CN111718866A - 一种可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌t6及其应用 - Google Patents

一种可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌t6及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物防治植物病害技术领域，具体涉及一种可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6及其应用。该可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6的保藏编号为：CCTCC No.M2019618，可用于棉花黄萎病的防治。

Description

一种可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6及其应用
技术领域
本发明属于生物防治植物病害技术领域，具体涉及一种可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6 及其应用。
背景技术
棉花是重要的纤维植物，由大丽轮枝菌侵染引起的黄萎病是棉花的主要病害之一，被称为“棉花癌症”。其病原菌存活力强，菌核在土壤中无寄主情况下可存活10多年之久，病原菌群体遗传多样性丰富，易变异等。此外，大丽轮枝菌的寄主范围极广，国外报道可危害38科660种植物，其中农作物184种，杂草153种。我国经鉴定，寄主植物至少20科80种，大田作物包括向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等作物。其中棉花是世界上分布最广、种植面积最大的经济作物之一，也是受危害最为严重的农作物之一，棉花黄萎病是是世界性的危险病害，也是中国棉花生产中的严重病害，并且由于大丽轮枝菌能形成休眠结构的微菌核，其对不良环境有较强的抵抗力，能耐 80℃高温和-30℃低温，故在极端条件下可以形成有较强保护作用的微菌核，当外界环境适合其萌发时又可以形成具有较强感病性的真菌状态。我国每年棉花黄萎病的的发病面积将近占全国种植面积的15％-20％，严重年份甚至可以达到50％之多，有些病害严重的种植区域可能会发生绝收的现象。黄萎病不但降低了棉花的产量而且也会降低棉花的纤维品质、种子产量和种子的产油量等，进而造成较为严重的经济损失。
目前，国内外对棉花黄萎病的防治主要是采用轮作倒茬、选育抗病品种、化学防治等传统手段，但防病效果都不理想，这些方法均有一定的限制和不足之处，操作性、适应性差或者效果不理想。植物病害的生物防治由于其安全、有效、低毒、残留少越来越引起人们的重视，生物防治被认为是最具有发展潜力的防治方法。芽孢杆菌作为一种生防资源，己成为近年来生防菌剂研制开发的热点。因此，利用大丽轮枝菌拮抗芽孢杆菌对黄萎病的生防研究自然成为重点和焦点问题。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种芽孢杆菌T6，以解决现有上述技术问题。
本发明的第二目的在于提供所述可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6的培养方法。
本发明的第三目的在于提供所述可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6的应用。
本发明的第四目的在于提供一种用于防治黄萎病的菌剂。
本发明的第五目的在于提供所述用于防治黄萎病的菌剂的制备方法。
本发明的目的还在于提供一种防治黄萎病的方法。
本发明的芽孢杆菌T6采用如下技术方案：一种可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌(Bacillus sp.)T6，其保藏编号为：CCTCC No.M2019618。
进一步的，所述可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6在培养过程中可产生苯乙烯。
本发明的可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6的培养方法采用如下技术方案：采用LB液体/固体培养基进行培养。
本发明的可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6的应用采用如下技术方案：所述芽孢杆菌 T6在抑制大丽轮枝菌生长中的应用。
作为进一步的优选方案，收集所述芽孢杆菌T6培养过程中产生的挥发性气体，将其用于抑制大丽轮枝菌的生长。
本发明的用于防治黄萎病的菌剂采用如下技术方案：一种用于防治黄萎病的菌剂，所述菌剂的原料或有效成分包括如上述任意一项所述的芽孢杆菌T6。
本发明的用于防治黄萎病的菌剂的制备方法采用如下技术方案：包括如下步骤：按照 1:100的比例将活化后的所述芽孢杆菌T6接种到LB液体培养基中，37℃、220r/min条件下振荡培养24h所得培养液即为所述用于防治棉花黄萎病的菌剂。
本发明的防治黄萎病的方法采用如下技术方案：一种防治黄萎病的方法，采用如上所述的菌剂浇灌植株根部。
作为进一步的优选技术方案，在植株被大丽轮枝菌侵染前，采用如上所述的菌剂浇灌植株根部。
作为进一步的优选技术方案，所述植株包括但不限于棉花。
本发明的有益效果是：本发明的芽孢杆菌T6可拮抗大丽轮枝菌，平板对峙实验中测得的其对大丽轮枝菌的抑菌率为85.71％。
本发明的芽孢杆菌T6在培养过程中会产生挥发性物质苯乙烯，苯乙烯对大丽轮枝菌有抑菌效果。
本发明的用于防治黄萎病的菌剂用于棉花盆栽中大丽轮枝菌的防治时，防治效果可达 56.48％。
本发明利用生防技术为棉花黄萎病的防治提供了微生物资源，同时同化学防治相比避免了环境污染等方面的问题。
本发明的菌种保藏日期为2019年8月9日，保藏编号：CCTCC No.M2019618。分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.T6，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路229号武汉大学，邮编430072。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的芽孢杆菌T6与大丽轮枝菌平板对峙实验结果图，左图为本发明的芽孢杆菌T6与大丽轮枝菌共培养7d的结果图，右图为仅接种有大丽轮枝菌、培养7d的结果图；
图2为本发明的芽孢杆菌T6培养过程中收集到的气体的HSSPMEGCMS谱图；
图3为实施例2中与苯乙烯共培养后的大丽轮枝菌的培养结果图；
图4为实施例2中正常生长的大丽轮枝菌结果图；
图5为本发明的芽孢杆菌T6的系统发育树；
图6为实施例4中植株正常生长状况图；
图7为实施例4中仅用大丽轮枝菌侵染的植株生长状况图；
图8为实施例4中用含有本发明的芽孢杆菌T6的菌剂对植株浇灌后，再用大丽轮枝菌侵染的植株生长状况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1本发明的可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6的分离、纯化
本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)T6从南阳师范学院实验室污染的大丽轮枝菌培养基中分离筛选得到。实验室培养的大丽轮枝菌平板被污染，真菌完全被吞噬。利用划线分离平板法，从污染的平板中分离划线到灭菌的LB固体培养基中，37℃恒温培养箱中倒置培养12h，挑取形态、大小、色泽不同的单菌落分别划线纯化，转接到LB固体培养基(对应的液体培养基再加入琼脂1.5g)中，反复纯化直至获得纯菌株。再将纯化得到的单菌落划线纯化，转接到LB液体培养基(蛋白胨1g，酵母膏0.5g，Nacl1g，加蒸馏水定容至100mL，121℃条件下灭菌20min)。中培养12h，置于4℃冰箱保存备用。
通过多次平板对峙实验确定菌株对大丽轮枝菌的拮抗活性，筛选对大丽轮枝菌拮抗性能好的菌株，即为本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)T6，菌株T6经活化培养24h后，在LB培养基上长出了大量的白色单菌落。菌落形态为圆形、白色，不透明，菌落中间有突起，表面光滑湿润，边缘整齐，革兰氏染色呈阳性，有芽孢。电子扫描电镜观察到细胞呈短杆状，细胞大小约为(0.7～1.2)μmх(2.0～3.3)μm。保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC(地址：湖北省武汉市武昌区八一路229号武汉大学校内)，保藏编号：CCTCC No.M 2019618，并对菌株进行鉴定，确定为芽孢杆菌属Bacillus sp.
平板对峙实验确定菌株对大丽轮枝菌的抑菌活性的具体方法为：取事先培养好的大丽轮枝菌用打孔器打出直径为1cm菌块，接在PDA平板中央，25℃培养箱中倒置培养5d，挑取所筛到的细菌单菌落在LB液体培养基中，25℃、220r/min培养过夜，取200μL菌液涂布在LB 平板上，37℃培养12h，用打孔器打出直径1cm的细菌菌块、LB块，在长有大丽轮枝菌平板对称等距的4个位置放置细菌菌块，放LB块的PDA平板作为对照。置于25℃培养15d，然后挑选出具有抑菌作用的菌株。对拮抗菌株进行多次培养，三次重复抑菌试验，观察并记录试验结果。测量大丽轮枝菌菌落生长直径，并按照下列公式计算抑菌率。
Figure BDA0002512645450000051
实验结果：本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)T6对大丽轮枝菌的抑菌率为85.71％。
图1中，左图为本发明的芽孢杆菌T6与大丽轮枝菌共培养7d的结果图；右图为空白对照，培养基中仅接种有大丽轮枝菌、培养7d的结果图。
实施例2
2.1将本发明的芽孢杆菌菌株T6在500ml LB液体培养培养基72h，收集锥形瓶中的气体。然后通过《“光-色-热-质-元-化”联用技术》HSSPMEGCMS顶空固相微萃取气相色谱质谱联用仪。测得T6菌株产生的挥发性气体中所含的物质。
气体样品的HSSPMEGCMS谱图见图2。由图2可知，本发明的芽孢杆菌T6在培养过程中会产生挥发性物质苯乙烯。
对图2中11-13min的图谱进行解析，结果如下表1所示：
表1
序号 时间，min 成分名称 匹配度 CAS# 相对含量，％
23 11.29 1-Dodecene 96 000112-41-4 2.425012811
24 11.602 2-Dodecene，(Z)- 96 007206-26-0 0.312783638
25 11.671 Styrene 97 000100-42-5 1.01758737
26 11.845 2-Dodecene，(Z)- 95 007206-26-0 0.338433814
27 12.122 Octacosyl trifluoroacetate 49 1000351-74-9 0.688297267
28 12.946 Heptadecane，8-methyl- 72 013287-23-5 0.979042945
2.2利用苯乙烯纯品进行验证，将直径为1cm的滤纸片放置于直径为9cm培养皿中然后加入30μL苯乙烯，然后将培养2天的大丽轮枝菌倒扣。发现大丽轮枝菌菌丝发生变化，同时菌丝变薄出现粘稠状。
与苯乙烯共培养后的大丽轮枝菌的培养结果见图3；正常生长的大丽轮枝菌结果见图4。
以上结果表明，本发明的芽孢杆菌T6培养过程中产生的苯乙烯对大丽轮枝菌有抑制作用。
实施例3
对本发明的芽孢杆菌T6的基因组DNA进行提取，并作为模板，PCR扩增菌株的16SrRNA 序列。
T6菌株16S rRNA的扩增如下：对提取到的基因组采用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rRNA的PCR扩增，其反应条件为：95℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃1min，30个循环，72℃10min，4℃Forever。50μL扩增体系如表2-1所示：
PCR扩增体系
Figure BDA0002512645450000061
并测得其16SrRNA(1446bp)的基因序列如下：
ATCTGTCGCTTAGGCGGCTAGCTCCTTACGGTTACTCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGT GGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTA GCGATTCCAGCTTCAYGYAGKCGAGTTGCAGMCTRCRATCCGAACTGAGAAYRGWTTTRTGGGATTGG CTTRACCTCGCGGTYTYGCWGCCCTTTGTWCYRTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGG GGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAA CTRAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACG AGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTG TCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTG TGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGC GTTAGCTGCAGCACTAARGGGCGGAAACCCYCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTAC CAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGC CTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTC TGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAG AAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCT GCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACT TGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAG ACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCA GTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAG CTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCA AACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGT TACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCAGTATAGCACG CGCCA
利用BLAST软件将所测得的序列与GenBank数据库中已经有的16S rRNA序列进行比对，获得相似菌株的16S rRNA序列。结合序列相似性比对结果使用MEGA 7.0软件构建系统发育树(图5)以鉴定菌株。结果表明，T6菌株位于Bacillus属独立的一个分支，有可能为新种。
实施例4将含有本发明的芽孢杆菌T6的菌剂用于防治棉花黄萎病
取出需要播种的棉花种子，去掉种子表面的棉絮，在种子的子叶端剪口(露白即可)，然后放到带有湿润脱脂棉的平皿中待其萌发。待种子萌发后，将其播种到配置好并充分浸水的土壤中，种子根部向下，种子全部埋进土壤(黄土：黑土：蛭石＝1：1：1)放在25℃的培养箱中培养。
菌株按1：100的比例转接到150mL的LB液体培养基中，37℃、220r/min条件下振荡培养24h，此时T6菌液浓度约为1.0x107CFU/mL。待棉花长出一片真叶时，用菌液浇灌棉花根部，每盆15mL，此后每隔7d浇1次菌，总共浇菌3次，对照组浇15mL的LB液体培养基，空白对照组浇30mL的LB液体培养基。
待棉花长到“两叶一心”即两片真叶时浸染大丽轮枝菌，将棉花株从原培养钵中取出(取出时把土壤丢掉，不要把根弄断)，用清水将根清洗干净，然后用剪刀在植株的根部合适的位置剪短，将植株根浸没在大丽轮枝菌的孢子悬浮液中(黄萎病菌孢子浓度在106～107CFU/mL)，浸菌1min后重新种植到营养钵中正常培养，以没有侵染大丽轮枝菌的为空白组。30d后观察记录棉花的生长发病情况，进行病害调查统计，并计算防治效果。
棉花黄萎病病级分级标准参照李社增等分为以下五级，参照如下：
0级：棉株生长正常，无病叶，叶绿，健康茁壮，为无病，病级代表值为0；
1级：已感病，有30％以下的棉花叶片变黄，开始萎焉，棉株茎部未发现异常，为轻，病级代表值为1；
2级：棉株发黄的叶子在30％～50％，根部发黄，发现须根有少量坏死，为中等，病级代表值为2；
3级：有51％～75％的叶子变黄萎焉，棉株的维管束变色坏死，外有坏死褐斑，为重，病级代表值为3；
4级：发病的叶子达75％以上，已大量落叶或叶片全部脱落，甚至全株枯死，病级代表值为4。
Figure BDA0002512645450000081
Figure BDA0002512645450000082
Figure BDA0002512645450000091
经测定，本发明的含有本发明的芽孢杆菌T6的菌剂的盆栽防治效果为56.48％(上述公式中的“对照病情指数”是指没有侵染大丽轮枝菌的对照组的实验结果)。
其中，空白对照组植株生长状况如图6所示，仅用大丽轮枝菌侵染的植株生长状况如图7 所示，用含有本发明的芽孢杆菌T6的菌剂对植株浇灌后，再用大丽轮枝菌侵染的植株生长状况如图8所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南阳师范学院
<120> 一种可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atctgtcgct taggcggcta gctccttacg gttactccac cgacttcggg tgttacaaac 60
tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 120
atccgcgatt actagcgatt ccagcttcay gyagkcgagt tgcagmctrc ratccgaact 180
gagaayrgwt ttrtgggatt ggcttracct cgcggtytyg cwgccctttg twcyrtccat 240
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 300
cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac traatgctgg caactaagat 360
caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 420
catgcaccac ctgtcactct gtcccccgaa ggggaacgct ctatctctag agttgtcaga 480
ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540
cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg 600
gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa rgggcggaaa cccyctaaca cttagcactc 660
atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc 720
ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta 780
cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt 840
tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc 900
gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc 960
tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa 1020
cggcacttgt tcttccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc 1080
ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag 1140
gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat 1200
cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa 1260
gtggtagccg aagccacctt ttatgtctga accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt 1320
agccccggtt tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc 1380
cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgactgc agtatagcac 1440
gcgcca 1446

Claims (10)

1.一种可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌(Bacillus sp.)T6，其保藏编号为：CCTCCNo.M2019618。
2.根据权利要求1所述的可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6，其特征在于，所述可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6在培养过程中可产生苯乙烯。
3.根据权利要求1或2所述的可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6的培养方法，其特征在于，采用LB液体/固体培养基进行培养。
4.根据权利要求1或2所述的可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌T6在抑制大丽轮枝菌生长中的应用。
5.根据权利要求4所述的可拮抗大丽轮枝菌的芽孢杆菌T6的应用，其特征在于，收集所述芽孢杆菌T6培养过程中产生的挥发性气体，将其用于抑制大丽轮枝菌的生长。
6.一种用于防治黄萎病的菌剂，其特征在于，所述菌剂的原料或有效成分包括如权利要求1或2所述的芽孢杆菌T6。
7.根据权利要求6所述的用于防治黄萎病的菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：按照1:100的比例将活化后的所述芽孢杆菌T6接种到LB液体培养基中，37℃、220r/min条件下振荡培养24h所得培养液即为所述用于防治棉花黄萎病的菌剂。
8.一种防治黄萎病的方法，其特征在于，采用如权利要求6所述的菌剂浇灌植株根部。
9.根据权利要求8所述的防治黄萎病的方法，其特征在于，在植株被大丽轮枝菌侵染前，采用如权利要求6所述的菌剂浇灌植株根部。
10.根据权利要求8或9所述的防治黄萎病的方法，其特征在于，所述植株包括但不限于棉花。
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