CN107217024A - 一种枯草芽孢杆菌j‑15及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌J‑15及其应用，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2017309。所述的枯草芽孢杆菌J‑15的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。枯草芽孢杆菌J‑15可导致大丽轮枝菌孢子不能萌发甚至死亡，可应用在防治棉花黄萎病中。

Description

一种枯草芽孢杆菌J-15及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌J-15及其应用。

背景技术

棉花黄萎病素有“棉花癌症”之称，1914 年在美国首次被发现之后迅速蔓延至全世界，1935年传入我国，由大丽轮枝菌 （Verticillium dahliae Kleb）侵染引起，是最具破坏性的棉花病害之一。黄萎病在世界范围都有分布，在我国所有植棉区，发病面积占我国棉田总面积的50%，重病田占70%，成为影响棉花产量和品质的主要障碍因素。

棉花黄萎病的防治主要有抗性品种培育、化学防治、物理防治三大类，各个防治方法都有一定的作用，但都存在一定的问题：利用棉花抗性品种虽然可以有效降低黄萎病的爆发程度，但目前已培育出的部分耐病品种，抗病性水平不高、抗性不够稳定，且抗性品种的抗病性与丰产性往往呈反比，从而影响棉花种植产量和质量；使用化学农药方法防治病害，虽效果较好，但会造成病原菌的耐药性，还会造成土壤、水等环境的农药污染，这一问题现在已经非常严峻；采用轮作、倒茬、深耕等物理方法，也是比较有效的防治棉花黄萎病的方法之一，但会耗费大量的劳动力和机械动力，且要掌握好轮作的时间才能有效，如果轮作时间较为有限错过即不再有效。

利用拮抗微生物防治棉花黄萎病等作物病害已成为国内外的研究热点。目前利用的微生物有木莓等真核微生物及芽孢杆菌原核类微生物。其中因对人畜无害的优势，芽孢杆菌在开发生防菌中倍受研究者关注，已有多种生防效应的优良菌种报到。但由于这些菌的拮抗活性物质不清楚，拮抗机制不明晰，广泛应用受到了限制。而且生防菌能否有效应用，还与生防菌的来源和环境适应性关系密切。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种从新疆和硕连作棉田根际土壤中分离出一株高效拮抗大丽轮枝菌的枯草芽孢杆菌J-15。经实验证明，枯草芽孢细菌J-15可导致大丽轮枝菌孢子不能萌发甚至死亡，菌丝畸形、产孢能力下降，可作为棉花黄萎病生防菌。

本发明的技术方案为：一种枯草芽孢杆菌J-15 （Bacillus subtilis J-15），该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M 2017309。所述的枯草芽孢杆菌 J-15 的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。枯草芽孢杆菌J-15，在防治棉花黄萎病中的应用。

菌种保藏说明：菌种名称：枯草芽孢菌；拉丁学名：Bacillus subtilis； 保藏编号：CCTCC No：M 2017309；保藏机构：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉 武汉大学，邮编：430072，电话：（027）68754052，传真：（027）68754833，E-mail：cctcc@whu.edu.cn；保藏日期：2017年6月7日。

本发明的有益效果：本菌株选择新疆和硕境内连作棉田为采样区，从经冬季低温自然冻封后的棉花根际土壤，分离获得对大丽轮枝菌具有高效拮抗效应的枯草芽孢杆菌J-15，并探究了抑菌特性。枯草芽孢杆菌J-15具有生长快、对酸碱及营养等条件要求低、环境适应性强和次生代谢抗菌活性物质能胞外分泌等特质，且对人畜安全、不污染环境、对植物无不良影响、不干扰其他植物病害防治措施。另外不仅能拮抗植物病原菌，且生命力强，对病原菌有稳定的抑制效果。

附图说明

附图1为枯草芽孢杆菌J-15菌液及其提取的活性物质对大丽轮枝菌的拮抗效果图，其中a为枯草芽孢杆菌J-15 无菌发酵液对大丽轮枝菌拮抗效果， b为枯草芽孢杆菌J-15菌液对大丽轮枝菌的拮抗效果；

附图2为枯草芽孢杆菌J-15 生理生化特性图表；

附图3为大丽轮枝菌在固体培养基上培养一周后，镜下菌丝的生长情况，其中b为抑菌圈附近的大丽轮枝菌，菌体短粗、弯曲，a为远离抑菌圈的大丽轮枝菌，菌丝细长、光滑，与远离抑菌圈的镜检结果相比，抑菌圈附近的孢子数量相对较少；

附图4为健康的大丽轮枝菌芽管图及其局部放大图；

附图5为大丽轮枝菌与1倍浓度枯草芽孢杆菌J-15提取活性物质共培养72小时后，大丽轮枝菌孢子的生长情况，左图为电镜下的大丽轮枝菌孢子，右图为对应的局部放大图；

附图6为枯草芽孢杆菌J-15对棉花黄萎病的防治效果对照图；其中，图6a 为只施大丽轮枝菌的对照组，图6b为施有大丽轮枝菌和J-15发酵液的棉株，图6c为相应棉株茎横切显微图；图6d为相应棉株茎横切显微图；图6e为相应棉株茎横切显微图；图6c，d及e镜检倍数为100x和1000x。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细描述本发明申请，所述实施例用于理解而不是限制本发明申请。

实施例1、从新疆和硕连作棉田根际土壤中分离出一株枯草芽孢杆菌J-15。经实验得出，J-15可导致大丽轮枝菌孢子不能萌发甚至死亡，菌丝畸形、失去产孢能力，可作为棉花黄萎病生防菌。然后在实验室中进行如下的实验测试：

1、枯草芽孢杆菌J-15发酵液对病原菌孢子萌发抑制作用：使用抑菌圈法检测菌株的抗病性，待大丽轮枝菌菌丝布满平板后测量菌株的抑菌圈大小，如图1所示，抗菌活性物质为枯草芽孢杆菌J-15胞外分泌的代谢产物，保证了抗菌活性物质易于提取。

2、枯草芽孢杆菌J-15的分离：将筛选获得的枯草芽孢杆菌株J-15划线接至牛肉膏蛋白胨平板，37℃倒置培养24h，经多次继代培养后，重复平板抑菌试验，以确保枯草芽孢杆菌J-15遗传性能的稳定性。

3、枯草芽孢杆菌J-15的常规鉴定：观察筛选获得的枯草芽孢杆菌J-15单菌落；使用革兰氏染色法和Schaeffer-Fulton氏染色法，对拮抗菌株进行菌体和芽孢染色，染色后镜检观察，根据蜡样芽胞杆菌鉴定管鉴定其生理生化特性，如图2所示。根据实验鉴定菌株J-15为革兰氏阳性菌，菌体为白色，边缘不整齐，表面有褶皱，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。

4、16S rDNA序列鉴定：并对其16s rDNA 测序，利用BLAST将测得序列与GenBank中所有已测定的原核生物的16S rDNA 序列进行比对，获得相似菌株16S rDNA 序列。结合该菌生理生化鉴定，确定为枯草芽孢杆菌。登录号为KT901818，16S rDNA 序列如SEQ ID NO.1所示，长度为1407bp。

5、枯草芽孢杆菌J-15 无菌发酵液对大丽轮枝菌菌丝形态及产孢能力有显著影响。在涂布大丽轮枝菌孢子悬液的固体培养基上打孔，在孔中加入J-15 无菌发酵液，将平板指25度培养一周后，对比远离抑菌圈和靠近抑菌圈的菌丝的生长情况。其中图3a为远离抑菌圈的大丽轮枝菌，菌丝细长、光滑、生长健康，且周围分布大量的新生孢子；图3b为抑菌圈附近的大丽轮枝菌菌丝体生长情况，其菌丝体短粗、弯曲甚至畸变，抑菌圈附近相对远离抑菌圈的位置的孢子数量极显著减少；

6、将大丽轮枝菌与1倍浓度枯草芽孢杆菌J-15提取活性物质共培养72小时后，在电镜下观察大丽轮枝菌孢子的萌发情况，孢子破裂，不能形成芽管，无法形成正常的菌丝体。

实施例2、对J-15的菌液进行盆栽防治效果实验，将土壤灭菌，每盆60g。对Vd（大丽轮枝菌）孢子悬液和J-15发酵液镜检计数。对照组（CK）：加Vd孢子悬液至终浓度为107个/g土；处理：加Vd孢子悬液和J-15发酵液至二者终浓度均达到107个/g土。每盆土均为独立浇菌搅拌混匀。棉花种子浸泡一夜后播种，25℃温室常规培养，对比CK与处理组棉花发病情况。并对各组棉株茎部进行切片观察。在实验室盆栽试验中，只混有大丽轮枝菌孢子液的对照组棉株叶脉间失绿变黄，叶片一触即掉如附图6c所示，自发病起两周内几乎所有棉株干枯死亡，从其茎部切片发现维管束细胞处填充有黄色物质如附图图6e所示；而施加J-15的棉株叶片正常如附图6d所示，J-15处理棉株长势较好；对两组棉株茎进行切片镜检发现J-15处理组维管束细胞均无异常。结果表明，在实验室盆栽试验中，菌株J-15对棉花黄萎病均具有良好的防治效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆师范大学

<120> 一种枯草芽孢杆菌J-15及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 1

aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca 60

cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg 120

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gtgggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc 960

ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc 1080

agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140

acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca 1200

aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc 1260

agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320

gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1380

cgaagtcggt gaggtaacct tttagga 1407

Claims (3)

1.一种枯草芽孢杆菌J-15 （Bacillus subtilis J-15），该菌株的保藏编号为CCTCCNO：M 2017309。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌 J-15，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌 J-15的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种权利要求1或2所示的枯草芽孢杆菌J-15，在防治棉花黄萎病中的应用。