以及加标沉积物的制备与激活活性效果。

实施例1转录激活系统的构建

构建酵母转录激活系统的特征在于包括以下步骤：

(1)将栉孔扇贝维甲酸X受体基因RXRa连接到克隆载体pGBT9上，构建重组质粒pGBT9-RXRa：

本实施例中选取栉孔扇贝(Chlamys farreri)维甲酸X受体基因的cDNA序列作为目的序列(GenBank登录号为JQ778315)；首先利用Primer5.0软件设计RXRa的引物，在引物两端添加SmaI与PstI酶切位点，引物序列如SEQ ID NO.2-3所示，下划线部分为限制性内切酶序列，斜体部分为载体接头序列；

利用上述引物对RXRa扩增靶基因保守区域片段，利用栉孔扇贝性腺组织cDNA模板及高保真酶

Max DNA Polymerase进行PCR反应，胶回收纯化获得插入目的片段；

利用限制性内切酶SmaI与PstI线性化处理克隆载体pGBT9；

利用凝胶电泳分离、纯化载体后，经必克隆反应连接上述目的片段，构建重组表达质粒，命名为pGBT9-RXRa；

(2)将栉孔扇贝维甲酸X受体基因RXRa连接到克隆载体pGADT7，构建重组质粒pGADT7-RXRa：

本实施例中选取栉孔扇贝(Chlamys farreri)维甲酸X受体基因的cDNA序列作为目的序列(GenBank登录号为JQ778315)；首先利用Primer5.0软件设计RXRa的引物，在引物两端添加SmaI与XhoI酶切位点，引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，下划线部分为限制性内切酶序列，斜体部分为载体接头序列；

利用上述引物对RXRa扩增靶基因保守区域片段，利用栉孔扇贝性腺组织cDNA模板及高保真酶

Max DNA Polymerase进行PCR反应，胶回收纯化获得插入目的片段；

利用限制性内切酶SmaI与XhoI线性化处理克隆载体pGADT7；

利用凝胶电泳分离、纯化载体后，经必克隆反应连接上述目的片段，构建重组表达质粒，命名为pGADT7-RXRa；

(3)酵母菌的转化

利用醋酸锂方法制备酵母菌株Y187感受态细胞，并将pGBT9-RXRa与pGADT7-RXRa共转化入Y187感受态细胞中；用SD/-Trp/-Leu固体培养基筛选出阳性克隆菌株，经测序鉴定确定质粒是否已成功转化酵母菌；此时确定酵母转录激活系统构建成功，命名为RXR/RXR。

实施例2加标沉积物的制备

(1)阴性对照组空白沉积物洗出液的制备

将空白沉积物位点的样品分别与YPDA酵母培养基按照1:4的体积比例置于烧杯中，搅拌1h后将其静置30min，使沉积物沉降到烧杯底部，吸出上清液以8000×g的速率离心20min，并用直径0.22μm的微孔滤膜过滤去除杂菌后用作下一步实验。

(2)有机锡加标沉积物洗出液的制备

四种有机锡(三丁基氯化锡TBT、三苯基氯化锡TPT、三丁基氧化锡TBTO或三正丙基氯化锡TPrT)分别用丙酮进行梯度稀释，将沉积物样品与有机锡稀释溶液混合均匀(100μg的沉积物+100μL有机锡稀释溶液)，静置1天，使有机溶剂蒸发，依次得到梯度浓度的有机锡加标沉积物。

具体制备体系如下：将1ml浓度为10nM-10⁴nM的TBT溶液分别与1mg沉积物搅拌混合均匀，待有机溶剂挥发后，即获得浓度为3.3μg/g-3300μg/g的TBT加标沉积物；将1ml浓度为10^-1nM-10⁴nM的TPT溶液分别与1mg沉积物搅拌混合均匀，待有机溶剂挥发后，即获得浓度为0.038μg/g-3800μg/g的TPT加标沉积物；将1ml浓度为10³nM-10⁶nM的TBTO溶液分别与1mg沉积物搅拌混合均匀，待有机溶剂挥发后，即获得浓度为596μg/g-596000μg/g的TBTO加标沉积物；将1ml浓度为10nM-10⁴nM的TPrT溶液分别与1mg沉积物搅拌混合均匀，待有机溶剂挥发后，即获得浓度为2.8μg/g-2800μg/g的TPrT加标沉积物。

将制备好的加标沉积物与YPDA酵母培养基按照1:4的体积比置于烧杯中，磁力搅拌器搅拌1h后将其静置30min，使沉积物沉降到烧杯底部，吸出上清液以8000×g的速率离心20min，并用直径0.22μm的滤膜过滤去除杂菌后用作下一步实验备用。

实施例3加标沉积物诱导酵母转录激活系统的转录活性检测

(1)酵母菌株的培养

挑取单克隆重组酵母菌株(Y187)添加到YPDA酵母培养基振荡培养，至OD600读数为0.1-0.4；随后分别加入制备好的沉积物洗出液样品系列(空白沉积物洗出液或有机锡(三丁基氯化锡TBT、三苯基氯化锡TPT、三丁基氧化锡TBTO或三正丙基氯化锡TPrT)加标沉积物洗出液)，于30℃的恒温摇床中振荡培养18h，测定并记录此时培养液的OD600值。

(2)酵母菌株的诱导与破壁处理

A.取1mL待测培养液于1.5mL EP管中，以13,300rpm离心1min，弃上清；加入1mL Zbuffer缓冲液，再次离心并弃上清；加入100μL Z buffer缓冲液后涡旋重悬沉淀，此时应为已诱导完毕的酵母菌株。

B.放入液氮中30s，然后立即放入37℃水浴30s使酵母菌破壁，反复重复冻融5～6次；用500μL Z缓冲液重悬细胞，将混合物在30℃水浴下预保温样品5min，留作显色反应。

(3)重组菌株的酶活检测

在上述预保温样品中加入200μl ONPG底物溶液，放入30℃水浴，立即计时；待出现浅黄色时(浅黄色显色的标准为等同于新鲜的LB培养液，此时可作为反应终止点)，加500μlNa₂CO₃溶液终止反应，记录所用时间t。将停止反应的混合物13,300rpm离心1min，弃上清，测定反应物OD420。

根据上述实验测得的吸光值与测定酵母菌体积及浓度计算β-半乳糖苷酶活性的酶活，计算公式：

β-Gal活性(U)＝OD420/(t×V×OD600)*1000

式中：时间t用min表示；OD420指产物邻硝基苯酚的光密度的测定；OD600指培养物的光密度的测定；测定体积V是指测定时所用培养物体积量，用mL表示。

(4)数据处理及分析

每个实验包括三个不同测试浓度重复，结果表示为平行实验的平均值±标准差。使用SPSS ver25.0进行单因素方差与差异显著性分析，使用GraphPad Prism ver.8计算EC50值并获取受试物对RXR/RXR酵母转录激活系统的剂量效应曲线。

检测阴性对照组中空白沉积物洗出液诱导RXR/RXR系统激活活性的结果表明本底值接近零，说明不具有激活活性。由图1-4可见，在一定加标范围内，有机锡加标沉积物洗出液均能以剂量依赖的方式诱导RXR/RXR系统中β-半乳糖苷酶的表达，均表现出剂量-效应关系。如表1所示，实际沉积物样品中若存在10^-3μg/g-10³μg/g浓度范围的有机锡污染物可以应用本研究构建的酵母转录激活系统检出，为环境中有机锡类污染物的新型检测技术开发提供了可能。

表1TBT、TPT、TPrT和TBTO加标沉积物诱导酵母转录激活系统的转录活性。其中，“*”代表经邓肯-图基事后检验与方差分析显示与DMSO对照组有显著性差异(*，P＜0.05；**，P＜0.01)。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> RXR酵母转录激活系统及其加标沉积物毒理实验方法

<141> 2021-05-11

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3051

<212> DNA

<213> 栉孔扇贝(Azumapecten farreri)

<400> 1

gatatttgaa gccataaatt gatcgcagca aaattcatgc taacatccat cttgggccat 60

aacagctggt tttaaaacca gtatggacca ttcagagatg gattcccttg acagtagtgt 120

cagtagtgct tctggttgta tatcatcagg atcaggcggc atgatgtcat caaacttacc 180

aatgaattcc atgtcggtga attctccacc ggacatcaaa ccagacctgt cccagttgaa 240

catggcgtcc ccacctggct cctacttcag ctatagttca ggcatgcagt ccataccatc 300

atcatcacag ccctccccac ccttgatgca ctctccagga atgcactctc cctcatcatc 360

tgttacctcc ccttcaatga tgtcgctggg atcccctggg tccgtatctt cacctcccaa 420

cccacacatg ccacacacaa cgctcagcag caaacacatc tgtgcaatat gtggagatcg 480

ggcatcagga aaacattatg gtgtctacag ttgcgaggga tgtaaaggtt tcttcaaaag 540

aacagtacgg aaggacctta cttatgcttg cagagatgat cgaaattgtg taatagataa 600

acgtcaaaga aacagatgtc agtactgccg atatatgaaa tgtctagcaa tgggcatgaa 660

aagagaagct gtccaagagg agagacaacg tgtgaaggag aagggtgaag gcgaggtaga 720

gagtaccagt agtgctaact cggatatgcc tgttgaaaag gttctggatg cagagctgtc 780

tgtggatccg aaactagaca cctacataga cacacagaaa gaccctgtga caaacatctg 840

ccaggctgct gacaaacagt tatttacatt ggtggcgtgg gctaggagaa taccacactt 900

cacagaacta cccctggagg atcaggtcat ccttctacgt gctggctgga atgagttgct 960

gattgctgca ttctctcatc gctccattgt tgtgaaggat ggtatactac tggcaacagg 1020

actccatgtt cacagaagca gtgcacacca ggctggtgtt ggaaccatct ttgatagagt 1080

cctcacagaa cttgttgcaa ggatgagaga gatgaaaatg gacaagaccg agttaggctg 1140

tcttagggcc attgtattgt ttaatccaga tgctaaaggc ttgtctgcta tacaagaagt 1200

tgaggctctt agagagaaag tgtatgcgtc attggaagaa tattcaaaaa cgcgttaccc 1260

agatgaacct gggaggtttg caaagctgtt acttagactt cctgcgctga ggagtatcgg 1320

acttaagtgc ctagaacact tgttcttctt caaattaatt ggtgatacac caatagacac 1380

tttcctgatg gaaatgctgg aaagtccaag cataggaacg tgacgcctgg atggatcgcg 1440

ggtggggtgg agagacgacc aggtcgtcct accaaaatat tgatggagat tctgccgtaa 1500

agatggaacc tggcctggaa tgtggcagtg tctcatgtgt tcgggtggta cacccaatga 1560

ttgttatatg gcatagctct acatcagtta cattagaaca ttaaaatcat atattatgta 1620

tatatataat gaaaaatcca tttttatgtt tgtgtcattt atagttgcac atcactgtgg 1680

ccgtcatgtt atgagacata agaacatacc tgatgttata aattgtacac ggaataactg 1740

tttttcccag atgtcctatt tttaataatt tctcccttgt tgttttagat ttattaaaaa 1800

tactattgat atgttgggtg ggttatgttt ggatatatgt tctttgtggt aatgatgtaa 1860

agaatcggtt aaactgtgcc atttgattgt ttgatgtgat acaacataaa atctttgtgt 1920

gaagtaacaa ctttctgttc actaaatatt tacttcctca tgttactgtt ggaaacccag 1980

ataaaatggc agttatttag aaagtttgaa taggttagaa caaaatttct ttgattcatt 2040

attttattat ttcaatgaag aagctgtact catgaaaagt aaggcagatg tatgtatgtt 2100

cagcaaagga ttttttggtt ctgacaatta atatgaagta tgattaacac tactgctgtt 2160

tgtgtaattg aataatctgt taaagtagtt ctgtattgtt tgaatattct atgtatcgat 2220

atgaaattat gatcccagac acaaacaggc aatggtaatt tgatacttat acatatctat 2280

ttagaaacca ttctgtgttt ggtaatttgg gaggaatttc atatgatgat catgatcaag 2340

aatcaccata aatcctggat gcaatagaat tcatttactt aaatcaagac ttaaattgga 2400

aagagaaaaa agtgttcttc ctagtatgta gatttgatgt tacttcatcc ctacagtccc 2460

aagaatgtag aaatggcaat aaatctgtag caattaaact ggcagcgttt tctccagcaa 2520

atttgtctat gatttaccag ttgcatggta cttcctttat tgaaagatac tatcaaaaca 2580

ttttagaatt catgtgacat caaatttagt atcttattgt cattactgaa gtatatatgt 2640

tagtgttttt cagagtgatg agtatatgct ttttattgtg aaatacacga catgccaatg 2700

tttggttgat gtaacttggt ttatcagtca gccatttcat aattagctta tacaagatca 2760

attaattgga attcctttgc tgcaagaaac ttttgtgaac atttttcatg atatataact 2820

atttcattta catgatttgt tggttaaaat gtatatgtat attaggagca gtaaatggat 2880

aggtctttca tggatttctg tcataaaatt cctgaattaa caaatacagg gatctttgtt 2940

aagtttgtct tgttgtctgg tgcaagacta agtccaaagc ttttattagc tgtaacaaat 3000

gaaatattac acttgacttt tgaaattcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3051

<210> 2

<211> 62

<212> DNA

<213> 栉孔扇贝(Azumapecten farreri)

<400> 2

gactgtatcg ccggtaattc ccgggtatgg accattcaga gatggatttt cagagatgga 60

tt 62

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 栉孔扇贝(Azumapecten farreri)

<400> 3

tcgcccggaa ttagcttggc tgcagtcacg ttcctatgct tggactt 47

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 栉孔扇贝(Azumapecten farreri)

<400> 4

gccagtgaat tccacccggg tatggaccat tcagagatgg att 43

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 栉孔扇贝(Azumapecten farreri)

<400> 5

atctacgatt catctgcagc tcgagtcacg ttcctatgct tggact 46

Claims (2)

1.基于RXR酵母转录激活系统的加标沉积物毒理实验方法，其特征在于

所述的RXR酵母转录激活系统包含pGBT9-RXRa酵母表达质粒和pGADT7-RXRa酵母表达质粒，所用宿主细胞为酿酒酵母Y187菌株；

所述两种酵母表达质粒所用载体分别为pGBT9与pGADT7，其中，pGBT9载体含有GAL4因子的DNA结合结构域以及营养缺陷型筛选标记Trp，pGADT7载体含有GAL4因子的激活结构域以及营养缺陷型筛选标记Leu；

所述的pGBT9-RXRa与pGADT7-RXRa酵母表达质粒均融合了序列为SEQ ID No.1的栉孔扇贝维甲酸X受体基因RXRa；

所述的加标沉积物毒理实验方法包括以下步骤：

（1）制备沉积物洗出液：

（1.1）阴性对照组空白沉积物洗出液的制备

将取自海洋的空白沉积物样品与YPDA酵母培养基混合置于烧杯中，磁力搅拌器搅拌后将其静置，吸出上清液并离心以进一步去除杂质，过滤去除杂菌后用作下一步实验；

（1.2）有机锡加标沉积物洗出液的制备

将有机锡用丙酮进行梯度稀释，将空白沉积物样品与有机锡稀释溶液混合均匀并静置，静置使有机溶剂蒸发，依次得到梯度浓度的有机锡加标沉积物；

随后与YPDA培养基混合置于烧杯中，磁力搅拌器搅拌后将其静置，吸出上清液并离心以进一步去除杂质，过滤去除杂菌后，得到用作下一步实验的不同浓度的有机锡加标沉积物洗出液；

（2）利用制备的加标沉积物洗出液检测其激活效应：

（2.1）将上述RXR酵母转录激活系统于YPDA酵母培养基中培养，分别与不同浓度的有机锡加标沉积物洗出液混合振荡诱导培养；

（2.2）待诱导培养结束，液氮冻融使酵母内容物释放，加入邻硝基苯-β-D-半乳糖苷溶液，通过测定Y187酵母菌株中双拷贝Lac Z基因编码的β-半乳糖苷酶的活性来表征待测有机锡加标沉积物对酵母转录激活系统的诱导效应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于作为待测化学品的有机锡加标沉积物洗出液中，有机锡包括TBT、TPT、TBTO、TPrT。

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