CN108795799B - 一株用于控制土壤磷素流失的多功能节杆菌Fp64及其应用 - Google Patents

一株用于控制土壤磷素流失的多功能节杆菌Fp64及其应用 Download PDF

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    • C09K2101/00Agricultural use

Abstract

本发明涉及一株用于控制土壤磷素流失的多功能节杆菌Fp64及其应用,本发明节杆菌Fp64保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No.15644保藏日期为2018年04月26日。本发明节杆菌Fp64在农业生产中作为磷素调节菌剂等的应用;本发明节杆菌Fp64具有良好的环境适应性,具有拮抗病原菌能力。本发明的节杆菌Fp64添加至土壤中,可有效防治土壤磷元素流失。

Description

一株用于控制土壤磷素流失的多功能节杆菌Fp64及其应用
技术领域
本发明涉及一株用于控制土壤磷素流失的多功能节杆菌Fp64及其应用,属于微生物应用技术领域。
背景技术
磷素是农业作物的必须营养元素,实际生产中往往通过大量增施化肥及有机肥维持产量,土壤(尤其是耕层土壤)长期处于富磷状态,土壤中可迁移形态磷累积量大,容易流失引起水体富营养化。据估计全世界每年大约有3×106~4×106吨P2O5从土壤迁移到水体中,其中中国农田磷进入水体的量为19.5kg/hm2。磷在农业环境中产生的流失量达到0.015mg/L时,就可能引发“水华”现象,是水体富营养化的主要限制因子。由于农田土壤通过径流、淋溶等形成的土壤渗漏液造成磷素的面源污染是引起水体富营养化的重要原因,故而控制农业土壤中的磷素流失是减少水体富营养化的重要渠道。
许多细菌或真菌具有从环境中摄取并富集磷的作用,其中包括假苍白杆菌、假单胞菌、不动杆菌、赤杆菌等。不过目前绝大部分具有除磷效果的菌株筛选自污水或污泥,并集中应用于已经受到污染的水体防治,对控制污染源头磷素流失的微生物研究成果较少。为了更好的从农业面源污染源头对土壤中磷流失进行有效控制,本发明提供了一株筛选自设施农业土壤中的、兼具高效除磷、耐盐和生防特性的菌株,该菌株在设施农业中的应用可有效减少磷流失,并具有广泛的适应性和生物防治功能。
发明内容
本发明目的是提供一株用于控制土壤磷素流失的多功能节杆菌Fp64及其应用。本发明多功能节杆菌Fp64,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.15644保藏日期为2018年04月26日。
节杆菌Fp64在20℃~35℃下最适生长,通过革兰氏染色后在显微镜下呈阳性,菌体呈椭球状,直径为0.6~0.9μm。该菌株的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,序列长度为1433bp。根据形态特征和生理生化特征及16S rRNA基因序列在Genbank中的检索结果,鉴定该菌株为产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)。
本发明多功能节杆菌Fp64具有较好的土壤适应性,能够将无机磷摄入体内转化为自身组分,进而阻止土壤中磷素向水体流失,并且本发明节杆菌Fp64兼具耐高盐、拮抗病原菌的特性,环境适应性好,同时可减少土壤中病原菌数量,改善土壤菌群结构。
本发明还包括,节杆菌Fp64在制备调控土壤氮磷转化、改善根际菌群组成、削减氮磷流失的微生物菌剂中的应用。
进一步的,本发明还包括一种用于控制土壤磷素流失的微生物菌剂,微生物菌剂中包括节杆菌Fp64。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果:
(1)本发明节杆菌Fp64在土壤环境中具有良好的适应性,在农业生产中可作为磷素调节菌剂等的应用;
(2)本发明节杆菌Fp64在总磷浓度为10mg/L的低营养培养液中培养48h,利用聚磷作用,可除去培养液中70%的磷,土壤渗漏液中磷的含量一般不超过10mg/L,本菌株可用于防止土壤磷流失。
(3)本发明节杆菌Fp64具有逆境环境适应性,在NaCl终浓度高达100g/L的培养条件下可正常生长(耐盐率:98.86%),故而本菌株也可用于盐碱(渍)地土壤。
(4)本发明节杆菌Fp64具有拮抗病原菌能力,对常见的作物病原菌镰刀菌、腐霉菌、灰霉菌和立枯丝核菌的抑菌率分别为86.99%、100%、69.23%和51.34%,释入土壤后可调节优化微生物菌群结构,减少病原菌数量,预防病害的爆发。
附图说明
图1为本发明节杆菌Fp64,其中1A为节杆菌Fp64的菌落形态图,1B为革兰氏染色的节杆菌Fp64,1C为异染粒染色的节杆菌Fp64;
图2为本发明节杆菌Fp64与菌株Bp19、菌株Fp31、菌株Np20、菌株Bp15、菌株Fp38、菌株Bp13、菌株Bp14、菌株Bp12除磷效果对比图;
图3为本发明节杆菌Fp64耐盐率柱状图;
图4为本发明节杆菌Fp64对镰刀菌、腐霉菌、灰霉菌和立枯丝核菌的抑菌率柱状图;
图5为本发明节杆菌Fp64土壤适应性柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1菌株的筛选
(1)菌株来源
本发明节杆菌Fp64分离筛选自设施农业大棚土壤,取样深度为20~40公分。
(2)初筛
菌株的初筛采用PAOs筛选培养基,配方为:柠檬酸钠4g、NaCl 0.5g、(NH4)2SO42.5g、CalCl2 0.25g、MgSO4 0.25g、Na2HPO4 12.8g、KH2PO4 3g、麦芽糖0.01g、甲苯胺蓝0.025g、琼脂20g、pH无需调节110℃灭菌20min。培养温度28℃。
初步筛选步骤为:(1)准备若干含有9ml水的试管和若干含100ml水的摇瓶,121℃高压灭菌20分钟,冷却后备用;(2)土样每份10g,分别装入100ml无菌水的摇瓶中,摇床振荡30分钟,静置30分钟获得上清(10-1)。吸取上清液1ml至9ml无菌水的试管中,充分振荡混匀,获得稀释液(10-2)。依次类推获得稀释液(10-3);(3)分别吸取三个梯度稀释液1ml至9mm培养皿中,倒入40℃的PAOs固体培养基15ml,充分混匀,凝固后倒置,28℃恒温暗培养,培养时间为7~10天。分离纯化方法为划线法,选取单菌落,根据形态、大小、颜色等表型特征,分别用接种环转接至PAOs固体培养基,反复划线分离,直至每个平板中单菌落形态一致、显微形态也统一为止。
(3)复筛
利用异染粒染色法对初筛的菌株进行第二次筛选,具体步骤为:(1)配制染色液I(将0.15g甲苯胺蓝和0.2g孔雀绿溶于2ml乙醇中,再加入混合均匀的1ml冰醋酸和100ml蒸馏水)和染色液II(碘2g和碘化钾3g,溶于100ml蒸馏水);(2)将涂布菌体的载玻片置于染色液I中染色5分钟,再用染色液II冲去染色液I,染色1分钟进行镜检,镜检结果中异染粒被染成黑色,菌体为绿色。本步骤筛选具有明显异染粒结构的菌株。
(4)定量筛选
对上述筛选获得的菌株进行除磷效果分析,具体步骤为:(1)菌株活化,接种环挑取单克隆接入适量无菌LB(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L)培养液中30℃180r/min暗培养过夜;(2)菌株活化发酵液加入50ml初始总磷质量浓度为10.0mg/L的无菌低营养培养液(MgSO4·7H2O 0.4g,FeSO4·7H2O 0.002g,CaSO4·2H2O 0.08g,乙酸钠0.5g,牛肉膏0.22g,(NH4)2SO4 0.2g,KH2PO4 43.87mg,ddH2O 1L,用1.0mol/L的NaOH调节pH至6.5)中,以体积比1:100添加,30℃180r/min暗培养至对数期;(3)将培养液在5000r/min离心10分钟,获得上清液,采用钼锑抗分光光度计法测定上清液中总磷含量,以未接菌的无机盐培养为对照,计算公式为除磷率(%)=(对照总磷量-上清液总磷量)/对照总磷量×100%,设三个生物学重复。
本发明经过筛选获得了一株性能较好的菌株Fp64,如图1所示,经16S rDNA分子鉴定为产脲节杆菌Arthrobacter ureafaciens,节杆菌Fp64,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.15644保藏日期为2018年04月26日。
实施例2节杆菌Fp64的除磷效果及其他特性鉴定
1、除磷效果
采用本发明节杆菌Fp64以及实施例1中复筛获得的8株菌株(Bacillus subtilisBp19、Rhodococcus rhodochrous Fp31、Microbacterium esteraromaticum Np20、Bacillus subtilis Bp15、Arthrobacter keyseri Fp38、Bacillus subtilis Bp13、Bacillus methylotrophicus Bp14、Bacillus subtilis Bp12)进行除磷率的对比,实验结果如图2所示,由图2可见,本发明节杆菌Fp64在含终浓度为10mg/L磷的营养液中除磷率为70.52%,节杆菌Fp64在培养液中的除磷效果相比从土壤中筛选获得的其他除磷菌具有显著优势。
2、耐盐性测定
将本发明节杆菌Fp64摇菌活化后,以体积比1:100接种至添加50、100和150g/LNaCl的LB液体,30℃180r/min培养过夜,以不添加NaCl的培养液为对照,将发酵产物涂布平板计数,计算耐盐率,计算公式为耐盐率(%)=处理菌数/对照菌数×100%,设三个生物学重复。实验结果如图3所示,结果表明,节杆菌Fp64在50g/L NaCl浓度下耐盐率为106.27%,未受到胁迫影响,活菌数甚至还有微弱的提高;在100g/L NaCl浓度下耐盐率为98.86%,接近于100%的活菌数,故而本发明节杆菌Fp64可耐受高达100g/L的NaCl盐浓度。
3、拮抗效果
将节杆菌Fp64摇菌活化后,与未凝固的PDA混匀倒入9cm平皿凝固,在30℃培养24h,然后在平板中央分别接入活化的病原菌(镰刀菌、腐霉菌、灰霉菌和立枯丝核菌)菌块,在病原菌最适温度下培养3~4天,以PDA中培养的病原菌为对照,测量病原菌直径,计算抑菌率公式为抑菌率(%)=(对照直径-处理直径)/对照直径×100%,设三个生物学重复。实验结果如图4所示,由图4可见,节杆菌Fp64对镰刀菌、腐霉菌、灰霉菌和立枯丝核菌的抑菌率分别为86.99%、100%、69.23%和51.34%。
实施例3节杆菌Fp64的土壤适应性和降低土壤磷素流失的效果测定
在直径为12cm、高度为30cm的透水培养钵中栽种黄瓜幼苗,盆栽土壤采集自设施大棚土层1m以内土壤(土壤速效磷含量为49.55mg/kg),新鲜土壤取得后立即进行盆栽试验。处理组为掺入20ml浓度为1×108/ml节杆菌Fp64的无菌水悬浮液的土壤,对照组掺入20ml无菌水的土壤,各设五个生物学重复。测定土壤最大持水量,浇水量定量且不超过持水量,在25~28℃、14~16h光照条件下培养。
处理组和对照组分别在刚接入时和培养30d取20cm深度土壤,采用OMEGA试剂盒提取土壤总DNA,以节杆菌Fp64的PCR特异性引物进行定量PCR,计算土壤节杆菌含菌量。结果如图5所示。由图5可见,培养30d时处理组土壤中节杆菌的含量相对于对照组显著提高,菌量保持在106拷贝/g干土水平。
培养30d后,每盆浇透并继续浇水使每处理渗漏液体积相同,采用钼锑抗分光光度计法测定渗漏液中的总磷含量,计算除磷率公式为除磷率%=(对照磷含量-处理磷含量)/对照磷含量×100。实验结果表明,节杆菌Fp64对土壤渗漏液中磷素的去除率为90.19±1.33%。
序列表
<110> 山东省科学院生态研究所
<120> 一株用于控制土壤磷素流失的多功能节杆菌Fp64及应用
<130> y18-1-294xin
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1433
<212> DNA
<213> 产脲节杆菌(产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens))
<400> 1
gcgtgggggc gtgcttacca tgcagtcgaa cgatgatccg gtgcttgcgc cggggattag 60
tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgagtaac ctgcccttga ctctgggata agcctgggaa 120
actgggtcta ataccggata tgacttctca tcgcatggtg gggggtggaa agctttttgt 180
ggttttggat ggactcgcgg cctatcagct tgttggtggg gtaatggcct accaaggcga 240
cgacgggtag ccggcctgag agggtgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga tgcagcgacg 360
ccgcgtgagg gatgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt cagtagggaa gaagccctct 420
ttgggggtga cggtacttgc agaagaagcg ccggctaact acgtgccagc agccgcggta 480
atacgtaggg cgcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagagctcgt aggcggtttg 540
tcgcgtctgc tgtgaaagac cggggctcaa ctccggttct gcagtgggta cgggcagact 600
agagtgcagt aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga 660
ggaacaccga tggcgaaggc aggtctctgg gctgtaactg acgctgagga gcgaaagcat 720
ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgttgg gcactaggtg 780
tgggggacat tccacgtttt ccgcgccgta gctaacgcat taagtgcccc gcctggggag 840
tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat 900
gcggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacatgga ccggaaagac 960
ctggaaacag gtgccccgct tgcggccggt ttacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1020
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgttct atgttgccag 1080
cggttcggcc ggggactcat aggagactgc cggggtcaac tcggaggaag gtggggacga 1140
cgtcaaatca tcatgcccct tatgtcttgg gcttcacgca tgctacaatg gccggtacaa 1200
agggttgcga tactgtgagg tggagctaat cccaaaaagc cggtctcagt tcggattggg 1260
gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag caacgctgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaag tcacgaaagt tggtaacacc 1380
cgaagccggt ggcctaaccc ttgtggggga gccgtcgaag gtgaaccggc gtt 1433

Claims (5)

1.一株用于控制土壤磷素流失的多功能节杆菌Fp64,其特征在于,节杆菌Fp64,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.15644,保藏日期为2018年04月26日,分类命名为产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)。
2.根据权利要求1所述的节杆菌Fp64,其特征在于,菌株的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.如权利要求1或2所述的节杆菌Fp64在控制土壤磷素流失方面的应用。
4.如权利要求1或2所述的节杆菌Fp64在制备控制土壤磷素流失方面的微生物菌剂中的应用。
5.一种用于控制土壤磷素流失的微生物菌剂,其特征在于,所述微生物菌剂中包括节杆菌Fp64,该节杆菌Fp64的保藏编号为CGMCC No.15644,保藏日期为2018年04月26日。
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