CN107548280A

CN107548280A - 农业方法

Info

Publication number: CN107548280A
Application number: CN201580041534.1A
Authority: CN
Inventors: 戴维·德尼特; 英马卡拉达·戴尔·卡斯提罗·马德里格尔
Original assignee: Azotic Technologies Ltd
Current assignee: Azotic Technologies Ltd
Priority date: 2014-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2018-01-05
Also published as: CA2955833A1; MX2017001277A; GB201413335D0; AU2015295038A1; EA201790177A1; WO2016016630A1; JP2017523782A; BR112017001329A2; PH12017500056A1; EP3174395A1; US20180072633A1

Abstract

一种用于将植物生长介导实体或物质引入植物中，并且特别是将固氮细菌引入植物细胞中的方法，所述方法包括将所述植物生长介导实体或物质与土地芽孢杆菌菌株组合施用于植物。用于在该方法中使用的组合物和细菌形成了本发明的另一个方面。

Description

农业方法

本发明涉及一种用于增强植物生长的方法，并且涉及可用于该方法中的微生物和包括这些微生物的组合物。

已知固氮细菌重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus，Gd)能够定植植物细胞(细胞内定植)并因此增强那些植物的生长(EP-A-142299)。然而，不同Gd菌株实现这种有用功能的能力可以根据诸如作物性质、施用方式和所使用的特定Gd菌株等因素而变化。例如，已经发现富含糖的作物(诸如甘蔗或甜菜)可以更容易被Gd定植并且可以支持更高水平的定植。此外，在细胞内定植植物的能力可以根据不同的Gd菌株而变化。虽然已经证明出某些菌株具有在各种施用条件下有效定植细胞的能力，但是其它菌株(诸如在WO 2010/022517中描述的那些菌株)似乎在很大程度上在细胞间起作用。预期细胞内定植提供了一种更高效且更有效的方法来增强植物的氮供应，从而改善植物生长。

诸位申请人已经发现了另一种细菌菌株，其有利于细菌、特别是固氮细菌对植物细胞的定植。

使用最初从墨西哥获得的、已知用于定植植物细胞的Gd菌株来进行的开发工作发现，在对出发菌株进行扩大培养后，菌株的定植特性似乎有所改善。此时菌株的表征揭示了令人惊讶的发现，事实上，存在与Gd密切结合的分离的细菌。这种菌株被表征为土地芽孢杆菌属(Terribacillus)，它是一种形成革兰氏阳性细菌的孢子，并且与嗜糖土地芽孢杆菌(Terribacillus saccharophilus)和嗜盐土地芽孢杆菌(Terribacillus halophilus)紧密相关。

之前已经提出，这种菌株可以用于草莓果实中灰霉病的生物防治(埃斯海尔(Esshaier)等人，应用微生物学杂志(Journal of Applied Microbiology)(2009)106833-846)中，并且此外它可以增强植物发芽(WO 2014/193746)或具有促进植物生长的活性(WO 2104/201044)。

这两种生物体的共存是非常令人惊讶的，并且实际上被认为是前所未有的。尚不清楚土地芽孢杆菌属如何与Gd菌株以这种方式相结合。土地芽孢杆菌属是以前在日本或印度的土壤中发现的生物体(安善荣(Sun-Young An)等人，国际系统与进化微生物学杂志(Int.J.of Systematic and Evolutionary Microbiology)(2007)，57，51-55，卡戴安(Kadyan)S，等人，世界微生物学与生物技术杂志(World J Microbiol Biotechnol)，2013；29：1597-1610)，并且在一些植物中也作为植物内生细菌(巴威那(Preveena)等人，古代生命科学(Anc.Sci Life)(2013)32(3)：173-7，钱德纳(Chandna)P等人，BCM微生物学(BCMMicrobiology)，2014，14：33)。然而，土地芽孢杆菌属似乎可以以这样的方式与植物细胞相互作用，使得它们可以渗透到植物细胞中，从而促进有用的固氮细菌(诸如Gd)的植物定植活性。特别地，土地芽孢杆菌属似乎与固氮细菌(诸如Gd)在聚生体中起作用，以促进进入植物细胞及其定植。

根据本发明，提供了一种用于将植物生长介导实体或物质引入植物细胞中的方法，所述方法包括将所述植物生长介导实体或物质与土地芽孢杆菌属菌株组合施用于植物。

诸位申请人已经发现，由包括SEQ ID NO 1-4中任一个的菌株所例示的土地芽孢杆菌属，特别是嗜糖土地芽孢杆菌或嗜盐土地芽孢杆菌可以定植植物。然而，可以使用其它土地芽孢杆菌属菌株，包括Terribacillus goriensis或Terribacillus aidingensis。定植可以是细胞间定植或其可以进入植物(细胞内定植)。

因此，这些细菌可用于将植物生长介导实体或物质转运到植物中并且甚至转运到植物细胞中。

合适地，植物生长介导物质是影响植物健康或良好状态以及生长特征的任何本领域中所理解的物质。

它们可以包括农用化学化合物或小分子，诸如杀真菌剂、除草剂、杀昆虫剂或植物生长调节剂。然而，特别地，它们将包括生物物质。这些可以包括核酸，诸如DNA或RNA分子。例如，该核酸可以是RNA分子，例如RNAi，诸如抑制植物病毒的微小RNA(miRNA)或小干扰RNA(siRNA)。该植物病毒可以是任何已知的植物病毒，但具体实例包括：烟草花叶病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯病毒Y、花椰菜花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、李痘病毒、雀麦草花叶病毒和马铃薯病毒X、柑橘速衰病毒、大麦黄矮病毒、马铃薯卷叶病毒和番茄丛矮病毒。

可替代地，该生物物质是蛋白质或肽，诸如效应蛋白、植物激素、杀昆虫剂或植物生长调节物质。

该植物生长介导物质可以与土地芽孢杆菌属分别施用或混合施用。

然而，如果以这种方式使用土地芽孢杆菌属，通过适当地遗传修饰以使其表达并且特别是还使其分泌植物中所需的生物物质。遗传转化可以使用常规的重组DNA技术来实现，特别是通过用载体转化土地芽孢杆菌属菌株，该载体包括编码所述生物物质的核酸序列。可以培养转化的细胞以产生用于施用于植物的菌株。遗传转化的土地芽孢杆菌属及其制备方法是新颖的，并且形成了本发明的另一个方面。

然而，在一个具体实施例中，该生长介导实体或物质是不同的细菌，诸如活固氮细菌。虽然众所周知，固氮细菌在植物中具有有益效果并因此形成了本发明的一个具体实施例，诸位申请人已经发现，土地芽孢杆菌属可以与细菌相互作用以改进物质(诸如植物激素，如吲哚乙酸(IAA))的生产。

吲哚乙酸(IAA)是最具生理活性的植物生长素之一。IAA是若干种微生物(包括PGPR)的L-色氨酸代谢的常见产物。据报道，Gd以高浓度产生IAA。IAA促进植物中的根伸长，但在植物环境中过量的该激素可导致对植物生长的抑制。因此，通过Gd调节IAA的生产可以为植物发育提供益处。

因此，其中细菌生产激素(如IAA)，并且生产得以改进(诸如增加)，作为土地芽孢杆菌属存在的结果，可以将这些细菌与土地芽孢杆菌属一起施用于植物，以便提供改进的植物激素供应。

然而，根据本发明的一个具体实施例，提供了一种将固氮细菌引入植物细胞中的方法，所述方法包括将所述固氮细菌与土地芽孢杆菌属菌株组合施用于植物。

诸位申请人已经发现，由包含SEQ ID NO 1-4中任一个的菌株所例示的土地芽孢杆菌属，特别是嗜糖土地芽孢杆菌(Ts)或嗜盐土地芽孢杆菌可以增强固氮细菌(诸如Gd)对植物的作用。不受理论的束缚，这可能是因为土地芽孢杆菌属促进植物细胞的定植，该定植是通过固氮细菌(诸如Gd)来进行的，例如通过增加Gd中的果聚糖生产，或通过提供其自身的果聚糖(该果聚糖可以作为Gd的碳源)，或以其它方式例如通过提高固氮酶活性来改善氮固定。

诸位申请人已经发现证据表明，负责固氮酶活性和果聚糖蔗糖酶生产(nifH和lsdA)的Gd基因分别在土地芽孢杆菌属(诸如Ts和Gd)的混合培养物中上调。此外，土地芽孢杆菌属(诸如Ts)似乎很好地粘附到诸如种子表面等的表面上，并且增强在混合培养物中的附着。这种性质可以有助于形成能促进定植的生物膜。

因此，这些细菌可以用于通过例如改善固氮细菌的植物定植特性或通过其它方式来改善植物生长。

固氮细菌适宜与土地芽孢杆菌属分别施用或混合施用，但优选以共培养施用。

似乎土地芽孢杆菌属能够与其他细菌、特别是那些形成果聚糖包被的细菌密切结合，这可以为土地芽孢杆菌属提供支持环境。这种固氮细菌的一个具体实例是重氮营养葡糖醋杆菌(Gd)。然而，土地芽孢杆菌属也可以促进将其他固氮细菌(诸如固氮菌属、拜叶林克氏菌属、梭菌属、根瘤菌属、克雷白氏杆菌属以及含脂螺菌)引入植物细胞中。

在施用之前，土地芽孢杆菌属适当地与固氮细菌(诸如Gd)密切结合。特别地，这些细菌可以一起共培养。因此，例如，可将土地芽孢杆菌属细菌样品加入固氮细菌(诸如Gd)的培养物中，并培养所得混合物。在一些细菌、特别是Gd的情况下，一旦形成了合适的共培养，可能不需要引入另外的土地芽孢杆菌属，因为细菌在某些条件下变得难以分离。然而，在其他情况下，菌株可以是可分离的，例如通过在培养基中进行培养而分离，该培养基对于两种菌株来说更有利于其中一种菌株的生长，如下文所述。

合适的培养条件包括提供合适的细菌生长培养基，例如含琼脂的培养基，诸如海产琼脂(Marine Agar)。如果需要，培养基可以含有另外的细菌营养素，包括例如在EP-A-1422997中所描述的3％(w/v)蔗糖溶液。培养可以在一定温度范围内进行，例如在20℃-37℃下，并且通常在约25℃下。

在一个具体实施例中，通过其中单独培养各菌株并且所得菌株就在使用前以所需比例进行混合的方法来制备土地芽孢杆菌属(诸如Ts和Gd)的组合。这种方法的优点是可以选择培养基以确保正在生长的特定菌株的良好或最佳生长。因此，例如，Gd可以有利地在含马铃薯葡萄糖肉汤/琼脂(PDB/PDA，Fluka)或ATGUS的培养基中生长，如描述于科金(Cocking)等人2006体外细胞与发育生物学-植物(In Vitro Cellular andDevelopmental Biology-Plant)，第42卷，74-82；以及蔗糖基培养基诸如LGIP，如由卡瓦尔坎蒂(Calvalcante)&多贝赖纳(Dobereiner)，植物和土壤(Plant and Soil)，108，23-31所描述。

类似地，土地芽孢杆菌属(诸如Ts)可以适当地Luria-Bertani肉汤中生长(LB)(萨姆布鲁克(Sambrook)和拉塞尔(Russel)，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，纽约，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press)，(2001))或在海产琼脂(Difco)中生长。然而，诸位申请人已经发现存在某些培养基中，土地芽孢杆菌属，诸如Ts和Gd均可得到支持。

在一具体实施例中，通过在相同培养基中培养土地芽孢杆菌属和Gd来制备共培养。此类培养基具体包括：甘露醇或蔗糖基培养基，例如，如由例如山田(Yamada)等人，生物科学，生物技术和生物化学(Biosciences,Biotechnology and Biochemistry)，第61卷，1244-1251描述的MYP培养基(d-甘露醇、酵母提取物和蛋白胨)；或如由达席尔瓦-福罗弗(da Silva-Froufe)等人，巴西微生物学杂志(Brazilian Journal of Microbiology)，40(4)，866-878描述的蔗糖、酵母提取物和钾盐(单磷酸钾和二磷酸钾)的SYP培养基。如果需要，可以使用常规方法学来选择并测试其他培养基。培养基可适当地包含蔗糖(特别是支持Gd)和盐(NaCl)，以便增强土地芽孢杆菌属(诸如Ts)的生长。

以这种方式，可以有效且简单地制备共培养，而不需要随后混合。以这种方式制备这种共培养的方法形成了本发明的另一个方面。

土地芽孢杆菌属对固氮细菌的相对量将根据诸如细菌生长、所用固氮细菌的特定菌株等因素而变化。通常，固氮细菌仍然是存在的优势菌株。例如，组合中存在的土地芽孢杆菌属的量适当地为总细菌的0.1％-45％，例如1％-40％，包括1％-20％、例如约5％。当使用共培养时，菌株的比率可以取决于每种菌株在用于产生培养株的特定培养基中生长的良好程度。然而，当将培养株混合用于施用时，这些比率可以更加容易选择。通常，Gd以过量存在，并且已经发现约2:1的Gd:土地芽孢杆菌属的比率提供了最佳的固氮酶活性。

将土地芽孢杆菌属和固氮细菌的组合以适于允许它们进入植物细胞的方式施用于植物细胞。例如，将土地芽孢杆菌属和固氮细菌的组合施用于生长中的植物。例如，可以使用例如在EP-A-142299中描述的方法，将该组合在发芽时或其后不久(例如在发芽的1至7天内)施用于植物或其生长培养基上。

在另一个实施例中，使用已知的‘入沟(in furrow)’技术施用组合物，其中在种植操作期间将组合物施用于播种沟。

在另一个实施例中，在施用所述组合之前使植物经历创伤过程。关于施用固氮细菌，这种方法描述于诸位申请人共同未决的英国专利申请中。该伤口可以是意外或自然损伤的结果，因此固氮细菌可以促进修复生长。然而，在一个具体的实施例中，该伤口是由以下行为造成的损害的结果，这些行为如：割草(景观草)、切割(青贮和干草作物)、截根培植(香蕉、菠萝、甘蔗、高粱、水稻、木豆、棉花、麻蕉、苎麻)、剪枝(果树、藤本植物)、经过牲畜或经过收割的消耗。具体地，该伤口将发现于植物的‘地上’部分，如叶或茎。

该实施例可以进一步包括对植物造成‘损害’的预备步骤，该预备步骤具体地通过割草、切割、截根培植、剪枝或通过收割进行。在进行这类行为的相对短的时间内适当地施用该组合，例如在对植物造成损害的48小时内，例如在24小时内，如在10小时内，以及适当地在1-2小时内。

可替代地，将土地芽孢杆菌属和固氮细菌的组合施用于种子，例如作为种子包衣。

在这些情况下，土地芽孢杆菌属和固氮细菌各自可以以农业组合物的形式进行施用。这些组合物可以顺序或同时施用，或者它们可以混合在一起施用。

包括土地芽孢杆菌属菌株和例如农业上可接受的载体的农业组合物是新颖的，并且形成了本发明的另一个方面。土地芽孢杆菌属可以呈干燥形式，例如呈冻干形式，其可在加水时复原。此外，如果需要，可以将它们微胶囊化以增强稳定性。

然而，特别地，该组合物进一步包括植物生长介导实体或物质。当土地芽孢杆菌属是表达植物生长介导物质的重组菌株时，其可以包括农业组合物的唯一活性成分。

然而，特别地，该组合物进一步包括固氮细菌。

在一个具体实施例中，农业组合物包括土地芽孢杆菌属和固氮细菌，诸如重氮营养葡糖醋杆菌(Gd)。土地芽孢杆菌属菌株适当地是嗜糖土地芽孢杆菌或嗜盐土地芽孢杆菌，但是也可以是Terribacillus goriensis或Terribacillus aidingensis，并且特别是包括SEQ ID NO 1-4中任一个的嗜糖土地芽孢杆菌菌株。

土地芽孢杆菌属和固氮细菌的组合可以呈共培养形式，其可以呈干燥形式，例如呈冻干形式，其可以在加入水时复原，如上所述。如上所述，可以将该组合或共培养微胶囊化以增强稳定性。

本发明的组合物适当地包括溶剂诸如水，尽管如果需要可使用有机溶剂，例如植物油或烃类(如石蜡或煤油)。适当地，任何有机溶剂是植物油，诸如大豆油、葵花子油、菜籽油(油菜籽油)、棉籽油、蓖麻油、亚麻子油或棕榈油或它们的混合物。

该组合物可进一步包括如本领域已知的添加剂或赋形剂(例如增稠剂、分散剂、稀释剂、湿润剂、固体载体等)。

在一个具体实施例中，该组合物进一步包括多糖。合适的多糖包括源自植物、动物或微生物来源的水胶体多糖。具体地，这些包括渗出物胶质多糖(例如阿拉伯胶、阔叶榆绿木胶、刺梧桐胶和黄蓍胶)、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或微晶纤维素)、淀粉及衍生物(包括例如玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、大米淀粉、小麦淀粉及其改性形式(例如预胶化淀粉、氧化淀粉、乙基化淀粉、淀粉糊精或麦芽糖糊精))、果胶、来源于海藻的多糖(例如琼脂、藻酸盐、角叉菜胶和红藻胶)、种子胶(例如瓜尔胶和刺槐豆胶)、衍生自微生物发酵的多糖(例如黄原胶和吉兰糖胶)、和含氮多糖(如壳聚糖)；或这些的混合物。

在一个具体实施例中，该多糖是渗出物胶质多糖，例如阿拉伯胶、阔叶榆绿木胶、刺梧桐胶或黄蓍胶。该多糖的具体实例是阿拉伯胶。

存在的多糖量将根据预期的施用模式而变化。然而，通常使用包括从0.1％w/w至1％w/w，例如从0.1％w/w至0.5％w/w，例如约0.3％w/w多糖的组合物。例如，使用0.1％(w/v)至1％(w/v)，例如0.1％(w/v)至0.5％(w/v)，诸如约0.3％(w/v)的多糖。

该组合物可以进一步包括表面活性剂或洗涤剂。合适的表面活性剂或洗涤剂包括非离子型洗涤剂，例如以商品名‘Tween’出售的那些，例如Tween80。Tween 80是非离子型洗涤剂；70％由脂肪酸油酸组成，并且其余为亚油酸、棕榈酸和硬脂酸的组合。1％溶液的pH在5.5-7.2的范围内。它广泛用于乳化和分散医药和食物产品中的物质。它作为抗细菌剂具有很小活性或没有活性(道森(Dawson)等人(1986)生化研究数据(Data for BiochemicalResearch)，第3版，牛津大学出版社(纽约，NY：1986)，第289页)。

组合物中存在的表面活性剂的量将根据诸如特定表面活性剂、所进行的处理类型和施用方法等因素而变化。然而，典型地，组合物将包括从0.0005％(v/v)至0.2％(v/v)，例如从0.0005％(v/v)至0.15％(v/v)，例如约0.001％(v/v)。

适当地，在组合物中还提供针对存在的土地芽孢杆菌属和固氮细菌的营养素，并且典型的营养素是3％(w/v)蔗糖溶液，如EP-A-1422997中所述。

以前没有阐明土地芽孢杆菌属的应用。因此，本发明的另一个方面提供了土地芽孢杆菌属菌株在农业中的用途，特别是将植物生长介导实体或物质、特别是固氮细菌转移到植物(并且特别是植物细胞)中。同样，土地芽孢杆菌属菌株适当地是嗜糖土地芽孢杆菌或嗜盐土地芽孢杆菌，以及Terribacillus goriensis或Terribacillus aidingensis，并且特别地包括SEQ ID NO 1-4中任一个。

例如，包括SEQ ID NO 1-4中任一个的嗜糖土地芽孢杆菌菌株适当地以分离或纯化的形式用于本发明。

可替代地，本发明提供了重组土地芽孢杆菌属菌株，其已经被转化以表达如上所述的植物生长介导物质。

在另一个方面中，本发明提供了通过将土地芽孢杆菌属菌株和固氮细菌菌株混合在一起而获得的组合，用于在农业中使用。该固氮细菌适当地是形成果聚糖包被的细菌，诸如Gd。可能的是，土地芽孢杆菌属(其适当地是如上所述的菌株)可以与包被结合，例如它位于所述包被之中或之上。

如上所述，土地芽孢杆菌属可以促进固氮细菌进入细胞，并且因此可以与细菌一起转运到细胞中。在又另一个方面，提供了由土地芽孢杆菌属、特别是细胞内土地芽孢杆菌属定植的植物或种子，土地芽孢杆菌属可以与如上所述的固氮细菌组合。

一旦植物以这种方式被定植，植物或其他子代的种子也将包含细胞内土地芽孢杆菌属，并且其中也使用固氮细菌诸如Gd，并且这些形成本发明的另一个方面。

现在将参照所附示意图通过实例的方式具体描述本发明，其中：

图1显示了使用QIAamp DNA Stool试剂盒从固氮细菌Gd中提取DNA样品的PCR指纹图，其中使用BOX引物进行PCR，如在图1(A)中：

泳道从左到右表示：1＝100bp的梯；2、3＝LN rep 1；4、5＝LN rep 2；6、7＝LN rep3；8、9＝LN rep 4；10、11＝LN rep 5；12、13＝FD rep A1；14、15＝FD rep A2；16、17＝FDrep A3；18＝对照；19＝100bp的梯；并且在图1(B)中，泳道从左到右表示1＝100bp的梯；2、3＝FD rep A4；4、5＝FD rep A5；6、7＝LN rep 1；8、9＝LN rep 2；10、11＝LN rep 3；12、13＝LN rep 4；14、15＝LN rep 5；16、17＝未保藏；18＝对照；19＝100bp的梯；其中LN＝液氮，FD＝冻干。

图2显示了使用Qiagen DNeasy Tissue试剂盒从细菌中提取的DNA的“克隆”单菌落样品的PCR指纹图，并且使用BOX引物对其扩增，其中在所有组中，从左至右各列依次表示：100bp的梯；菌落1一式三份反应；菌落2一式三份反应；菌落3一式三份反应；菌落4一式三份反应；无DNA对照；100bp的梯。

图3显示了在本工作中发现的生物体和土地芽孢杆菌属的多重序列比对，其中DD2BR、DD1BR、DD3BR和DD4BR是本工作中分离的序列并且分别代表SEQ ID NO 1-4，并且其中AB243849是相应的嗜盐土地芽孢杆菌序列(SEQ ID NO 9)，并且AB243845是相应的嗜糖土地芽孢杆菌序列(SEQ ID NO 10)。

图4显示了在52小时中，PDB中的Gd(Δ，低氧合作用；○，高氧合作用)和Ts(●)的生长曲线的比较。具有高氧合作用的Gd培养物的细胞数为log₁₀(cfu/ml)(□)。OD作为两次重复样品的平均值。每次的细胞数表示为三次稀释的平均值，一式两份涂板。误差条作为每个板的标准偏差。

图5显示了LB中Ts的生长曲线。Ts培养物的细胞数为log₁₀(cfu/ml)(Δ)。OD是两次重复样品的平均值(○)。每次的细胞数表示为三次稀释的平均值，一式两份涂板。误差条作为每个板的标准偏差。

图6是显示Gd、Ts和Gd+Ts的混合培养物在不同培养基中生长的比较图，所述培养基含有和不含赫布斯特氏(Herbst’s)人工海水(H’s)。

图7显示了在MYP和SYP中经过120小时的感受态测定的结果。培养物的发育表示为600nm处的OD(a和b)和细胞作为菌落形成单位/ml(cfu/ml)的生存力(c和d)。

图8显示了Gd单一培养物和Gd+Ts混合培养物的乙烯生产之间的相关性，其中两种菌株Gd:Ts以与它们在600nm处的OD相比不同的比例，如下：(●)：Gd:Ts为2:1；(◇)：Gd:Ts为1:1；(Δ)：Gd:Ts为1:2。两者的趋势线都作为回归方程用图例所示的模式标记。

图9显示了在接种后(dpi)15天，两种不同培养基MYP和SYP中单一培养物(G)和混合培养物(GT)的果聚糖生产。两次重复的平均值。误差条代表平均值的标准偏差。标记每个样品之间随时间的显著差异组(a、b和α、β)并且标记每个采样时间在不同样本之间的显著差异组(A、B、C、D)。

图10显示了混合培养物(Gd+Ts)相对于单一培养物(Gd)在两种不同培养基(SP和MP)中的nifH和lsdA相对表达。使用RT-qPCR定量基因表达。23S被用作数据规范化的参考基因。对于每个条件，进行三次重复来测量C_T。

图11是显示确定不同比例的两种菌株的Gd、Ts和混合培养物附着人造表面的能力的实验结果的图。数据是5个独立样本的平均值±平均值的标准误差(se)。根据LSD试验，共同字母的值没有显著不同(F≤0.05)。

图12是显示在接种后从种子表面回收的细胞数的图，记为cfu的log₁₀/种子。数据是三次重复的平均值±平均值的se。根据LSD试验，共同字母的值没有显著不同(F≤0.05)。

图13是显示植物在植物生长室中接种后2周和进行孵育后，通过Gd定植OSR植物的图。在该图中，‘OREP’表示油菜籽根附生结果，‘OREN’表示油菜植物根内生结果，‘OLEN’表示油菜叶内生结果。数据是在每个样品的四个板中计数的cfu的平均值(记为cfu/ml的log₁₀)±平均值的se。根据LSD试验，共同字母的值没有显著不同(F<0.05)。

图14是显示植物在植物生长室(Fitotron)中接种和孵育后2周，通过Ts定植OSR植物的图。数据是在每个样品的四个板中计数的cfu的平均值(记为cfu/ml的log₁₀)±平均值的se。根据LSD试验，共同字母的值没有显著不同(F<0.05)。

图15是显示在各种处理后测量植物重量的实验结果的图：(a)显示所测量的湿重，(b)显示所测量的干重，并且(c)显示水的导出重量。数据是七株植物/样品的平均值±平均值的se。根据LSD试验，共同字母的值没有显著不同(a和c，F<0.05；b，F＝0.1)。

图16是显示3天后在SYP中的Gd、Ts和混合培养物的果聚糖量化的图。数据是三次重复的平均值±平均值的se。根据LSD试验，共同字母的值没有显著不同(F<0.001)。

图17是显示土地芽孢杆菌属在Gd中对植物激素IAA生产的影响的图。这些值显示了三次重复的平均值，并且误差条显示了标准误差(se)。根据LSD试验，相同字母的样本没有显著差异(F<0.001)

实例1

组合的鉴别

进行了表征Gd菌株的工作。使用的菌株包括已经从IMI 501986(现称IMI 504998)经过长时间培养的‘测试菌株’，其中IMI 501986可由氮科技有限公司(AzoticTechnologies Ltd)和英国CABI(CABI UK)购得，并且已知其具有良好的植物细胞定植特性。

菌株最初在ATGUS培养基([0.8％(w/v)琼脂，酵母提取物(2.7g L^-1)，葡萄糖(2.7gL^-1)，甘露醇(1.8g L^-1)，MES缓冲液(4.4g L^-1)，K₂HP0₄(0.65g L^-1)，pH 6.5]中生长，并在25℃下进行孵育。然而，据发现，使用ARGUS肉汤改善了菌株的质量和可再生性。

对保存前和保存后的样品(包括冷冻保存和冷冻干燥的菌株样品)进行PCR指纹图分析。根据制造商的说明书使用Qiagen DNeasy Plant、DNeasy tissue或QIAamp DNAStool试剂盒进行DNA提取。通过分光光度计(GeneQuant，美国通用医疗(GE Healthcare，英国))来评估每个样品的DNA浓度。然后将每个样品的浓度标准化为10ng/μl。

使用细菌重复单元BOX&ISSR‘TGT’引物进行PCR指纹技术，并使用凝胶电泳分离DNA片段。所有PCR反应一式两份并重复进行。

从所有保藏的和‘野生型’样品中成功提取DNA。然而，用于‘测试菌株’的Box和TgT引物的PCR结果是不一致的。据预期，带型在单独的重复中应该是100％相似的，但是尽管一些带对于所有样品都是共有的，但一些带在出现额外带时显著不同。不同的处理之间的‘相似’带强度也不同。使用Box引物获得的结果通常更好，并含有多达8个不同的带。使用QIAamp DNA Stool提取试剂盒提取的DNA重复该工作。这使得指纹具有更好的质量和更好的一致性。然而，尽管在所有样品中存在共同的带，但是在相同样品的一些重复之间存在明显的带分布差异(图1)。在重复中，图谱应该是相同的，尤其是在同一重复的一式两份反应中。从与该相同样品的重复所相关的BOX方面的带型比较可以清楚看到情况并非如此。

此时进行的菌株的16S rDNA部分序列分析表明生物体主要是Gd。由于图谱的出乎意料的不可再生性，以改进的方式、并使用衍生自Gd单线的四个单菌落来重复所述方法，以确保样品是相同的。使用Qiagen DNeasy tissue试剂盒革兰氏阳性菌方案，使菌落在ATGUS肉汤中生长，并从四个菌落中的每一个来提取DNA，以便消除由于任何潜在的Gd果聚糖的抑制或保护作用而造成的问题。将样品进行BOX PCR(使用一式三份的反应，时间超过四天)，观察到可再生的和均匀的图谱(图2)。

令人惊奇的是，来自单菌落样品的随后16S rDNA部分序列分析和土地芽孢杆菌属具有>99％的匹配，最密切匹配嗜糖土地芽孢杆菌(参见图3)。

实例2

菌株分离

尝试在不同pH和NaCl浓度下选择性培养测试菌株以试图分离两种生物体。然而，在NaCl培养基上没有生长，但是在pH 5.5的琼脂上观察到生长，在pH 9.5的培养基上观察到两种形态类型。来自文献的信息表明Gd不会在较高的pH下生长，因此认为已经分离了次要生物。然而，16S rDNA部分序列分析显示这两个分离物是Gd。随后的革兰氏染色不是决定性的，但揭示了革兰氏阴性杆菌(即Gd)与可能的痕量的革兰氏阳性杆菌的优势。

更酸性的pH条件应当有利于Gd的生长，而土地芽孢杆菌属应该更容易地耐受更高的pH(即更碱性)条件。在这项工作中不可能将土地芽孢杆菌属与Gd分离，如测序工作所指示。Gd保持为优势菌株这一事实表明，土地芽孢杆菌属以非常低的数量存在于整个细胞群中。然而，在该实验中，Gd似乎比先前描述的更耐受碱性条件。这可能是由于土地芽孢杆菌属的存在，土地芽孢杆菌属以相互作用的方式实现这一点。以相似的方式，土地芽孢杆菌属被认为是负责增强该Gd特定菌株的植物细胞定植活性。

此外，在某些情况下分离菌株时遇到的困难表明，这两种菌株之间形成了非常紧密的结合。不受理论的束缚，似乎可能的是，或者甚至可能的是，土地芽孢杆菌属的‘嗜好糖’属性意味着它可以附着到或掺入Gd的果聚糖。可替代地，Gd可以通过使用土地芽孢杆菌属的果聚糖作为碳源。

实例3

土地芽孢杆菌属菌株和Gd菌株的共培养

在这些实验中使用的菌株是重氮营养葡糖醋杆菌，(IMI504958-CABI(英国))和嗜糖土地芽孢杆菌菌株(AZ0008)(由CBS生物多样性中心(CBS Biodiversity Centre)提供)、Terribacillus goriensis(AZ0007)、嗜盐土地芽孢杆菌(AZ0009)和Terribacillusaidingensis(AZ0010)。使用一系列培养基来单独或组合生长菌株。

测试一系列培养基，特别是已知支持Gd生长的培养基，以观察它们是否也可以支持Ts生长。

这些包括：

1.马铃薯葡萄糖肉汤/琼脂(PDB/PDA，Fluka)。

2.ATGUS(2.7g L^-1葡萄糖，0.65g L^-1KH₂PO₄，4.8g L^-1K₂HPO₄，1.8g L^-1甘露醇，4.4gL^-1 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES水合物)，2.7g L^-1酵母提取物)(科金(Cocking)等人，2006)。

3.海产琼脂(Difco)

在每种情况下，用新鲜板上的菌落、在100ml肉汤(用于Gd的PDB，用于Ts的LB)中制备发酵剂，并在28℃下以150rpm振荡孵育。将10μl标准化培养物(其OD₆₀₀为0.1)接种到有5ml无菌培养基的离心管中，一式两份，并在相同条件下孵育。每个样品使用单个管，并且在每次使用后丢弃。在接种后0、4、8、16、20、24、28、32、40、44、48和52小时取样，测量OD₆₀₀，并涂板在PDA或海产琼脂上进行连续稀释以计数可生存细胞数(cfu/ml)。

4天后的结果显示在下表中，其中不同的生长水平显示为：+++非常高的生长、++(高生长)、+(生长)、(+)(不明确的生长)、-(无生长)。

显然，ATGUS不支持土地芽孢杆菌属生长，而海产琼脂支持土地芽孢杆菌属生长但是不支持Gd生长。土地芽孢杆菌属在PDA中的生长不明确或不可靠。

然后在上述条件下在52小时的孵育中构建在PDB中的生长曲线，并且这显示在图4中。Gd的生长受培养物的氧合作用影响，在较低氧合作用水平下生长较慢。

然而，Ts在孵育几天后不能在PDB中生长。然而，其在Luria-Bertani肉汤上成功生长(LB)(萨姆布鲁克，J.&拉塞尔，D，2001，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，纽约，冷泉港实验室出版社)，如图5所示。

测试LB上的Gd生长。此外，检查两种菌株在营养琼脂(NA)中的生长。一周后，Gd不在NA中生长，也不在海产琼脂中生长，Gd在LB中生长不良。

尝试改良培养基以观察它们是否将支持另外的菌株生长。特别地，将被报道为Gd生长所必需的蔗糖加入LB中。类似地，通过加入氯化钠来改良PDB以试图确保其支持Ts生长。然而，结果是不成功的，因为即使在高浓度盐的情况下，Ts显示出在PDB中没有生长的能力，而在48小时的孵育后、在蔗糖改良的LB中显示出生长能力。Gd受PDB中的盐浓度的影响，并且其能够在1％(w/v)NaCl下生长，但是在较高盐度下不生长。它不能在具有蔗糖补充的LB中生长，表明在这些培养基中缺乏相容性。

测试不同的培养基以观察Gd和Ts是否将一起生长。这些培养基是：

MYP(25g L^-1d-甘露醇、3g L^-1酵母提取物、3g L^-1蛋白胨；pH 6.2)(山田，Y等人，1997，生物科学、生物技术和生物化学，第61卷，第1244-1251页)；和

SYP(10g L^-1蔗糖、3g L^-1酵母提取物、1g l^-1K₂HPO₄、3g L^-1KH₂PO₄；pH 5.8)(席尔瓦-福罗弗，L等人，(2009)，巴西微生物学杂志，40(4)，第866-878页)。

使用这两种培养基：蔗糖(SYP)和甘露醇(MYP)来测试不同的碳源。为了改善Ts的生长，所有悬浮培养基补充有0.5X的赫布斯特氏人工海水，如安(An)，S等人(国际系统与进化微生物学杂志(2007)，第57卷，第51-55页)所推荐的。在使用和不使用赫布斯特氏溶液的情况下，对菌株Ts和Gd培养基进行测试。对于PDB也是如此。

测量培养物生长中λ＝600nm处的OD。并且通过接种到ATGUS和/或海产琼脂上、检测Gd和Ts来检查可生存细胞。在使用Gd的培养物的情况下，将培养物也涂板在LGIP上以测试这些培养物的固氮能力。

图6中的图显示两种菌株在SYP和MYP中生长良好。Ts不能在PDB中生长，除非加入盐溶液之后和长时间孵育后才能生长，但在这种情况下Gd不生长。Gd在用人工海水改良的任何培养基中均未显示生长。混合培养物比没有盐溶液的单一培养物呈现更高的生长，这可能是由于培养基中两种菌株的生长，如从细胞生存力测试中清楚的显示，其中将细胞涂板在最佳生长培养基(用于Gd的ATGUS和用于Ts的海产琼脂)并孵育4天。结果呈现于下表1中：

表1：在改良培养基中培养24小时和48小时的细胞生存力。在混合培养物中，细胞的生存力表示为Gd/Ts。不同的生长水平如下所示：+++非常高的生长、++(高生长)、+(生长)、(+)(不明确的生长)、-(无生长)。

结果显示培养基SYP和MYP都适合作为用于Gd和Ts的混合培养物的生长培养基。当在单一培养时，当这些培养基补充有赫布斯特氏人工海水时Ts生长得到改善。然而，在两种培养基中，随着时间的推移，与Gd生长相比，Ts的生长减慢。这种趋势可以在感受态测定后更详细地观察到。

在这些测定中，将Gd和Ts的分开培养物在适当的培养基中、在28℃下、以150rpm搅拌孵育24-48小时。培养物用0.9％(w/v)的NaCl溶液洗涤两次以除去使用的培养基，检查OD₆₀₀并调节至0.2(约10⁸cfu/ml)。向最终体积为5ml的所选择的培养基(MYP和SYP)中接种1ml的每种培养物(Gd和Ts)，每个样品一个管。在接种后0、6、24、36、48、54和120小时取样，测量OD₆₀₀，并一式两份涂板在ATGUS、LGIP和海产琼脂上作为选择培养基进行连续稀释。接种Gd和Ts的单一培养物，并使用与对照相同的条件孵育。

结果示出于图7中。两种菌株都能够在这些培养基中生长，但是在SYP中作为单一培养物的Ts以比在MYP中更高的浓度生长。在混合培养物中，菌株在SYP和MYP中的行为相似。这表明Gd的存在为MYP中的Ts生长提供了一些益处。就细胞生存力而言，Gd生长似乎不受Ts存在的影响。

因此，这些培养基适合于生产可生存的Gd和Ts的共培养。

实例4

体外固氮

乙炔(C₂H₂)还原为乙烯(C₂H₄)是测量天然样品中的固氮酶活性的间接方法(科荷(Cojho)等人，卷1993.106第341-346页)。

在MYP和SYP中制备Gd和Ts培养物，并在28℃下以150rpm振荡孵育。孵育2天后，将培养物离心(4,000rpm，15分钟)，并用0.9％(w/v)的NaCl溶液洗涤。将所得颗粒再悬浮于改良培养基中，其中一种培养基不含氮；特别是上述的MYP和SYP培养基，但不添加酵母提取物(以下分别称为MP和SP)。将Gd培养物的OD₆₀₀调节至1，并将Ts的OD₆₀₀调节至0.5。通过接种1ml用于单一培养物的Gd和用于混合样品的1ml Gd+1ml Ts，在最终体积为5ml的肉汤中按以下比例接种(培养物的OD₆₀₀作为参考)：Gd:Ts为1:1、2:1和1:2。密封管并用乙炔替换10％的空气体积。在28℃作为静态培养物孵育1、2、4和8天后，通过气相色谱(GC)分析样品中的乙烯生产。并且测试样品中的OD₆₀₀和细胞数。每个样品一式三份制备。

通过气相色谱(GC)测量在SP和MP培养基中生长的单一Gd培养物和混合Gd+Ts培养物的乙烯生产。在所有实验中，在MP中生长的样品中没有检测到乙炔还原；即使在单一培养物中，在孵育4天之前，在SP中生长的样品中也没有检测到乙炔还原。孵育4和8天后，检测培养基SP中单一和混合培养物中的样品的乙烯产量。

通过GC测量的乙烯生产的峰值显示高的变化，但是在值之间存在恒定的相关性，如图8所示。当Gd:Ts为2:1时，混合样品的乙烯生产几乎是单一培养物的两倍。当菌株比例变化时，两种类型样品之间的相关性改变，当Ts比Gd浓度高时(1:2)，混合培养物的比例比单一培养物低25％。当Gd和Ts以相同的比例混合时，Gd单一培养物的乙烯生产没有变化。这些结果表明，Ts的存在能够改变酶固氮酶的活性，并且该效应与Gd和Ts的相对比例有关。

实例5

Ts对Gd中果聚糖生产的影响

用1ml Gd+1ml Ts的两种菌株的过夜培养物(OD₆₀₀约0.2)接种于有100ml的MYP和SYP的烧瓶，并孵育14天。每两天收集样品，将1ml的每种培养物在-20℃下一式两份保存，然后分析果聚糖生产。测量OD₆₀₀，并将连续稀释物涂板到ATGUS和海产琼脂上，以在取样时间估计两种菌株的细胞数。接种MYP和SYP中Gd的单一培养物，并使用与对照相同的条件孵育。为了提取和定量样品中的果聚糖，用3体积的甲醇沉淀样品，并置于设定为60℃的加热块中直至干燥，并将体积减少至约1ml。将沉淀物溶于1ml的H₂O中。通过加入0.01M的H₂SO₄并在121℃下孵育1小时进行酸水解。孵育后，加入500μl的DNSA试剂(100ml水溶液含有1g 3,5-二硝基水杨酸、0.4M的NaOH和30g的K-Na酒石酸四水合物)并混合。将试管置于沸水中15分钟，加入500μl的40％(w/v)的K-Na酒石酸并混合。在540nm处测量样品的吸光度，并使用来自一系列葡萄糖标准品的校准线来估计葡萄糖浓度。

结果示出于图9中。第一天，SYP培养物中的果聚糖生产高于MYP培养物中的果聚糖生产。在MYP中生长的样品的果聚糖生产，没有随时间显示显著差异，而在SYP中生长的样品中存在统计学显著差异。如果将这些值与采样时间相比较，在接种后3天和孵育8天后的四个样品之间存在显著差异。

实例6

固氮酶和果聚糖蔗糖基因的表达

由于在孵育8天后、在SP中孵育的单一Gd培养物和混合培养物Gd+Ts的样品中检测到了固氮酶活性的差异，从这些样品中提取RNA，并通过qPCR评估基因表达。使用实时PCR或qPCR，诸位申请人研究了在不同培养条件下酶固氮酶和果聚糖蔗糖基因表达是否有任何差异。

如前面实例4中所述制备样品。在将OD₆₀₀调整为1ml、5ml用于单一培养物的Gd和用于混合培养物的5ml Gd+5ml TS后，接种最终体积为50ml的MP和SP，并在28℃作为静态培养物孵育。孵育8天后，保存1ml样品，提取RNA用于qPCR。根据制造商的方案用分离RNA。通过测量在260nm/280nm和260nm/230nm处的吸光度的比率来确认适合于下游RT-qPCR应用的RNA纯度和完整性。根据制造商的说明书，使用DNA酶I试剂盒(西格玛(Sigma))进行样品的DNA酶消化，以确保样品中不存在DNA。根据制造商的手册，使用Superscript^TM IIIReverse Transcriptase(英杰公司(Invitrogen))进行第一链cDNA合成。用1μg的RNA进行逆转录反应。将cDNA以1:5稀释，然后用于RT-qPCR中。

qPCR.在CFX96^TM实时系统(伯乐公司(BioRad))上使用iTap^TM Universal SYBRGreen Supermix(伯乐公司)进行RT-qPCR。引物以每个反应3.75μM、10ng的cDNA来使用。热循环如下进行：95℃进行2分钟，进行40个循环(在95℃下5秒，并且在60℃下15秒)。进行熔化曲线以检查引物的可靠性，如下：每5秒增加0.5℃，从60℃增加至95℃。使用三个技术重复和非模板对照进行所有RT-qPCR测定。将23S的引物用于扩增参考基因(加利斯(Galisa)等人，微生物学方法杂志(J.Microbiol Methods)(2012)10月；91(1)：1-7)，并且将nifH(正向：5’-TCGACGACCTCCCAGAATAC-3’(SEQ ID NO 5)；反向：5’-CCTTGTAGCCGATCTTCAGC-3’)(SEQ ID NO 6)和lsdA(正向：5’-ACGCCGATCAGTTCAAGCTAT-3’(SEQ ID NO 7)；反向：5’-CCTGGTTCGTGTAGGTCTGG-3’)(SEQ ID NO 8)基因的引物分别靶向酶固氮酶和果聚糖蔗糖的基因。测试所有引物的扩增效率，并且相对于斜率计算效率值，该斜率根据从模板的连续稀释产生的标准曲线来获得。扩增效率计算为在每个循环中扩增的模板的百分比(％效率＝(E-1)*100；E＝10^-1/斜率)。90％-105％范围内的％E表示高扩增效率。

该实验的结果示于图10中。与单一Gd培养物、特别是在SP中生长的样品相比，似乎在混合培养物中存在nifH和lsdA的基因表达有增加的趋势。

通过qPCR对固氮酶和果聚糖蔗糖基因表达的研究显示：两种酶有增加表达的趋势。这些qPCR实验显示了在固氮酶表达中存在的Ts的作用，其似乎作为条件的响应而增加，该条件由(特别是在SP中的，但是在某种程度上也在MP中的)Gd+Ts混合培养产生。

果聚糖蔗糖基因类似地显示：在这种次要微生物存在下，果聚糖蔗糖基因表达有增加倾向，这可能与固氮有关。因为似乎固氮和果聚糖生产之间存在相关性，这种相关性可能是由于果聚糖对固氮酶产生的受保护的环境避免了氧扩散，这可能抑制酶活性。已经证明由Gd产生的粘液基质被细菌用于保持厌氧环境(董(Dong)等人，应用环境微生物学(Applied Environmental Microbiology)，2002，第1754-1759页)。因为果聚糖是由Gd分泌的主要的胞外多糖，所以除了对其它非生物胁迫(诸如NaCl、蔗糖和干燥)的耐受性之外，其可能与对氧的固氮酶保护有关(委拉斯开兹-赫尔南德斯(Velázquez-Hernández)等人，微生物学档案(Archives of Microbiology)，2011，第193卷，139-149)。

实例7

Ts对Gd粘附的影响

通过测量培养物附着于人工表面(离心管)的能力，来评估混合培养物Gd+Ts与Gd单一培养物的附着能力，如法夫雷-邦特(Favre-Bonté)等人，生物医学中心微生物学(Biomed.Central Microbiology)(2007)7(33)第1-12页中所述。在SYP中(达席尔瓦-福罗弗等人，2009，同上)和在赫布斯特氏人工海水改良SYP中(安(An)等人，2007，同上)分别制备Gd和Ts发酵剂。在28℃下以150rpm生长48小时后，将培养物用PBS(4000rpm，15分钟)洗涤两次，并将沉淀用PBS以OD₆₀₀为1和0.5重悬浮。通过接种1ml用于单一培养物的Gd或Ts和用于混合样品的1ml Gd+1ml Ts，在最终体积为10ml的SYP中按以下比例接种(培养物的OD₆₀₀作为参考)：Gd:Ts为1:1、2:1和1:2。通过将1.5ml的样品分配在15ml离心管中来制备五次重复/处理，并在28℃下静置孵育8天。

为了检查细胞对表面的粘附，除去培养基，用1.5ml的PBS洗涤管3次，并用10ml的甲醇固定细胞15分钟。除去醇并对管进行空气干燥。形成的生物膜用0.1％w/v的结晶紫染色5分钟。染料用蒸馏水漂洗并进行空气干燥。然后，将染料用10ml的33％的冰醋酸重悬浮。在595nm处测量样品的吸光度。作为对照，对具有1.5ml的SYP的5个管进行孵育并以相同方式处理。将来自空白的值作为背景，并将其从对于其余样品获得的值中减去。

结果示出于图11中。该实验显示：细胞培养物具有附着到人造表面的趋势，这可以指示Gd具有在不同条件下形成生物膜的能力。预期生物膜的形成将影响植物定植特性。这种能力似乎可以通过将Ts作为混合培养物、特别是以1:1的比例的组合来增强。

实例8

附着和种子发芽

通过将油菜籽(OSR)种子浸泡在100％乙醇中，涡旋并使其静置2分钟，然后将其彻底洗涤并用无菌去离子水(SDW)涡旋振荡三次，对其进行灭菌。然后，将种子浸泡在含有1％(v/v)Tween 80的70％的(v/v)漂白剂中，涡旋并静置30分钟。之后，将其再次彻底洗涤并用SDW涡旋至少5次。

为了制备接种物，将Gd和Ts的新鲜培养物在最佳培养基中孵育24小时。对于Gd(约10⁸cfu/ml)，将OD调节至0.35，对于Ts(分别为约10⁸cfu/ml和约10⁶cfu/ml)，将OD调节至0.2和0.1。将培养物在包含3％(v/v)蔗糖、0.1％(v/v)Tween 80和0.3％(v/v)阿拉伯胶的水性组合物中稀释。处理如下：a)对照，只是水；b)Gd：约2.5·10⁵cfu/ml；c)Ts：约2.5·10⁵cfu/ml；d)Gd+Ts：1:1；两种菌株都是：约2.5·10⁵cfu/ml；e)Gd+Ts：2:1，其中Gd为约2.5·10⁵cfu/ml并且Ts为约2.5·10³cfu/ml。实际接种物浓度如下：

将灭菌种子浸泡在不同的处理中30分钟。

处理种子后，弃去溶液，将种子置于用3ml的SDW润湿的玻璃纤维纸的倒置培养皿中。通过用铝箔覆盖并通过在21℃下孵育来避免板受到光照。为了测试细菌对种子的附着，三组20粒种子/处理，在5ml的PBS中洗涤并在20℃下剧烈振摇2小时。将所获得的溶液连续稀释并涂板在LGIP和海产琼脂培养基上。然后将这些板在28℃下孵育4天。计数从种子表面回收的细胞数，结果示于图12中。

孵育24小时后，计数发芽的种子以计算发芽率，并置于具有MS基础培养基(Murashige和Skoog(MS))(西格玛(Sigma)M0404)的5ml锥形管中。将植物在植物生长室中孵育(循环：在15℃和60％RH下进行12小时黑暗处理/在28℃和60％RH下进行12小时光处理)，至少直到两片真叶生长。每个处理孵育15株植物。

结果显示，不同处理下，Gd和Ts对种子的附着显示出差异。尽管在植物提取物中检测到该菌株，但不可能从种子重新分离Ts，这表明这种菌株很好地粘附于种子表面。混合培养物显示低恢复，因此与单一Gd培养物相比，其粘附也增强。

在种子的接种和发芽之后，将发芽的幼苗在植物生长室中另外孵育15天。对来自每个处理的七个幼苗进行处理，以在表面灭菌之后从根和叶中获得提取物。

为了从根表面再分离附生微生物，该程序类似于用于测定种子附着的程序。特别地，也在等渗缓冲液中洗涤根以重新分离在根表面上定植的附生微生物。

对于内生定植，通过在10％(v/v)漂白剂中浸渍10分钟来将根和叶表面灭菌，将pH调节至8.0，用SDW漂洗植物并在1ml的PBS中浸软(奥卡拉汉(O'Callagham)等人，应用和环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)，2000，66(5)2185-2191)。连续稀释植物提取物，并一式两份涂板在LGIP和海产琼脂上。结果分别示于图13和14中。

未接种的植物没有显示污染，并且在不同处理之间没有发现交叉污染。除了在仅用Ts接种的植物中，不可能回收在植物内生结合的Ts，但是在根的表面上发现了该细菌。然而，当与Gd结合接种时，Ts以较低数量定植根部(图14)。

Gd的回收显示了处理之间的重要差异(图13)。虽然在用Gd单一培养物接种的植物中，在根和叶之间的内生菌中重新分离的微生物的数量基本没有差异，当它们接种混合培养物时，以及对于仅接种Gd的那些植物来说，植物的Gd在植物的不同部分中的分布发生改变(根对比叶)。用Gd+Ts以2:1的比例接种的植物显示：内生定植得到改善，尽管事实上植物表面的定植与单次接种相同。此外，似乎用联合接种物进行处理会影响植物内细菌的迁移，有利于定位于叶子。相对于用Gd纯培养物接种的植物，用混合培养物接种植物的从植物地上部分内部分离的数目高10倍。

此外，一旦植物充分生长，将一些从管中取出，并测量湿重和干重。结果示出于图15中。

就LSD而言，植物参数的测量不显示在用Gd的不同处理之间的差异，但是其显示用Gd+Ts(1:1)处理的植物具有更高干重(DW)的趋势，并且这种混合处理的DW与对照植物之间存在显著差异，其显示：不管湿重，用1:1的混合物中用Gd+Ts处理的植物的生物量有增加趋势(图15)。

实例9

果聚糖生产和定量

用1ml Gd+1ml Ts的两种菌株的过夜培养物(OD₆₀₀约0.2)接种于有100ml的SYP的烧瓶，并孵育3天。每天收集样品，共收集3天，并将每个培养物的一式三份的1ml等分试样储存在-20℃下，以分析果聚糖生产。测量OD₆₀₀，并将连续稀释物涂板在ATGUS和海产琼脂上以获得两种菌株的cfu。在SYP中接种Gd和Ts的单一培养物，并使用与对照相同的条件孵育。

为了提取和定量样品中的果聚糖，首先将培养物离心(10,000rpm，20分钟，4℃)，并将上清液倾析并置于新管中。如实施例5所述，用3体积的甲醇沉淀样品，并置于设定为60℃的加热块(热混合仪)中，直至干燥并且其体积减至约1ml。将沉淀物溶于1ml的水中。进行酸水解，加入5M的0.2％的H₂SO₄，并在121℃下孵育1小时。孵育后，加入500μl的DNSA试剂(在100ml中，1g 3,5-二硝基水杨酸溶解于50ml的H2O、20ml的2M的NaOH、30g K-Na酒石酸盐四水合物)并混合。将试管置于沸水中15分钟，加入500μl的40％的K-Na酒石酸并混合。在540nm处测量样品的吸光度，并使用来自一系列葡萄糖标准品的校准线来估计葡萄糖浓度。

因为最近的研究表明土地芽孢杆菌属存在果聚糖蔗糖和果聚糖酶(鲁(Lu)等人，基因组公告(Genome Announcements)2015 3(2)，第e00126-15页)，所以来自Ts的果聚糖也被定量。

结果示出于图16中。虽然在比例1:1的混合培养物中果汁浓度没有显著差异，但当两种菌株都存在较高浓度的Gd时，在培养基中检测到的果聚糖定量大幅度降低。在这种情况下，培养基中的果聚糖浓度与单一Gd培养物的果聚糖浓度具有相似的趋势，但对果聚糖浓度具有更强烈的影响。不受理论的束缚，这可能是由于蔗糖的消耗和两种菌株对果聚糖的降解。

实例10

土地芽孢杆菌属对Gd的植物激素生产的影响

为了检查Gd自身或在Ts存在下产生植物生长素IAA的能力，在SYP中制备Gd、Ts、Gd+Ts(1:1)和Gd+Ts(2:1)的培养物，并且在28℃和150rpm的条件下孵育1周。在孵育的前三天和第七天，每天一式三份地取出所有培养物的样品(1ml)。将样品以13000rpm旋转5分钟，并将上清液回收在玻璃管中。将每体积样品的上清液与4体积Salowski氏试剂(150ml的的H₂SO₄ 96％、250ml的H₂O和7.5ml的FeCl₃ 0.5M)混合。粉红色的发展表明IAA产生。

使用分光光度计读取OD₅₃₅。通过标准IAA图估计IAA的浓度。最终值计算为每个样品的三次重复的平均值，并且用标准误差计算误差。

结果示出于图17中。显然，虽然Ts没有产生任何显著程度的IAA，但是在Ts的存在下，Gd的IAA生产总体上增加，这表明Ts改变了Gd的行为。

序列表

<110> 氮技术有限公司（Azotic Technologies Ltd）

<120> 农业方法

<130> P3021/WO

<150> GB1413335.9

<151> 2014-07-28

<160> 10

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 475

<212> DNA

<213> 土地芽孢杆菌属

<220>

<223> 16s

<400> 1

gcagttactc tcgtacttgt tcttccctaa caacagagct ttacgacccg aaggccttca 60

tcgctcacgc ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg 120

cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc 180

ggctatgcat cgtcgccttg gtgggccatt accccaccaa ctagctaatg caccgcgggc 240

ccatctgtaa gtgacagccg aaaccgtctt tccatttcca atcaggagaa aggaaatact 300

atccggtatt agctccggtt tcccgaagtt atcccagtct tacaggcagg ttgcccacgt 360

gttactcacc cgtccgccgc tcattccgcc agaatcaccc cgaaggggta atctggtttc 420

ctgcgctcga cttgcatgta ttaggcacgc cgccagcgtt cgtcctgagc catga 475

<210> 2

<211> 487

<212> DNA

<213> 土地芽孢杆菌属

<400> 2

cgtcaggtac gagcagttac tctcgtactt gttcttccct aacaacagag ctttacgacc 60

cgaaggcctt catcgctcac gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat 120

tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca 180

ccctctcagg tcggctatgc atcgtcgcct tggtgggcca ttaccccacc aactagctaa 240

tgcaccgcgg gcccatctgt aagtgacagc cgaaaccgtc tttccatttc caatcaggag 300

aaaggaaata ctatccggta ttagctccgg tttcccgaag ttatcccagt cttacaggca 360

ggttgcccac gtgttactca cccgtccgcc gctcattccg ccagaatcac cccgaagggg 420

tcatctggtt tcctgcgctc gacttgcatg tattaggcac gccgccagcg ttcgtcctga 480

gccatga 487

<210> 3

<211> 482

<212> DNA

<213> 土地芽孢杆菌属

<400> 3

ggtacgagca gttactctcg tacttgttct tccctaacaa cagagcttta cgacccgaag 60

gccttcatcg ctcacgcggc gttgctccgt cagactttcg tccattgcgg aagattccct 120

actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc 180

tcaggtcggc tatgcatcgt cgccttggtg ggccattacc ccaccaacta gctaatgcac 240

cgcgggccca tctgtaagtg acagccgaaa ccgtctttcc atttccaatc aggagaaagg 300

aaatactatc cggtattagc tccggtttcc cgaagttatc ccagtcttac aggcaggttg 360

cccacgtgtt actcacccgt ccgccgctca ttccgccaga atcaccccga aggggtcatc 420

tggtttcctg cgctcgactt gcatgtatta ggcacgccgc cagcgttcgt cctgagccat 480

ga 482

<210> 4

<211> 474

<212> DNA

<213> 土地芽孢杆菌属

<400> 4

gcagttactc tcgtacttgt tcttccctaa caacagagct ttacgacccg aaggccttca 60

tcgctcacgc ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg 120

cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc 180

ggctatgcat cgtcgccttg gtgggccatt accccaccaa ctagctaatg caccgcgggc 240

ccatctgtaa gtgacagccg aaaccgtctt tccatttcca atcaggagaa aggaaatact 300

atccggtatt agctccggtt tcccgaagtt atcccagtct tacaggcagg ttgcccacgt 360

gttactcacc cgtccgccgc tcattccgcc agaatcaccc cgaaggggtc atctggtttc 420

ctgcgctcga cttgcatgta ttaggcacgc cgccagcgtt cgtcctgagc catg 474

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

tcgacgacct cccagaatac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ccttgtagcc gatcttcagc 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

acgccgatca gttcaagcta t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

cctggttcgt gtaggtctgg 20

<210> 9

<211> 477

<212> DNA

<213> 嗜盐土地芽孢杆菌

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> 32

<223> /注="未知的"

<400> 9

cgtcaaggta caagcagtta ctcttgtact tnttcttccc tgacaacaga gctttacgac 60

ccgaaggcct tcatcgctca cgcggcgttg ctccgtcaga ctttcgtcca ttgcggaaga 120

ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc 180

accctctcag gtcggctatg catcgtcgcc ttggtgggcc attaccccac caactagcta 240

atgcaccgcg ggcccatctg taagtgacag ccgaaaccgt ctttccattt ccaatcagga 300

gaaaggaaat actatccggt attagctccg gtttcccgaa gttatcccag tcttacaggc 360

aggttgccca cgtgttactc acccgtccgc cgctcattcc gccagaatca ccccgaaggg 420

gtcatctggt ttcctgcgct cgacttgcat gtattaggca cgccgccagc gttcgtc 477

<210> 10

<211> 477

<212> DNA

<213> 嗜糖土地芽孢杆菌

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> 401

<223> /注="未知的"

<400> 10

cgtcaaggta cgagcagtta ctctcgtact tgttcttccc taacaacaga gctttacgac 60

ccgaaggcct tcatcgctca cgcggcgttg ctccgtcaga ctttcgtcca ttgcggaaga 120

ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc 180

accctctcag gtcggctatg catcgtcgcc ttggtgggcc attaccccac caactagcta 240

atgcaccgcg ggcccatctg taagtgacag ccgaaaccgt ctttccattt ccaatcagga 300

gaaaggaaat actatccggt attagctccg gtttcccgaa gttatcccag tcttacaggc 360

aggttgccca cgtgttactc acccgtccgc cgctcattcc nccagaatca ccccgaaggg 420

gtcatctggt ttcctgcgct cgacttgcat gtattaggca cgccgccagc gttcgtc 477

PCT/RO/134表

Claims

1.一种用于将植物生长介导实体或物质引入植物中的方法，所述方法包括将所述植物生长介导实体或物质与土地芽孢杆菌属菌株组合施用于植物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该土地芽孢杆菌属菌株是嗜糖土地芽孢杆菌。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该嗜糖土地芽孢杆菌菌株包括SEQ IDNO 1-4中任一个。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物生长介导实体或物质是固氮细菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其中该固氮细菌是形成果聚糖包被的细菌。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中该固氮细菌是重氮营养葡糖醋杆菌(Gd)。

7.根据权利要求6所述的方法，其中在施用之前，该土地芽孢杆菌属与该Gd密切结合。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将土地芽孢杆菌属和植物生长介导实体或物质的组合施用于生长中的植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中在施用所述组合之前使该植物经历创伤过程。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将土地芽孢杆菌属和固氮细菌的组合施用于种子。

11.一种农业组合物，包括土地芽孢杆菌属菌株。

12.根据权利要求10所述的农业组合物，该农业组合物进一步包括固氮细菌。

13.根据权利要求12所述的农业组合物，其中该固氮细菌是重氮营养葡糖醋杆菌(Gd)。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的农业组合物，其中该土地芽孢杆菌属菌株是嗜糖土地芽孢杆菌、嗜盐土地芽孢杆菌、Terribacillus goriensis或Terribacillusaidingensis。

15.根据权利要求13所述的农业组合物，其中该嗜糖土地芽孢杆菌菌株包括SEQ ID NO1-4中任一个。

16.土地芽孢杆菌属菌株在农业中的用途，其中该土地芽孢杆菌属用于促进植物生长介导实体或物质转移到植物中。

17.根据权利要求16所述的用途，其中该植物生长介导实体或物质是转移到植物细胞中的固氮细菌。

18.根据权利要求16或权利要求17所述的用途，其中该土地芽孢杆菌属菌株是嗜糖土地芽孢杆菌或嗜盐土地芽孢杆菌、Terribacillus goriensis或Terribacillusaidingensis。

19.一种组合，该组合可通过将土地芽孢杆菌属菌株和固氮细菌菌株混合在一起而获得，用于在农业中使用。

20.根据权利要求18所述的组合，其中该固氮细菌是形成果聚糖包被的细菌。

21.根据权利要求19或权利要求20所述的组合，其中该固氮细菌是重氮营养葡糖醋杆菌(Gd)。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的组合，其中该土地芽孢杆菌属菌株是嗜糖土地芽孢杆菌、嗜盐土地芽孢杆菌、Terribacillus goriensis或Terribacillusaidingensis。

23.一种用于制备土地芽孢杆菌属菌株和固氮细菌菌株的组合的方法，所述方法包括在培养基中共培养所述菌株，该培养基支持两种菌株的生长。

24.根据权利要求23所述的方法，其中该固氮细菌是Gd。

25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中该培养基选自MYP或SYP。

26.一种重组土地芽孢杆菌属菌株，该重组土地芽孢杆菌属菌株已经被转化以表达植物生长介导物质。

27.一种植物或种子，该植物或种子由土地芽孢杆菌属或根据权利要求19至22中任一项所述的组合进行定植。

28.获得自根据权利要求27所述的植物的种子或子代，该种子或子代包含土地芽孢杆菌属。

29.根据权利要求28所述的种子或子代，该种子或子代进一步包括固氮细菌。

30.根据权利要求29所述的种子或子代，其中该固氮细菌是重氮营养葡糖醋杆菌(Gd)。