CN114149287A

CN114149287A - 一种固体微生物肥料的制备方法及应用

Info

Publication number: CN114149287A
Application number: CN202111253293.0A
Authority: CN
Inventors: 郭长虹; 张莹; 陈佳欣; 姚琳
Original assignee: Harbin Normal University
Current assignee: Harbin Normal University
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2022-03-08

Abstract

本研究发明了一种固体微生物肥料，该固体微生物肥料由微生物菌剂50重量份和载体100重量份组成。所述微生物菌剂由拜氏不动杆菌LJL‑12组成，保藏号为CGMCC No.6291，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述载体为生物炭和膨润土经过高温灭菌后1:1混合而成，对菌株LJL‑12无毒性影响。该固体微生物肥料与化肥配施在促进马铃薯生长的同时，还能替代15%的化肥；可有效改善马铃薯的营养品质，提高维生素C含量、淀粉含量，降低还原糖含量。

Description

一种固体微生物肥料的制备方法及应用

技术领域

本发明属于微生物肥料领域，具体涉及一种固体微生物肥料的制备方法及其应用。

背景技术

马铃薯（Solanum tuberosum L.），又称土豆、洋山芋等，是茄科一年生草本植物，块茎可供食用，营养价值高，含有多种维生素、无机盐和淀粉，含有丰富的膳食纤维，是全球第四大重要的粮食作物，仅次于小麦、水稻和玉米。原产于南美洲，具有适应性好、增产空间大等特点，我国是世界上马铃薯产量最高的国家，黑龙江是主要的种植区之一。近些年人们对马铃薯的需求量不断提高，为了达到更高的产量，人们往往在种植过程中大量施用化肥。但不合理施肥不仅会导致马铃薯种植成本增加，还会使马铃薯的综合抗性降低，土壤中有害微生物增多，土传病害频繁发生，使马铃薯产量和品质降低。

我国是一个人口众多的国家，在满足人们对粮食的需求方面，农业占有重要的地位，但现在农业依赖化肥的情况越来越严重。据统计，我国种植667 m²农作物需要21.9 kg的化肥，是美国的2.6倍，欧洲的2.5倍。化肥的不节制使用已经造成了环境和健康问题，继续使用化学合成品来提高土壤肥力、果实产量，往往会产生意想不到的环境影响。不仅会导致农业生产力下降、土壤流失，还会造成土壤中金属的积累，使环境污染问题越来越严重。在这样的背景下，微生物肥料受到人们的关注，它具有节约资源、安全、生态友好等特点，可以满足当前农业的发展需求。

植物根际促生细菌（Plant growth promoting rhizobacteria, PGPR）是一类能够促进植物生长、加快植物对营养的吸收、有增产能力的有益菌群。由其制成的微生物肥料能够提高土壤肥力，增加作物产量和品质，是可再生的能源，是化肥的有效替代品。在作物生产中施用微生物肥料，将对农业的可持续发展产生深远影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够减少化肥施用、且促进马铃薯的生长和品质提高的固体微生物肥料。

本发明的另一目的是提供所述固体微生物肥料的制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种促进马铃薯生长的微生物菌肥，由微生物菌剂50重量份和载体100重量份组成。

所述菌剂中含有拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii）2亿cfu/g，所述载体为生物炭和膨润土经过高温灭菌后1:1混合而成。

拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii）LJL-12在ADF培养基上形成圆形、不透明、灰白色、突起光滑、边缘整齐、有粘性的菌落；革兰氏染色菌体呈红色，为革兰氏阴性菌。

拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii）LJL-12除了具有ACC脱氨酶活性，还能够合成吲哚乙酸、嗜铁素、溶解无机磷。

所述载体无毒，且能够促进微生物的生长。

所述生物炭为黑色颗粒状，具有质量轻、透气性好、保肥性好、吸附性强等优点，含有植物所需的磷、钾、镁等元素。

所述膨润土为乳白色粉末，具有吸水膨胀、分散、悬浮、离子交换和吸附等性质。

本发明还提供所述微生物肥的制备方法，包括如下步骤：

（1）微生物菌剂的制备

将上述拜氏不动杆菌LJL-12划线至LB固体培养基中，培养温度28℃，培养时间为12~16h。挑取单菌落接种于LB液体培养基中，制备菌悬液；

将菌悬液以1%的体积比接入发酵培养基中，初始pH为7，培养温度为28℃，转速为180 rpm，振荡培养12~24 h，所得到的培养液即为所述微生物菌剂。

（2）载体的制备

将上述载体经灭菌锅高压灭菌1-2 h后，在超净工作台中分装成100 g小袋(生物炭:膨润土=1:1)。

（3）固体微生物肥料的制备

接种50 mL上述微生物菌剂，充分混匀后，倒入自封袋中立即封口，用灭菌针在塑料袋的四周及中间扎若干小孔，同样操作再套一自封袋，一切操作均在无菌条件下进行。为了保证固体菌肥的有效菌活性，保证马铃薯植株正常的生长发育，在菌肥中添加2~3 mL马铃薯所需微量元素溶液。将做好的菌肥置于28℃~30℃下培养7~10 d，之后常温保存，待用。

所述微量元素包含铁、锰、锌、铜、硼、钼元素。

所述微量元素溶液具体为硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、硼酸、钼酸钠的混合液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1.拜氏不动杆菌LJL-12在土壤中有较好的适应性。

2.生物炭作为肥料的载体，提供了接种物进入土壤后生存率的可能性，释放微生物所需的营养，起到保水、保肥的作用。膨润土作为肥料的载体，不仅可以改善肥料的物理性状，而且可以减少肥料在土壤中养分的损失，控制肥料中养分的释放，提高肥料的利用率。二者混合后作为固体微生物肥料的载体，可为PGPR提供营养，提高肥料利用率，间接促进作物生长发育。

3.本发明的固体菌肥施入土壤后，起到疏松土壤、避免土壤板结的作用，有利于微生物呼吸，使菌群保持活性。与液体菌肥相比，促生菌群数量稳定，植物利用PGPR效率高，起到缓释的效果。

本发明固体微生物肥料中，微生物菌剂可以合成IAA、嗜铁素，溶解难溶无机磷，经大田实地验证，该固体微生物肥料配方合理，功效稳定，能有效促进植物吸收营养物质，促进植物生长，改善作物品质，增加产量。

保藏说明

本发明对上述菌种进行了下述保藏：

保藏时间：2012年6月26日，保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii）LJL-12保藏号为CGMCC No. 6291。

附图说明

图1为不同载体吸水率；

图2为不同载体pH；

图3为供试载体对接种菌株的毒性测试；

图4为不同处理对马铃薯维生素C含量影响；

图5为不同处理对马铃薯还原糖含量影响；

图6为不同处理对马铃薯淀粉含量影响。

具体实施方式

下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次以上重复实验，结果取平均值。

一、微生物菌剂的制备

将拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii）LJL-12划线至LB培养基中，培养温度28℃，培养时间为12~16h。

挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于全温培养摇床28℃，180 r/min条件下培养12~24 h。等菌株充分生长后，用紫外分光光度计测菌株悬浮液OD值，调至OD₆₀₀=0.5，即为菌株菌悬液。

将菌悬液以1%的体积比接入发酵培养基，初始pH为7，培养温度为28℃，转速为180rpm，振荡培养12~24 h，所得到的培养液即为所述微生物菌剂。

二、载体性质的测定

1、载体吸水率的测定

将生物炭和膨润土121℃灭菌2 h（重复间歇灭菌，每次1 h），自然晾干备用。在无菌条件下，将无菌水与载体充分混匀，每次加入无菌水的量按照一定梯度逐渐增加，使载体材料保持湿润、疏松、不结块。以100 g（保持湿润疏松状态）载体所含的无菌水量为载体吸水率。重复3次，取平均值。

取灭菌烘干后的载体进行测定，实验结果如图1。结果表明，生物炭的平均吸水率为75.02%，膨润土的平均吸水率为41.45%，复合载体的平均吸水率为70.19%，符合载体要求。

2、载体pH的测定

随机称取样品8 g，将样品置于干净烧杯内，按1:2加入去离子水，浸泡振荡均匀，测定样品悬浮液pH边测边搅拌，待仪器稳定后读数记录。重复3次，取平均值。

由图2可知，生物炭的平均pH为6.86，膨润土的平均pH为9.44，复合载体的平均pH为7.56。其中，复合载体的pH环境更适宜菌株LJL-12的生长。

3、载体毒性的测定

称取不同载体及其组合风干样20 g于盛有200 mL蒸馏水的500 mL的锥形瓶中，150 r/min，30℃震荡后，用0.2 μm的细胞过滤膜过滤后得到无菌滤液，待用。将0.1 mL混合功能菌液接种到盛有6 mL滤液的试管中，于28℃、150 r/min震荡6 d，通过稀释梯度法测定有效菌的数量，通过与原始接种菌落数进行比较，判断载体是否对微生物的生长有影响。

如图3，培养6天的菌株LJL-12，其有效活菌数较初始接种有所提高，说明供试载体无毒，而且载体可为微生物提供营养成分，保持微生物活性。

三、固体微生物肥料的制作

综合载体吸水率、pH、毒性检测的实验结果，选择复合载体作为固体微生物肥料的载体。将复合载体（生物炭: 膨润土=1:1）灭菌1～2 h后分装成100 g小袋，接种50 mL上述微生物菌剂，充分混匀后，倒入自封袋中立即封口，用灭菌针在塑料袋的四周及中间扎若干小孔，扎孔后的自封袋再外套一自封袋，并在外层自封袋的四周扎几个小孔，一切操作均在无菌条件下进行。为了保证固体菌肥的有效菌活性，保证马铃薯植株正常的生长发育，在菌肥中添加2~3 mL马铃薯所需微量元素溶液（Zn、Cu、Mn、Fe等）。将做好的菌肥置于28℃~30℃下培养7~10 d，之后常温保存，待用。

四、微生物肥料质量检测

1、液体微生物肥料质量检测

参照微生物肥料国家标准NY227-94。取液体微生物肥料10~20 mL（精确到0.01mL），加入带有玻璃珠的90~180 mL的无菌水中，静置20 min后在摇床中200 r/min充分振荡30 min，即成母液的菌悬液。用无菌枪头吸取5 mL菌悬液加入45 mL无菌水中，混合成1:10的菌悬液，按梯度稀释法分别得到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5等浓度。分别吸取不同浓度的菌悬液0.1 mL，均匀涂布在LB培养基上。每个稀释度重复三次，同时用无菌水做对照处理，培养2～5 d，菌落计数。

对储存于4℃冰箱中的液体微生物肥料进行有效活菌数检测。经15 d，30 d，45 d，60 d，75 d，90 d，120 d，150 d，180 d，210 d各检查一次。

2、固体复合微生物肥料质量检测

取固体微生物肥料10~20 g（精确到0.01 g），以下同液体微生物肥料质量检测方法。对储存于室温下的液体微生物肥料进行有效活菌数检测。经15 d，30 d，45 d，60 d，75d，90 d，120 d，150 d，180 d，210 d各检查一次。微生物肥料质量检测的结果如表1，在第150 d时，液体微生物肥料出现絮状沉淀，伴有臭味。建议该液体复合微生物肥料生产后，最好在4个月内使用。固体微生物肥料从90 d开始有效活菌数呈现下降趋势，到第210 d时，菌肥已被污染。建议固体微生物肥料最好在6个月内使用。

从结果来看，固体菌肥与液体菌肥相比，保存时间更长，肥效更持久。分析原因可能是，复合载体为不动杆菌LJL-12提供了一种适宜的生存环境，生物炭提供了接种物进入土壤后生存率的可能性，释放微生物所需的营养，起到保水、保肥的作用。膨润土可以减少肥料在土壤中养分的损失，控制肥料中养分的释放，提高肥料的利用率。二者混合后作为固体微生物肥料的载体，可为不动杆菌LJL-12提供营养，更有利于其繁殖生长。

表1 微生物肥料LJL-12的质量检查结果

注：“+”表示污染，“-”表示无污染。

五、田间试验下固体微生物肥料对马铃薯生长的影响

本试验于黑龙江省哈尔滨市利民开发区哈尔滨师范大学农园进行，每处理重复3次，试验区组内完全随机排列。小区每垄4 m长，垄宽为70 cm，1 m挖3穴，种植马铃薯，四周设有保护行。

施用液体微生物肥料时要均匀施用到小区各处，为保持菌体在土壤中的活性，在马铃薯各个生育期阶段进行灌根处理，每小区施肥量为2.5 L（微生物菌剂:蒸馏水=1:50），对照组采用等量蒸馏水处理。固体微生物肥料在种植前浅施于土壤表层，入土深度5~8 cm为好。整个试验期内不再施除草剂、化肥等其他化学合成物质。

设5种处理，分别为：CK为空白对照，T1为LJL-12液体菌肥+85%化肥，T2为全肥，T3为LJL-12固体菌肥+85%化肥，T4为固体载体。

在收获期对小区中的马铃薯进行随机抽取，对其生物量进行测定，结果见表2。与未接菌的对照（CK）相比，各菌肥均显著提高了马铃薯促生指标（P < 0.05）。

与CK相比，T1、T2、T3、T4处理的马铃薯株高分别增加了17.32%、10.75%、23.14%、-7.12%；茎粗分别增加了4.33%、-0.52%、5.36%、-12.98%；分蘖数分别增加了33.33%、8.33%、41.67%、-8.33%；叶绿素含量分别增加了10.77%、6.93%、12.48%、-3.23%；产量分别增加了19.63%、41.36%、27.23%、-3.14%。

T3处理与CK相比，株高、茎粗、分蘖数、产量差异显著（P < 0.05）。除块茎产量外，T3（固体微生物肥料）较T2（全肥）相比，各促生指标均有所提高。其中，固体微生物肥料的促生效果优于液体微生物肥料。

表2 不同处理对马铃薯生长的影响

处理组	株高（cm）	茎粗（cm）	分蘖数（个）	叶绿素含量	产量（kg）
						CK	53.94±1.82 c	1.16±0.18 a	2.40±0.55 c	42.16±1.67 bc	0.76±0.07 c
T1	63.28±2.30 a	1.21±0.07 a	3.20±0.45 ab	46.70±2.38 a	0.91±0.04 b
						T2	59.74±3.15 b	1.15±0.10 a	2.60±0.55 bc	45.08±3.94 ab	1.08±0.04 a
T3	66.42±3.52 a	1.22±0.06 a	3.40±0.55 a	47.42±2.00 a	0.97±0.10 b
						T4	50.10±0.95 d	1.01±0.04 b	2.20±0.45 c	40.80±2.31 c	0.74±0.06 c

注：CK: 空白对照; T1: LJL-12液体菌肥+85%化肥; T2: 全肥; T3: LJL-12固体菌肥+85%化肥; T4: 固体载体。同列标以不同小写字母的数值在0.05水平显著差异。

六、田间试验下固体微生物肥料对马铃薯品质的影响

1、对马铃薯维生素C含量的影响

采用紫外分光光度法，每处理重复3次。分别称取10 g待测样品于榨汁机中，各加入1% HCl 10 mL，匀浆，转移到50 mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀并移至离心管中8000 r/min，离心10 min，上清液即为样品待测提取液。

酸处理：取1 mL样品待测提取液，放入盛有2 mL 10% HCl的50 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。以蒸馏水为空白，测OD_243.4吸光值；碱处理：取1 mL样品待测提取液、10 mL蒸馏水和4 mL 1 mol/L NaOH溶液放入50 mL容量瓶中，摇匀，静置20 min后加入4 mL10% HCl，混匀，并定容至刻度。以蒸馏水为空白，测OD_243.4吸光值。样品提取液的吸光值为酸处理和碱处理吸光值之差。代入标曲中，即可求出维生素C浓度。计算公式如下：

其中，C——依据标准曲线方程计算得到的维生素C浓度，μg/mL；

V_总——测吸光度时吸取样品溶液的体积，mL；

V_待测总——吸取样品定容总体积，mL；

V₁——待测样品总体积，mL；

W_总——样品质量，g；

100为100 g样品。

结果如图4所示，除T4处理外，其余处理均能提高马铃薯的维生素C含量，但差异不显著（P < 0.05）。T1、T2、T3处理较CK分别增加15.94%、22.91%、21.91%，T4处理增加-4.98%，排除了固体载体对实验结果的影响。其中，固体菌肥处理的维生素C含量与全肥相比，相差不大。

2、对马铃薯还原糖含量的影响

采用3,5 -二硝基水杨酸比色法^[66]，每处理重复3次。

称取样品100 g，加85%乙醇100 mL，在榨汁机中捣碎，置烧杯中，80℃水浴中提取20 min，期间摇动数次。以12000 r/min 离心10 min，上清液备用。将待测液稀释至测定范围内（0-1 mg/mL），取待测液1 mL，加3,5-二硝基水杨酸溶液1 mL，摇匀，置沸水中煮5 min，取出后迅速冷却，加蒸馏水至10 mL，用未加葡萄糖标准溶液的试管作为空白调零，用分光光度计在530 nm波长处测定吸光值。还原糖含量的计算公式（2-2）如下：

其中，C——还原糖或总糖提取液的浓度，mg/mL；

V——还原糖或总糖提取液的总体积，mL；

100为样品重量，g；

1000为mg换算成g的系数。

结果如图5，各处理均能降低马铃薯的还原糖含量，与CK相比，T1、T2、T3、T4处理的还原糖含量分别降低了12.98%、3.87%、12.19%、7.42%。T1和T3两微生物肥料处理与T2（全肥）处理相比，差异显著（P < 0.05），可有效地降低马铃薯的还原糖含量，有利于马铃薯商业属性的开发。

3、对马铃薯淀粉含量的影响

采用碘比色法，每处理重复3次。称粉细的马铃薯块茎干样0.1 g，放入50 mL烧杯中，向烧杯中加入2 mL蒸馏水调成糊状，然后边搅拌边加入3.2 mL浓度为60%的高氯酸，继续搅拌10 min至马铃薯粉样全部溶解，在100 mL容量瓶中定容。静置10 min，取上清液0.5mL放入带刻度的10 mL的离心管中，再依次加入3 mL蒸馏水、2 mL碘试剂，静置5 min后再定容至10 mL，用蒸馏水作对照，测OD₆₆₀吸光值。计算公式如下：

淀粉含量（%）=R/[(0.1×0.01×0.05×10⁶)×100]

其中，R——标准曲线上求出的浓度。

如图6所示，除T4处理外，其余处理均能提高马铃薯的淀粉含量含量。T1、T2、T3处理较CK相比分别增加24.74%、15%、27.65%。其中，固体微生物肥料T3处理较CK相比，差异显著（P < 0.05），可有效提高马铃薯的淀粉含量。

七、田间试验下固体微生物肥料对马铃薯经济效益的影响

通过把小区产量折算成公顷产量，来计算马铃薯的块茎产值，即马铃薯经济效益。经济效益=块茎产值-总投入，总投入包括化肥、种子、培养基原料、载体等费用。

每公顷马铃薯产量(kg)=马铃薯平均单株结薯重×株数/处理种植面积×10000

块茎产值(元 hm^-2)=块茎单价×块茎产量

其中，马铃薯单价按市售1元/kg，化肥单价：尿素2.2元/kg、磷酸二铵2.9元/kg、硫酸钾3.2元/kg计算。其他费用：酵母粉300元/kg，蛋白胨140元/kg，氯化钠16元/kg，膨润土4元/kg，稻壳炭1.2元/kg计算。

结果如表3所示，除T4外，各处理的块茎产值均高于对照。T3与T2（全肥）相比，虽没有带来更高的经济效益，但从生态方面考虑，固体微生物肥料配施化肥能有效替代15%的化肥，减少化学制品对环境的污染。且较空白对照相比，仍有7200元的增产效益，可作为生物菌肥运用到马铃薯的生产中。

表3 马铃薯经济效益

新增经济效益为处理组经济效益-对照组经济效益。缩写同表1。

综上所述，固体微生物肥料能较有效地促进马铃薯生长，提高块茎产量，改善马铃薯的营养品质。与全化肥相比，有利于农业的可持续发展，为定向利用生物肥料资源提供理论基础，推进马铃薯产业发展。

Claims

1.一种固体微生物肥料，其特征在于，由微生物菌剂50重量份和载体100重量份组成。

2.权利要求1中所述微生物菌剂中含有拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii）2亿cfu/mL，所述载体为生物炭和膨润土经过高温灭菌后1:1混合而成。

3.权利要求1中所述微生物菌剂由拜氏不动杆菌LJL-12组成，保藏号为CGMCC No.6291，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

4.权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，提供了一种制备方法：

将拜式不动杆菌LJL-12划线至LB固体培养基中，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，制备菌悬液；将菌悬液以1%的体积比接入发酵培养基，所得到的培养液即为所述微生物菌剂。

5.权利要求2中所述生物炭作为肥料的载体，提供了接种物进入土壤后生存率的可能性，释放微生物所需的营养，起到保水、保肥的作用。

6.权利要求2中所述膨润土作为肥料的载体，不仅可以改善肥料的物理性状，而且可以减少肥料在土壤中养分的损失，控制肥料中养分的释放，提高肥料的利用率。

7.权利要求1所述的固体微生物肥料，其特征在于，提供了一种制备方法：接种50 mL上述微生物菌剂LJL-12，与100 g灭菌载体充分混匀后，倒入自封袋中立即封口，用灭菌针在塑料袋的四周及中间扎若干小孔，操作均在无菌条件下进行，并在菌肥中添加2~3 mL马铃薯所需微量元素溶液。

8.权利要求1中所述的固体微生物肥料可以作为促进植物生长菌肥的应用。

9.如权利要求4所述的微生物菌剂的应用，其特征在于，所述的菌剂为促吲哚乙酸合成、促ACC脱氨酶合成、促进溶磷和固氮中菌剂的一种或几种。

10.权利要求1所述的固体微生物肥料在制备用于促进植物生长的菌肥中的应用。