CN114381464B

CN114381464B - 一种基于转录组学分析的爆炸物分子检测感应元件及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN114381464B
Application number: CN202210025870.9A
Authority: CN
Inventors: 梁波; 杨建明; 王璐; 张鑫平
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-01-11
Filing date: 2022-01-11
Publication date: 2023-12-19
Anticipated expiration: 2042-01-11
Also published as: CN114381464A

Abstract

本发明公开了一种基于转录组学分析的爆炸物分子检测感应元件及其构建方法和应用。所述爆炸物分子检测感应元件包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，其具有显著提高爆炸物分子检测灵敏度的能力。本发明的爆炸物分子检测感应元件的构建方法步骤简单，使用方便，安全性高。本发明利用新型爆炸物分子检测感应元件进行爆炸物检测的方法可与传统的爆炸物检测方法互为补充，从而显著提高爆炸物检测的准确性、安全性和效率。

Description

一种基于转录组学分析的爆炸物分子检测感应元件及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于转录组学分析的爆炸物分子检测感应元件及其构建方法和应用。

背景技术

地雷是一种常见的隐蔽性极高的防御性爆炸火器。许多地雷在战场上并未引爆或排除，这些遗留地雷至今仍在威胁着当地人民的生命安全。因此针对地雷安全、有效的探测方法是非常值得研究的课题。

传统的地雷检测方法有生物探测、金属探测、声波探测、雷达探测等，这些传统的探测手段有一定的局限性。生物探测主要基于动物对于气味的感官反应，但由于动物思想不可控制，探测具有很大的不确定性；金属、声波和雷达探测主要基于探测者的主观判断，并且大多数情况下需要身赴雷区，具有很大的危险性，并且无法针对目前出现的陶瓷、塑料等新型材质的地雷进行探测。

为了解决以上这些问题，基于合成生物学的地雷检测方法应运而生。该方法可依据地雷的爆炸填充物为靶标化合物进行检测，规避了地雷材质的问题。利用细菌进行群体检测可以有效地避免个体主观差异对探雷的影响，提高地雷检测的客观准确性，可以与传统的地雷检测方法互为补充，进而提高地雷检测的准确性和安全性。

生物传感器通过挖掘自然界中对靶标化合物敏感的感应元件与适于体现感应强度的报告元件进行组装，通过对报告元件所产生信号的读取分析，感应出靶标化合物的浓度、位置等信息。因此，不断的研究全新的、具有更灵敏检测度的生物传感器对于遗留地雷的探测和发展具有深远的意义。

发明内容

本发明提供了一种基于转录组学分析的爆炸物分子检测感应元件及其构建方法和应用。本发明通过对光合细菌基因组内含有的爆炸物分子检测感应元件进行挖掘，来实现对爆炸物分子进行实时高效的检测。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种基于转录组学分析的爆炸物分子检测感应元件，所述爆炸物分子检测感应元件具有下列核苷酸序列之一：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(3)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

(4)与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有95％以上同源性的核苷酸序列。

进一步的，所述爆炸物分子检测感应元件具有显著提高爆炸物分子检测灵敏度的能力。

本发明还提供了所述的爆炸物分子检测感应元件的构建方法，包括以下步骤：

(1)对沼泽红假单胞菌进行爆炸物分子刺激，并提取沼泽红假单胞菌的RNA，进行转录组学分析；

(2)利用N-pBR-C55-luxPleio质粒扩增luxPleio片段，得到luxPleio载体；

(3)提取沼泽红假单胞菌基因组为模版，扩增得到PCR产物；

(4)将luxPleio载体扩增片段和PCR产物的片段进行融合、转化感受态细胞，得到重组菌株；

(5)活化重组菌株，利用爆炸物分子进行诱导后，进行自发光检测，筛选具有荧光值的重组菌株，该重组菌株中则含有爆炸物分子检测感应元件。

进一步的，所述步骤(1)中爆炸物分子的刺激浓度为0.1mM-0.25mM。

优选的，所述步骤(1)中爆炸物分子的刺激浓度为0.25mM。

进一步的，所述步骤(2)中扩增引物的序列为：

pBR-C55-lux-F：

5'-TGCTCTAGAAGCTCAGGAGGGGCAAATATGAT-3'；

pBR-C55-lux-R：

5'-TGCTCTAGAAAAACCGGGTACCCGGGGATCC-3'。

进一步的，所述步骤(3)中的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6-SEQ IDNO.11所示。

本发明还提供了所述的爆炸物分子检测感应元件在用于制备提高爆炸物分子检测灵敏度的表达盒、试剂盒或制剂中的应用。

进一步的，所述爆炸物分子检测感应元件检测爆炸物分子的灵敏度≥1μg/L。

优选的，所述爆炸物分子检测感应元件检测爆炸物分子的灵敏度为0.001mg/L-10mg/L。

本发明还提供了所述的爆炸物分子检测感应元件在用于爆炸物分子的实时检测中的应用。

进一步的，所述爆炸物分子包括2,4-DNT、1,3-DNB、邻苯二酚、对苯二酚、甲基苯醌。

本发明还提供了一种检测灵敏度高的突变感应元件，所述突变感应元件的核苷酸序列由核苷酸序列为SEQ ID NO.2的第401位的脱氧核苷酸G突变为A和第465位的脱氧核苷酸G突变为T获得的。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明通过转录组学分析挖掘新型的爆炸物分子检测感应元件，得到的感应元件具有显著提高爆炸物分子检测灵敏度的能力，该方法简单，使用方便，安全性高；而且该感应元件对多种爆炸物分子的降解产物均有明显效果。该方法颠覆了传统检测技术，开发出一种针对爆炸物分子快速高效安全检测的关键技术，不仅可用于军工业上地雷等炸药的检测，也可用于生态系统中的环境污染物的检测。本发明利用新型的爆炸物分子检测感应元件进行爆炸物检测的方法可与传统的爆炸物检测方法互为补充，从而显著提高爆炸物检测的准确性、安全性和效率。因此对军事、反恐和环保等都具有重要的意义。

附图说明

图1为构建08510-luxPleio的重组质粒图谱。

图2为构建23685-luxPleio的重组质粒图谱。

图3为构建20975-luxPleio的重组质粒图谱。

图4为构建的工程菌株08510诱导自发光检测结果。

图5为构建的工程菌株23685诱导自发光检测结果。

图6为构建的工程菌株20975诱导自发光检测结果。

图7为阴性对照BW25113诱导自发光检测结果。

图8为构建的工程菌株灵敏度测试的自发光检测结果。

图9为构建的工程菌株底物特异性的自发光检测结果。

图10为定向进化改造的工程菌株的初筛曝光结果图。

图11为定向进化改造的工程菌株灵敏度测试的自发光检测结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

1、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的培养和总RNA的提取

(1)配制沼泽红假单胞菌的PM培养基，其配方如下(1L的液体培养基)：

因沼泽红假单胞菌为光合厌氧菌株，其所需要的营养环境需要无氧状态，所以制备的液体培养基需要先除气1小时，再分装到管中，最后进行121℃，20min灭菌。

(2)接菌培养：每支PM管分装的培养基体积为10mL，加入100μL的0.5M醋酸钠作为基本碳源和200μL的沼泽红假单胞菌菌液。用针管吸取后注入到管中，放于光照培养箱中30℃培养至OD₆₀₀＝0.4。

(3)2,4-DNT刺激：将培养良好的菌株进行2,4-DNT刺激，2,4-DNT的浓度为0.25mM。

(4)利用Trizol法进行沼泽红假单胞菌总RNA提取，由美吉生物公司进行转录组学处理。

提取RNA步骤如下：

1)前期准备：珠磨机、离心机提前预冷，水浴锅提前设置22℃；提前用RNase清除喷雾进行台面额实验用品处理。

2)10,000rpm，1min，收集适量的菌体(OD＝0.5，5mL左右)，使用枪尖尽量吸净液体；

3)向每个样品中加入1mL Trizol溶液，用枪尖来回抽取数次至液体澄清，无明显颗粒；

4)将样品转移至提前预冷的、装有1g 0.1mm玻璃珠的2mL的振荡管中，用珠磨机于4200rpm，振荡90s，冰浴90s，共5次，结束后，室温22℃孵育3min；

5)加入200μL氯仿，用手充分振荡15s后，室温孵育3min；

6)12,000×g，4℃，离心15min；

7)小心转移大约560μL上层无色相至新的1.5mL的EP管，加入500μL异丙醇，颠倒数次充分混匀，室温孵育10min；

8)15,000×g，4℃，离心10min(注意观察白色沉淀的量)；

9)小心吸取全部上清并弃去，加入1mL现配的75％乙醇(RNase-free)冲洗底部RNA沉淀，15,000×g，4℃，离心5min；

10)小心吸取全部上清并弃去，加入0.75mL现配的75％乙醇(RNase-free)冲洗底部RNA沉淀，15,000×g，4℃，离心5min；

11)小心吸取全部上清并弃去，风干RNA(时间不宜过长，5min左右，不要彻底晾干RNA)；

12)将RNA溶解于50μL RNase-free Water，上下吹吸即可；

13)取数个PCR管，分别分装2-3μL，分别用于浓度测定、电泳验证及后续反转录等操作。

(5)转录组学数据表

根据转录组学数据分析，对Fold-Change在3-7之间的感应元件进行挖掘。

2、提取沼泽红假单胞菌的基因组

利用真菌基因组试剂盒(Sangon Biotech，货号：FB08KA3595)提取沼泽红假单胞菌的基因组，具体步骤如下：

(1)于超净台中用针管吸取2mL新鲜菌液，加入2mL离心管中，10,000×g离心收菌弃上清。向其中加入200μL Buffer Digestion、2μLβ-巯基乙醇和20μL Proteinase K溶液，震荡混匀。55℃水浴1h，在水浴过程中，每10min颠倒混匀一次，可促进样品裂解；

(2)加入100μL Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min；

(3)室温10,000×g离心5min，将上清转移到新的1.5mL离心管中；

(4)加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀；

(5)加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀；加入无水乙醇后可能会产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用；

(6)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再12,000×g室温离心1min，倒掉收集管中的废液；

(7)将吸附柱放回收集管，加入500μL PW Solution，12,000×g离心30s倒掉收集管中的废液；使用前注意溶液中是否按比例加入异丙醇；

(8)将吸附柱放回收集管，加入500μL Wash Solution，12,000×g离心30s倒掉收集管中的废液，使用前注意溶液中是否按比例加入无水乙醇；如果想提高DNA的含量，可重复本步骤；

(9)将吸附柱重新放回收集管中，于12,000×g室温离心2min，去除残留的WashSolution；将吸附柱打开盖子于55℃金属浴锅中放置7分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的Wash Solution，Wash Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验；

(10)取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μL ddH₂O放于55℃金属浴锅中静置2min，12,000×g室温离心2min，收集DNA溶液。放于-20℃保存。

实施例2

1、构建含有08510感应元件的重组菌株

(1)luxPleio载体的扩增

以N-pBR-C55-luxPleio(Shemer B,Shpigel E,Glozman A et al.Genome-widegene-deletion screening identifies mutations that significantly enhanceexplosives vapor detection by a microbial sensor.N Biotechnol.2020.59:65-73)为模版，利用pBR-C55-lux-F和pBR-C55-lux-R进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增luxPleio片段，PCR扩增体系如下所示：

PCR程序为：25循环×(98℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 2min)；68℃ 5min；16℃∞。

pBR-C55-lux-F：

5'-TGCTCTAGAAGCTCAGGAGGGGCAAATATGAT-3'(SEQ ID NO.4)；

pBR-C55-lux-R：

5'-TGCTCTAGAAAAACCGGGTACCCGGGGATCC-3'(SEQ ID NO.5)。

PCR产物利用Vazyme液体回收纯化试剂盒进行液体回收纯化。

液体回收纯化试剂盒(Vazyme，货号：DC301-01)步骤：

1)向含有扩增产物的离心管中加入5倍体积的Buffer GDP，涡旋摇匀。

2)短暂离心后，将Fast Pure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes2mL收集管，把≤700μL的溶胶转移到吸附柱中，13400×g，离心1min。

3)弃废液，加入700μL Buffer GW(加入乙醇)至吸附柱中，13400×g，离心1min。

4)重复步骤3)。

5)弃废液，空离2min。

6)把吸附柱置于1.5mL离心管中，在55℃金属浴中晾干7min，加入50μL的ddH₂O，静置2min，离心2min，洗脱DNA并保存于-20℃。并标记好名称和日期。

(2)以沼泽红假单胞菌基因组为模版，引物08510-F和引物08510-R，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增08510片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其PCR扩增体系如下所示：

PCR程序为：98℃ 40s；32循环×(98℃ 10s，52℃ 15s，72℃ 16s)；72℃ 5min；16℃∞。

08510-F：5'-GCCCCTCCTGAGCTTCTAGACCAGCCCTACAATTTTACCA-3'(SEQ ID NO.6)；

08510-R：5'-GGGTACCCGGTTTTTCTAGAATTGCACGTACCTCGATTGG-3'(SEQ ID NO.7)。

PCR产物利用Vazyme液体回收纯化试剂盒进行液体回收纯化，洗脱的DNA保存于-20℃，并标记好名称和日期。

(3)使用Vazyme的2×ClonExpress Mix，将纯化后的luxPleio载体和感应元件基因按照一定比例混合于10μL融合反应体系中，放于50℃水浴融合30min；

融合体系为：

(4)将融合产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上生长过夜，通过氨苄青霉素抗性筛选后，挑取平板上生长良好的单个菌落进行菌落PCR验证得到的重组质粒。通过测序，鉴定重组质粒的基因序列，载体图谱如图1所示。

(5)将各个重组质粒的单菌落于10mL含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中过夜活化，提取质粒，转入大肠杆菌BW25113感受态中，进行涂布，37℃培养箱生长。最终获得含有08510感应元件的重组菌株。

实施例3

1、构建含有23685感应元件的重组菌株

(1)luxPleio载体的扩增

步骤同实施例2。

(2)以沼泽红假单胞菌基因组为模版，引物23685-F和引物23685-R，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增23685片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其PCR扩增体系如下所示：

PCR程序为：98℃ 40s；32循环×(98℃ 10s，52℃ 15s，72℃ 30s)；72℃ 5min；16℃∞。

23685-F：5'-GCCCCTCCTGAGCTTCTAGACGGTTCAACCTTGCATCGCT-3'(SEQ ID NO.8)；

23685-R：5'-GGGTACCCGGTTTTTCTAGAGCTGCCGGCACCAGGCTTGT-3'(SEQ ID NO.9)。

融合体系为：

(4)将融合产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上生长过夜，通过氨苄青霉素抗性筛选后，挑取平板上生长良好的单个菌落进行菌落PCR验证得到的重组质粒。通过测序，鉴定重组质粒的基因序列，载体图谱如图2所示。

(5)将各个重组质粒的单菌落于10mL含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中过夜活化，提取质粒，转入大肠杆菌BW25113感受态中，进行涂布，37℃培养箱生长。最终获得含有23685感应元件的重组菌株。

实施例4

1、构建含有20975感应元件的重组菌株

(1)luxPleio载体的扩增

步骤同实施例2。

(2)以沼泽红假单胞菌基因组为模版，引物20975-F和引物20975-R，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增20975片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其PCR扩增体系如下所示：

PCR程序为：98℃ 40s；32循环×(98℃ 10s，52℃ 15s，72℃ 1min 18s)；72℃5min；16℃∞。

20975-F：5'-GCCCCTCCTGAGCTTCTAGACAAATCTCGCTGACGCGGGC-3'(SEQ ID NO.10)；

20975-R：5'-GGGTACCCGGTTTTTCTAGATCGTTCCTCCTGAAACCGTC-3'(SEQ ID NO.11)。

融合体系为：

(4)将融合产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上生长过夜，通过氨苄青霉素抗性筛选后，挑取平板上生长良好的单个菌落进行双酶切验证得到的重组质粒。通过测序，鉴定重组质粒的基因序列，载体图谱如图3所示。

(5)将各个重组质粒的单菌落于10mL含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中过夜活化，提取质粒，转入大肠杆菌BW25113感受态中，进行涂布，37℃培养箱生长。最终获得含有20975感应元件的重组菌株。

实施例5

1、重组菌株对爆炸物的自发光检测

(1)将08510、23685、20975三种重组菌株分别至于10mL的含相应抗性LB培养基，37℃摇床培养8-10小时，以2％的接种量转接于已加终浓度为2％葡萄糖和1mM硫酸镁溶液的M9液体培养基中，在37℃摇床中培养至OD₆₀₀在0.15-0.2之间，进行2,4-DNT诱导。

具体步骤为：先制备5mg/mL的母液浓度，根据C₁V_I＝C₂V₂，配制不同浓度梯度的2,4-DNT，分别得到0mg/L、1mg/L、10mg/L、50mg/L的终浓度。

取96孔白色酶标板，每孔加入98μL的菌液，做3个平行，以减少实验误差，并做阴性对照，再加入2μL的2,4-DNT，透明封板膜。使用酶标仪进行过夜检测。30℃孵育，每隔20min检测一次RLU值。根据得到的自发光数值，处理实验数据并绘制图像，如图4-6所示。说明该3个重组菌株对2,4-DNT具有明显的响应能力。

2、灵敏度测试

将含有23685感应元件的重组菌株至于10mL的含氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃摇床培养8-10小时，以2％的接种量转接于含有终浓度2％葡萄糖、1mM硫酸镁溶液的M9液体培养基中，在37℃摇床中培养至OD₆₀₀在0.15-0.2之间，细化2,4-DNT的终浓度进行灵敏度测试。

具体步骤为：先制备5mg/mL的母液浓度，根据C₁V_I＝C₂V₂，配制不同浓度梯度的2,4-DNT，分别得到0mg/L、0.001mg/L、0.005mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L的终浓度。

取96孔白色酶标板，每孔加入98μL的菌液，每个浓度做3个平行，以减少实验误差，再分别加入2μL的2,4-DNT，用透明封板膜进行封口。使用酶标仪进行过夜检测。30℃孵育，每隔20min检测一次RLU值。根据得到的自发光数值，处理实验数据并绘制图像，如图8所示。说明含有23685感应元件的重组菌株对爆炸物分子检测的灵敏度达到0.05mg/L。

3、底物特异性测试

将含有23685感应元件的重组菌株至于10mL的含氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃摇床培养8-10小时，以2％的接种量转接于含有终浓度2％葡萄糖、1mM硫酸镁溶液的M9液体培养基中，在37℃摇床中培养至OD₆₀₀在0.15-0.2之间，分别加入2,4-DNT、1,3-DNB、对苯二酚、邻苯二酚和甲基苯醌。

具体步骤为：先制备5mg/mL的母液浓度，根据C₁V_I＝C₂V₂，配制不同浓度梯度的1,3-DNB、对苯二酚、邻苯二酚和甲基苯醌，分别得到0mg/L、1mg/L的终浓度。

取96孔白色酶标板，每孔加入98μL的菌液，做3个平行，以减少实验误差，再分别加入2μL的2,4-DNT、1,3-DNB、对苯二酚、邻苯二酚和甲基苯醌，用透明封板膜进行封口。使用酶标仪进行过夜检测。30℃孵育，每隔20min检测一次RLU值。根据得到的自发光数值，处理实验数据并绘制图像，如图9所示。说明含有23685感应元件的重组菌株对爆炸物分子的降解产物具有明显的响应，特别是邻苯二酚，其灵敏度达到0.5mg/L。

实施例6

1、对含有23685感应元件的重组菌株进行定向进化改造

(1)luxPleio载体的扩增

步骤同实施例2。

(2)以沼泽红假单胞菌基因组为模版，引物23685-F和引物23685-R，进行易错聚合酶链式反应(易错PCR)，扩增23685突变片段，其PCR扩增体系如下所示：

按照上述体系进行点突变PCR反应。PCR程序是为：95℃ 30min；30循环×(95℃30s，52℃ 30s，72℃ 30s)；72℃ 5min：16℃ 5min。

23685-F：5'-GCCCCTCCTGAGCTTCTAGACGGTTCAACCTTGCATCGCT-3'(SEQ ID NO.8)；

23685-R：5'-GGGTACCCGGTTTTTCTAGAGCTGCCGGCACCAGGCTTGT-3'(SEQ ID NO.9)。

(3)使用Vazyme的2×ClonExpress Mix，将纯化后的luxPleio载体和突变的感应元件基因按照一定比例混合于10μL融合反应体系中，放于50℃水浴融合30min；

融合体系为：

(4)将融合产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上生长过夜，通过氨苄青霉素抗性筛选后，挑取平板上生长良好的单个菌落进行菌落PCR验证得到的重组质粒。通过测序，鉴定重组质粒的基因序列。

2、对含有突变23685感应元件的工程菌株文库进行筛选

(1)将重组质粒的单菌落于10mL含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中过夜活化，提取质粒，转入大肠杆菌BW25113感受态中，进行涂布，37℃培养箱生长。最终获得含有突变23685感应元件的重组菌株。

(2)初筛：使用植物活体荧光仪观察平板菌落亮度情况。每次转化涂布60余个含有终浓度为1mg/L的2,4-DNT的LB固体平板，每个平板约有100个克隆，共计7000个转化子，均长势良好。进行植物活体荧光仪曝光处理，选择高曝光的单菌落10个。如图10所示。

(3)复筛：将10个高曝光的单菌落逐个用无菌牙签挑下，进行LB小瓶活化，37℃摇床培养8-10小时，以2％的接种量转接于已加终浓度为2％葡萄糖和1mM硫酸镁溶液的M9液体培养基中，在37℃摇床中培养至OD₆₀₀在0.15-0.2之间，进行2,4-DNT诱导。

具体步骤为：先制备5mg/mL的母液浓度，根据C₁V_I＝C₂V₂，配制不同浓度梯度的2,4-DNT，分别得到0mg/L、0.001mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、1mg/L的终浓度。

取96孔白色酶标板，每孔加入98μL的菌液，做3个平行，以减少实验误差，并做阴性对照，再加入2μL的2,4-DNT，透明封板膜。使用酶标仪进行过夜检测。30℃孵育，每隔20min检测一次RLU值。根据得到的自发光数值，处理实验数据并绘制图像，如图11所示。得到了一个检测灵敏度显著提高的突变株。结果显示出突变株对2,4-DNT的灵敏度检测达到了0.001mg/L，比野生型提高了50倍。

(4)对其进行核苷酸序列测序验证发现，含有23685感应元件的突变菌株其401位的脱氧核苷酸G突变为A和465位的脱氧核苷酸G突变为T。

因此，本发明通过对沼泽红假单胞菌进行爆炸物分子刺激，转录组分析，挖掘获得了3个对爆炸物分子检测灵敏度显著提高的感应元件，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，并且可以将本发明获得的感应元件制备成表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系等，以达到其更广泛的使用场景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种基于转录组学分析的爆炸物分子检测感应元件及其构建方法和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 256

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attgcacgta cctcgattgg ttcgatcgtg gagggctgcg acgttgccga cccgcacggg 60

aagaaccacg cggcgattag gctgctagat gtggtatttt ccgttaaaga tgcagctccg 120

taaggatact gaggactgct agattaccgt cggcggtaat aatccaccca accgcgaaat 180

tgcaattgag ctgcatcaaa acgacaaacg cgcgccgaag cgcgcgtttg tgtagctggt 240

aaaattgtag ggctgg 256

<210> 2

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgccggca ccaggcttgt tctccaccac aaagctctgg ccgagcttct cggagagata 60

ctgacacaca aggcgggaca gcacgtcggt cgcgccgccg gccgcataag gcacgatcca 120

cttcaccggg cgattcgggt acgccgccgc gtctgccagc gccggcgaga ccagccgcgc 180

accgacggcg cagatcgccg caccagcggc cgtcccaagc aatgctctcc tgctgatcgt 240

catcgcatcc tccatgtgat cctgctggag actccgatag cgcagacgaa ccgcctcgcg 300

catgcacgga ccgcgatcgt ggtaaaggcg tatgaacggc gagacgccat tcctcgggat 360

tagcgataag ttgtcgttaa ttccgtcgct tcatactcgc gccgcgggct cgaggtgccc 420

cactgttacg cgccggagct gcggcgcacc gcggcaaggt taacgagacc tttcagaccg 480

agcgatgcaa ggttgaaccg 500

<210> 3

<211> 1300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgttcctcc tgaaaccgtc gggccccgcc ttcagttggt ggccttgacg ctgctcacca 60

gcgtcggctt gtcgagatac tccgtcggaa acagcttctt cagggcctcg atcttcggca 120

ggtcgttgta ggcaatatag ggctgagtgg ggtgcagcgt caggtagtcc tggtggtagg 180

cctccgcggc ataaaacccc ttcagcgggc cgaccttggt gacgatcggt gcgccgaaca 240

ccttggcggc gtcgagctgc gcgatatagg cgtcggcgat ccgcttctgc tcgtcgctcg 300

tggtgaagat cgccgagcga tattgcggcc cggtgtcggg cccctggcga tcgagctgcg 360

tcggatcgtg cgcgaccgag aagtagatct gcaacagctt gccgtaggag atccgcttcg 420

gatcgtattt gacctcgact gcctcggcgt gaccggtggt cccggtcgaa accagcggat 480

agctcgcact tgctttgctg ccgcccgcat accccgacaa cgcattcacc acgccggccg 540

tgtgctggaa cacgccctgc acgccccaga agcagccgcc ggcgaacacc gcggtctgaa 600

tgccgccggc ttccttggcg tcgagttgcg gcggtggaat cacgaccggc tcctcggccg 660

cccgggacgg tccgagcgcg gaccatgcga gcagcccggc ggccgcggcg cagagagcaa 720

gacgaccaaa tgaagcgcgc atgagctgtc ctcgcgaggt tgaggttgag gccgttagcc 780

tgaccgttgc gctcaagata cgaggctcgc gccgggctgt tacggaggcg cggacacgag 840

ttcgtgactg ccacctcgca ttggggagag gccgcagcat cgcgggcgcg agacaattcg 900

gtaattttgc accgggccgg ccgcctgcaa ccgcccgacg ccgctcggcc cgatcccaat 960

cctaaatgac ggaggccgca ggccgcattg cattaaggat agccgctctc ggggctggat 1020

caccccttcg tgaagtgcca aaatgcgctc ggcccggtgg cggaagatta acgcgggggc 1080

ggtgcaacgc tctttttcct ggttcaagtc caggctgggc ctccagatct tgccgaaatt 1140

gccggttgac gggcgactgg aaggcctttc gccgcccggg aaactggtct aagacacctc 1200

ccgcgcgcct gggacggccc ggcgcttgaa gacctgaggg acgcgcggct gcgcgccctt 1260

tttttgtgcc cgcgatttcc gcccgcgtca gcgagatttg 1300

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgctctagaa gctcaggagg ggcaaatatg at 32

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgctctagaa aaaccgggta cccggggatc c 31

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcccctcctg agcttctaga ccagccctac aattttacca 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggtacccgg tttttctaga attgcacgta cctcgattgg 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcccctcctg agcttctaga cggttcaacc ttgcatcgct 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gggtacccgg tttttctaga gctgccggca ccaggcttgt 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcccctcctg agcttctaga caaatctcgc tgacgcgggc 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggtacccgg tttttctaga tcgttcctcc tgaaaccgtc 40

Claims

1.一种基于转录组学分析的爆炸物分子检测感应元件，其特征在于，所述爆炸物分子检测感应元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述爆炸物分子为2,4-DNT。

2.权利要求1所述的爆炸物分子检测感应元件的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用N-pBR-C55-luxPleio质粒扩增luxPleio片段，得到luxPleio载体；

（2）提取沼泽红假单胞菌基因组为模版，扩增得到PCR产物；所述PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（3）将luxPleio载体扩增片段和PCR产物的片段进行融合、转化感受态细胞，得到重组菌株；

（4）活化重组菌株，利用爆炸物分子进行诱导后，进行自发光检测，筛选具有自发光数值的重组菌株，该重组菌株中则含有爆炸物分子检测感应元件。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中爆炸物分子的刺激浓度为0.1 mM -0.25 mM。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中扩增引物的序列为：

pBR-C55-lux-F：

5'-TGCTCTAGAAGCTCAGGAGGGGCAAATATGAT-3'；

pBR-C55-lux-R：

5'-TGCTCTAGAAAAACCGGGTACCCGGGGATCC-3'。

5.权利要求1所述的爆炸物分子检测感应元件在用于制备提高爆炸物分子检测灵敏度的表达盒、试剂盒或制剂中的应用，其特征在于，所述爆炸物分子为2,4-DNT。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述爆炸物分子检测感应元件检测爆炸物分子的灵敏度≥1 μg/L。

7.权利要求1所述的爆炸物分子检测感应元件在用于爆炸物分子的实时检测中的应用，其特征在于，所述爆炸物分子包括2,4-DNT、1,3-DNB、邻苯二酚、对苯二酚、甲基苯醌。

8.一种检测爆炸物分子灵敏度高的突变感应元件，其特征在于，所述爆炸物分子为2,4-DNT；所述突变感应元件的核苷酸序列由核苷酸序列为SEQ ID NO.2的第401位的脱氧核苷酸G突变为A和第465位的脱氧核苷酸G突变为T获得的。