CN117126795A - 一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用，该菌株的构建方法包括：(1)将正向调控生物膜合成的调控片段非编码RNA Fen36融合至表达载体pHT43，得到pHT43‑fen36；(2)将pHT43‑fen36电转化至解淀粉芽孢杆菌LPB‑18N，得到生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌LPB‑18Nfen36。本发明获得的生物膜高产菌株，在IPTG诱导下，生物膜形成能力增加3.59倍，本发明的工程菌株展现出高生物膜合成能力，其在农作物促生增产和维持根系健康生长中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产生物膜的工程菌株：解淀粉芽孢杆菌LPN-18Nfen36的构建及应用。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是芽孢杆菌属、产孢子的兼性厌氧型革兰氏阳性菌，细胞多呈杆状，广泛分布于食物、水、植物表面和动物肠道以及土壤环境等多个生态系统。迄今为止，解淀粉芽孢杆菌由四个种属组成：解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，暹罗芽孢杆菌(B.siamensis)，贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)和中村芽孢杆菌(B.nakamurai)。尽管解淀粉芽孢杆菌由不同的菌株组成，具有不同的性质和用途，但就菌株安全角度而言，它们被认为是一种安全、无毒且可应用于生产的工业微生物。1998年，解淀粉芽孢杆菌已被美国食品和药物管理局(FDA)认定为安全微生物(Generally Recognized as Safe,GRAS)，可应用于食品工业和动物饲料的发酵生产中。随着高通量测序技术的发展，目前已完成全基因簇测序的解淀粉芽孢杆菌有50余株，其中形成生物膜，生成芽孢和分泌抗菌肽是它们的共性，随着功能基因簇的挖掘和研究进一步开展，解淀粉芽孢杆菌的生物功能和待开发的工业应用逐渐被明晰，其在食品加工、生物制药和环境治理方面具有广泛的应用前景。而作为一种著名的根际微生物，其在农业生产的作物增产和病虫害防御方面已有广泛的研究，在其发挥植物促生中，生物膜使其与作物黏附、发挥生物促生作用的前提，因此研究解淀粉芽孢杆菌生物膜合成，优化其合成路径具有重要意义。
生物膜(Biofilm)是由微生物分泌出的胞外基质将自身包裹而形成的一种聚集体，能够帮助其附着于生物或非生物体表面。生物膜被认为是地球上最广泛和最成功的生命模式之一，在大多数自然环境中，生物膜也是微生物最主要的生活方式。目前研究表明，生物膜可以保护微生物免受极端环境的影响，可以提高微生物对紫外线辐射、极端温度和pH、金属离子、营养匮乏、抗生素等不良条件的耐受性。生物膜对不良环境的耐受性能够为微生物种群创造合适的栖息地，使得微生物之间物质和信息的交换更加稳定，因此是微生物在自然环境中生长的一种自我保护机制。生物膜中微生物的形态结构及其对环境因素的敏感性和生物学特性与浮游微生物也都有所不同，生物膜的三维结构为微生物提供了天然的屏障和保护层。此外，胞外基质中的固定微生物比浮游微生物更能抵御外界不良环境。在农林业中，定殖于植物根际或植物内的细菌、真菌等各类微生物，会与植物组成一种植物-微生物共生体，而生物膜能够帮助微生物更好的提高自身在复杂环境中的生存竞争能力，是生防细菌占据生态位的重要存在形式，能够帮助其抵御不良环境，同时筑起一道防止植物病原微生物入侵的“围墙”，以此来适应和抵御外界环境的压力。
sRNA(Small sRNA)是一种长约50-500nt的基因表达调控因子，在细菌中通过与靶基因或靶蛋白配对结合，调控细菌的生理功能应对各种环境变化。作为一类重要的生理生化调控因子，在细菌中普遍存在且高度保守。关于sRNA的研究在革兰氏阴性细菌的细胞膜合成研究较为透彻，而在革兰氏阳性菌的生物膜合成调控作用知之甚少。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，本发明的工程菌株展现出高生物膜合成能力，其在农作物促生增产和维持根系健康生长中具有良好的应用前景。
本发明还提供所述基因工程菌的构建方法与应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，所述基因工程菌以解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，将非编码RNA Fen36转化到解淀粉芽孢杆菌所得。
非编码RNA Fen36的DNA序列如下：
>SEQ ID NO.1
CAATGATAAAGGATTGCAGAGACTCTAATGAGACGTAGATGACGTTTTT
TCCTTCGGCTTTTCCGAAGTAGACGTTGTTCGGCACGTCATAGTTGGCC
TTCATATAGTTTTCCACATCCGTTACATCGCTTGAATCGGCAAGCGCGC
GCTGGCTGTTTGATTTCACATTCTGCACGGCATCGTAAATCGTAAAGTT
GTACGTGCCCAAGTATTTCACCAGATAGTTTCGGTCAAATGAGCGTGTC
AAAAGCTCAGGACGATCGGATTCCGCGACGGCGAGGTTGATCAGGAA
CACAAGCACGGCGGAAGCCAAAACGATTCTGAATGATTTCTTCGCCGG
TTTTTCAGCCGTTTTTTTCATCTTAAG
作为优选，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌LPB-18N。
本发明所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将基因Fen36融合至表达载体pHT43，得到重组载体pHT43-fen36；
(2)将重组载体pHT43-fen36转化至解淀粉芽孢杆菌，得到生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌。
其中，步骤(1)中以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，设计引物扩增Fen36序列，Pgrac的扩增模板来自表达载体pHT43，利用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切，酶切验证成功后将其作为模板进行PCR扩增启动子片段。将扩增的Pgrac片段与非编码RNA Fen36通过重叠验证PCR连接，待验证成功后，采用无缝克隆进行融合片段(Pgrac-Fen36)与表达载体pHT43连接，经氯霉素和氨苄霉素的双重筛选，获得重组载体pHT43-fen36。
其中，步骤(1)中引物如下：
fen36-F：cgattacaaaaacatcagccgtaggatcctctagCAATGATAAAGGATT
fen36-R：gacgtcgactctagaggatcctacgCTTAAGATGAAAAAAACGGCTGAAA
PgracF：GATGACCTCGTTTCCACCGGAAttagcttggtaccagctattgtaac
PgracR：AGAGTCTCTGCAATCCTTTATCATTGggatcctacggctgatgtttttgtaatcg
本发明所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌在农作物促生增产和维持根系健康生长中的应用。
本发明所述功能非编码Fen36对解淀粉芽孢杆菌的生物膜合成具有正向调控中的应用。
本发明所述非编码RNA Fen36基因在促进生物膜形成中的应用。
其中，所述非编码RNA Fen36的过表达能促进解淀粉芽孢杆菌生物膜形成中的应用。
其中，所述解淀粉芽孢杆菌为LPB-18N。
本发明基于前期的生物信息学筛选分析，通过同源重组技术构建了生物膜的高产菌株解淀粉芽孢杆菌LPB-18Nfen36(非编码RNA Fen36的过表达)，生物膜形成的结晶紫分析结果显示，菌株LPB-18Nfen36的生物膜形成能力增加3.59倍，细胞的运动能力增强，且维持着解淀粉芽孢杆菌LPB-18N的抗菌脂肽Fengycin高产性能，以上生理特性说明工程菌株解淀粉芽孢杆菌LPB-18Nfen36具有植物病虫害防护、植物根系附着以及促生增长的潜在功能，将在农业生产中具有良好的应用前景。
本发明通过同源重组技术构建非编码RNA Fen36的过表达菌株，突变菌株的生物膜合成量分析检测发现，与出发菌株解淀粉芽孢杆菌LPB-18N相比，非编码RNA Fen36的过表达使得生物膜产量提高3.59倍，结合对突变菌株的细胞运动性，抗菌脂肽产量以及卓越的生物膜形成特性，该菌株在植物生防以及植物促生方面具有良好的应用潜力。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明通过对转录组学数据的生物信息学预测，并对靶非编码RNA进行分子功能验证，从转录后调控途径的角度首次探究了非编码RNA对解淀粉芽孢杆菌LPB-18生物膜的合成调控作用。相比于转录前调控，转录后调控更复杂，且在解淀粉芽孢杆菌的生物膜合成代谢中研究报道较少。本发明中的非编码RNA Fen36是一段新型调控片段，关于其在细菌代谢中的作用也未被报道。
(2)本发明通过过表达非编码基因RNA Fen36构建得到基因工程菌解淀粉芽孢杆菌LPB-18Nfen36兼具抗菌脂肽Fengycin分泌和生物膜合成性能，生物膜形成量相比于出发菌株解淀粉芽孢杆菌LPB-18N提高了3.59倍，其在植物的病虫害防治和作物根部促生中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为fen36的过表达菌株LPB-18Nfen36的构建；a：启动子Pgrac扩增；b：fen36扩增及fen36-Pgrac连接片段；c：重组载体的构建；d：菌落PCR结果；e：载体酶切验证；
图2为fen36的敲除菌株LPB-18NΔfen36的构建；a：空载体pCBS验证；b：pCBS-Δfen36重组质粒的菌落PCR；c：pCBS-fen36重组质粒的酶切验证；d：解淀粉芽孢杆菌LPB-18NΔfen36敲除菌株的PCR验证；
图3为不同菌株生物膜的合成分析；a：不同菌株的生物膜形成深孔板观察图(1-4分别为：解淀粉芽孢杆菌LPB-18N、解淀粉芽孢杆菌LPB-18NΔfen36、解淀粉芽孢杆菌LPB-18和解淀粉芽孢杆菌LPB-18Nfen36)；b：结晶紫定量检测
图4为不同菌株在半固体液面的泳动能力分析；a：菌株LPB-18(d＝0.98cm)；b：菌株LPB-18N(d＝2.23cm)；c：菌株LPB-18NΔfen36(d＝1.11cm)；菌株LPB-18Nfen36(d＝5.41cm)；
图5为不同菌株对尖孢镰刀菌的拮抗能力及Fengycin产量分析；不同菌株对尖孢镰刀菌的拮抗能力及Fengycin产量分析A：a-d依次为野生菌株解淀粉芽孢杆菌LPB-18、解淀粉芽孢杆菌LPB-18N、解淀粉芽孢杆菌LPB-18NΔfen36和解淀粉芽孢杆菌LPB-18Nfen36；B：不同菌株的Fengycin产量。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
本发明中使用的出发菌株解淀粉芽孢杆菌LPB-18N，为申请人在先前申请CN110951667A中的公开保藏菌株，保藏时间为2019年10月22日，保藏编号为CGMCCNO.18720，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。其中，解淀粉芽孢杆菌LPB-18N是在野生型解淀粉芽孢杆菌LPB-18的基础上，敲除非编码RNA FenSr3获得的高产抗菌脂肽Fengycin的工程菌株。
解淀粉芽孢杆菌LPB-18N感受态的制备
将活化的解淀粉芽孢杆菌LPB-18N接种于LBS培养基中(50mL摇瓶，装液量20mL)，摇床(37℃，180r/min)振荡过夜培养，将细菌培养至对数生长期。将过夜培养的LBS培养基按1：25(v/v)转接于新鲜的LBS培养基中(150mL摇瓶，装液量50mL)，置于恒温摇床(37℃，180r/min)振荡培养3h。培养期间用紫外分光光度计检测，待OD600值达到0.5时，向摇瓶中添加甘氨酸，使最终体系浓度为10mg/mL，摇床继续振荡培养。待OD600值达到0.9时，将摇瓶置于冰上静置30min。静置结束后用预冷的低温离心机离心去上清(4℃，8000r/min，5min)，收集菌体，并用预冷的电转化液清洗3次，最后用预冷的重悬液重悬感受态细胞(1:100(v/v))，并用EP管分装(每管100μL)置于-80℃保存备用。
本发明中使用的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pCBS以及载体pHT43均为公知的载体和质粒，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院提供。
实施例1
以菌株LPB-18N的基因组为模板，分别扩增非编码RNA Fen36的序列全长。通过同源重组法构建过表达载体pHT43-fen36，具体操作如下：以解淀粉芽孢杆菌LPB-18N基因组为模板，fen36-F和fen36-R为引物，扩增非编码RNA Fen36序列，Pgrac的扩增模板来自表达载体pHT43，利用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切，酶切后验证成功后，以PgracF/R为引物，扩增完整的Pgrac序列，将扩增的Pgrac片段与非编码RNA Fen36通过重叠验证PCR连接，得到融合片段(Pgrac-Fen36)。利用Universal CloneMix无缝克隆试剂盒，按试剂盒说明书进行融合片段与载体pHT43的连接，37℃连接反应10min后于60℃下终止反应并转化至E.coliDH5α，涂布于氯霉素和氨苄青霉素的双抗培养基中筛选阳性克隆子，菌落PCR验证后进行液体培养，提取质粒验证片段大小，并送往公司测序，验证成功后即获得重组载体pHT43-fen36。其中非编码RNA Fen36的序列如SEQ ID NO.1所示。
所用引物如下SEQ ID NO.2-5：
fen36-F：cgattacaaaaacatcagccgtaggatcctctagCAATGATAAAGGATT
fen36-R：gacgtcgactctagaggatcctacgCTTAAGATGAAAAAAACGGCTGAAA
PgracF：GATGACCTCGTTTCCACCGGAAttagcttggtaccagctattgtaac
PgracR：AGAGTCTCTGCAATCCTTTATCATTGggatcctacggctgatgtttttgtaatcg
为了探究非编码RNA Fen36在解淀粉芽孢杆菌生物膜调控中作用，通过同源重组法构建fen36的过表达菌株LPB-18Nfen36。
本实施例通过将非编码RNA Fen36与强启动子Pgrac连接，构建pHT43-fen36重组载体，电转化至解淀粉芽孢杆菌LPB-18N中获得突变菌株。如图1所示，本实施例首先以pHT43载体为模板，经BamH I线性化后进行启动子全长Pgrac的扩增，全长266bp，如图1中a所示，泳道1-3条带条带完整，整个泳道无其它杂带，说明引物特异性高且序列已得到有效扩增。图1中b的3-4泳道是以菌株LPB-18N基因组为模板扩增非编码RNA Fen36的结果，全长367bp，图1中b的1和2泳道则是融合片段(Pgrac-Fen36)，该片段全长633bp，条带大小与理论相符，说明片段连接成功。图1中c是对表达载体pHT43的双酶切验证，泳道出现两个条带，说明过表达载体pHT43-fen36构建成功。
实施例2
过表达菌株LPB-18Nfen36的构建
高生物膜合成能力菌株LPB-18Nfen36的构建过程如下：将上述获得的重组载体pHT43-fen36通过电转化至提前准备的感受态解淀粉芽孢杆菌LPN-18N(感受态制备详见实施例3)中，电转化发生在预冷的电转杯(2mm)中，2500v，4.5ms电击后，立即加入1mL LBS培养基于电转杯中，轻柔混匀后，缓慢吸取至2mL离心管中，置于摇床(30℃，120r/min)温和振荡培养3h，室温下2500g离心3min，弃去900μL上清液，用剩下的培养基将离心管中菌体重悬，均匀涂布在含有氯霉素和氨苄青霉素的双抗性LB固体平板。将LB固体平板正置于30℃培养箱10min，待平板上的菌液被完全吸收后，倒置平板，过夜培养，通过菌落PCR扩增和电泳检测验证，即获得高生物膜合成能力菌株LPB-18Nfen36。
实施例3
fen36敲除菌株构建
为了更透彻理解非编码RNA Fen36对生物膜的合成作用，利用同源重组法同时构建非编码RNA Fen36的敲除菌株LPB-18NΔfen36，作为本发明的阴性对照。
菌株LPB-18NΔfen36的构建过程如下：
(1)首先，使用OMEGA细菌基因组DNA抽提试剂盒提取解淀粉芽孢杆菌LPB-18N基因组DNA，使用下述引物PCR扩增非编码RNA Fen36的上下游同源臂，通过重叠PCR连接上下游片段，获得融合片段，琼脂糖凝胶电泳检测连接质量后送往生物公司测序验证。
Fen36上游片段(355bp)和下游片段引物(557bp)引物如下：
L-Fen36-F：CCATGGTACCCGGGAGCTCGTGATAGCGGTCGTGTTA
L-Fen36-R：GTTTTACCTTGTCCCGTTTGTATCCAGGAAGTAGAAGGGGR-Fen36-F：GCCTTCTACTTCCTGGATACAAACGGGACAAGGTAAAAC
R-Fen36-R：CCTCGCGTCGGGCGATATCGGATCTTATCGTACAGGCCGTC
(2)温敏载体pCBS验证及重组载体构建
通过温度敏感性质粒pCBS敲除解淀粉芽孢杆菌LPB-18N中的非编码RNA Fen36，首先进行质粒大小判定，确定无误后进行双酶切处理，将BamH I与EcoR I按照1：1比例混合，获得线性化载体pCBS，酶切成功后将其与步骤(1)获得的融合片段连接，待过夜连接后在含有氨苄青霉素抗性的平板中筛选阳性克隆子，并借助菌落PCR验证连接是否成功，即获得重组质粒pCBS-ΔFen36。
(3)敲除载体pCBS-Fen36的电转化
解淀粉芽孢杆菌LPN-18N的感受态细胞制备：将过夜培养的LBS培养基按1：25(v/v)转接于新鲜的LBS培养基中(150mL摇瓶，装液量50mL)，置于恒温摇床(37℃，180r/min)振荡培养3h。培养期间用紫外分光光度计检测，待OD600值达到0.5时，向摇瓶中添加甘氨酸，使最终体系浓度为10mg/mL，摇床继续振荡培养。待OD600值达到0.9时，将摇瓶置于冰上静置30min。静置结束后用预冷的低温离心机离心去上清(4℃，8000r/min，5min)，收集菌体，并用预冷的电转化液清洗3次，最后用预冷的重悬液重悬感受态细胞(1:100(v/v))，并用EP管分装(每管100μL)置于-80℃保存备用。
取约500ng待转化质粒pCBS-ΔFen36于100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，将感受态细胞及质粒转移至冰上预冷的电转杯(2mm)中，2500v，4.5ms电击后，立即加入1mL LBS培养基于电转杯中，轻柔混匀后，缓慢吸取至2mL离心管中，置于摇床(30℃，120r/min)温和振荡培养3h，室温下2500g离心3min，弃去900μL上清液，用剩下的培养基将离心管中菌体重悬，均匀涂布在含有红霉素抗性的LB固体平板。将LB固体平板正置于30℃培养箱10min，待平板上的菌液被完全吸收后，倒置平板，过夜培养，通过菌落PCR扩增和电泳检测验证。图2显示了菌株LPB-18NΔfen36的构建过程，其中图2中a为敲除载体pCBS的双酶切验证，图2中b是对重组载体的菌落PCR验证，如图所示，泳道的条带清晰且单一，说明融合载体pCBS-fen36构建成功，图2中c是重组载体的双酶切验证，泳道1为空载体pCBS，泳道2-3是对融合载体的双酶切，发现泳道内出现两个条带，与预期相符，说明载体构建成功；图2在d是对菌株LPN-18N和菌株LPB-18NΔfen36的fen36上下游片段的PCR，结果显示菌株LPB-18NΔfen36构建成功。
实施例4
生物膜表型测定
分别将菌株LPB-18N、菌株LPB-18NΔfen36、菌株LPB-18N fen36接种于装有TSB的96深孔板中，置于33℃静置培养，48h后观察生物膜形成状况，并通过结晶紫半定量生物膜的合成量。生物膜合成量的操作为：首先，用注射器小心吸走深孔板中的培养液(尽量保留上层生物膜的完整性)，用无菌的PBS缓冲液漂洗3次，室温下晾干；其次，用1mL的甲醛清洗生物膜(浸没生物膜即可)，静置5min后吸取甲醛，重复1-2次后置于40℃烘箱中干燥；最后，用1mL 0.5％结晶紫染液染色10min，随后用无水乙醇清洗并收集无水乙醇洗涤液在590nm下测定其吸光值，测定时以无水乙醇为空白对照，每个样品重复3次。最终依据吸光值大小评估不同菌株的生物膜形成能力。芽孢杆菌能形成致密的生物膜，其有助于它们附着于生物或非生物介质表面，并保护微生物不受极端环境的影响。不同菌株的生物膜形成能力如图3所示，菌株LPB-18N在深孔板中形成较为清晰的褶皱，而野生菌株的生物膜表面松散且易被挑破，该结果与前期的实验结果相符。菌株LPB-18NΔfen36的生物膜絮状漂浮物，难以聚集成膜。而添加IPTG的菌株LPB-18N fen36形成的生物膜褶皱严密，三维结构清晰。根据生物膜合成量，采用分光光度计检测590nm处的吸收波，fen36过表达菌株LPB-18N fen36生物膜合成能力较其出发菌株LPB-18N增强了3.59倍，而在其敲除菌株中恢复至野生菌株水平(图3)，同时也进一步说明非编码RNA Fen36在生物膜的合成中扮演着重要正向调控作用。
实施例7
运动能力测试
配置0.5％固体LB琼脂培养基，吸取5mL已活化的解淀粉芽孢杆菌LPB-18N、解淀粉芽孢杆菌LPB-18NΔfen36、解淀粉芽孢杆菌LPB-18N fen36培养液接种于平板中央，置于33℃恒温培养箱中静置培养，24h后记录细胞运动能力。细菌能通过依赖鞭毛运动促进其在优势的生态位附着，其能帮助细菌趋利避害，适应多变的生存环境。将出发菌株LPB-18N和非编码RNA Fen36过表达菌株LPB-18N fen36和敲除菌株LPB-18NΔfen36接种至半固体LB中，24h后记录它们的运动圈，结果如图4所示。在固-气界面上，菌株LPB-18和LPB-18N的运动能力较弱，而菌株LPB-18N fen36具有较强的表面附着和运动能力，半固体界面的细胞运动轨迹呈发射状，运动圈直径为5.42cm；菌株LPB-18NΔfen36的运动黏附能力显著减弱，运动圈直径仅为1.11cm。运动性也是该高产生物膜的突变菌株的重要检测指标，本发明的工程菌运动性越强，说明该菌株的趋利避害能力越强，在实际生产应用中的应用越广泛，其生存能力更强。
实施例8
抑菌活性测定
采用平板对峙法测定野生菌株LPB-18、菌株LPB-18N、菌株LPB-18NΔfen36、菌株LPB-18Nfen36对尖孢镰刀菌的抑菌活性，具体操作入下：用已灭菌的打孔器(6mm)在已经活化的尖孢镰刀菌平板中打孔，后将菌饼接种于PDA平板中央。用移液枪吸取5μL菌液滴加在病原菌菌饼的两侧(大概距离平板中央2.5cm)，以解淀粉芽孢杆菌LPB-18为对照。待菌液晾干后用封口膜封口，置于28℃黑暗培养7d，实验重复3次，测量抑菌圈直径大小。解淀粉芽孢杆LPB-18具有拮抗多种食源性病原菌的能力，包括尖孢镰刀菌和黑曲霉，通过联合RP-HPLC和MALDI-TOF-MS分析，鉴定主要的抑菌物质为Fengycin同系物(FengycinA和FengycinB)。以尖孢镰刀菌为指示菌，通过平板对峙实验验证不同菌株的抗病性能，结果如图5中A所示。野生菌株LPB-18表现出较弱的尖孢镰刀菌拮抗能力，抑菌圈直径为2cm，相同的培养条件下三株突变株(LPB-18N、LPB-18Nfen36和LPB-18NΔfen36)表现出较强的抑菌能力，抑菌圈大小为5±0.37cm，不同突变株的抑菌圈直径差异不显著。其中，菌株LPB-18Nfen36与尖孢镰刀菌共培养期间，其较强的生物膜形成能力占据了尖孢镰刀菌的生态位，进而表现出与其它突变株相近的拮抗能力。进一步为了探究sRNA Fen36对Fengycin产量影响，对不同菌株的Fengycin产量进行定量分析，如图5中B所示，结果显示突变株的Fengycin产量差异不显著。
Claims (10)
1.一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，将非编码RNA Fen36转化到解淀粉芽孢杆菌所得，所述非编码RNA Fen36的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌为优选为解淀粉芽孢杆菌LPB-18N。
3.一种权利要求1所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将非编码RNA Fen36融合至表达载体pHT43，得到重组载体pHT43-fen36；
(2)将重组载体pHT43-fen36电转化至解淀粉芽孢杆菌，得到工程菌株解淀粉芽孢杆菌LPB-18Nfen36。
4.根据权利要求3所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，以fen36-F/R为引物扩增非编码RNAFen36序列，Pgrac的扩增模板来自表达载体pHT43，利用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切，酶切验证成功后，以PgracF/R为引物扩增完整的Pgrac片段；将扩增的Pgrac片段与非编码RNA Fen36通过重叠验证PCR连接，待验证成功后，采用无缝克隆进行融合片段得到Pgrac-Fen36与表达载体pHT43连接，经氯霉素和氨苄青霉素的双重筛选，获得重组载体pHT43-fen36。
5.根据权利要求4所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中fen36-F/R引物如下：
fen36-F：cgattacaaaaacatcagccgtaggatcctctagCAATGATAAAGGATT
fen36-R：gacgtcgactctagaggatcctacgCTTAAGATGAAAAAAACGGCTGAAA。
6.根据权利要求4所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中PgracF/R引物如下：
Pgrac-F：GATGACCTCGTTTCCACCGGAAttagcttggtaccagctattgtaac
Pgrac-R：AGAGTCTCTGCAATCCTTTATCATTGggatcctacggctgatgtttttgtaatcg。
7.一种权利要求1所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌在农作物促生增产和维持根系健康生长中的应用。
8.一种功能非编码Fen36对解淀粉芽孢杆菌的生物膜合成具有正向调控中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述非编码RNA Fen36的过表达能促进解淀粉芽孢杆菌生物膜形成中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌为LPB-18N。
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