CN109370940A - 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）的发酵方法 - Google Patents

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的发酵方法。本发明提供的短小芽孢杆菌的发酵方法包括将短小芽孢杆菌接种至pH为7‑9的培养基中，得到发酵前液；将发酵前液在发酵温度为26‑34℃和转速为170‑230rpm的条件下进行发酵培养，得到短小芽孢杆菌发酵液，实现短小芽孢杆菌的发酵；所述培养基为能用于培养短小芽孢杆菌的培养基。实验证明，本发明提供的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的发酵方法较基础发酵工艺中该菌的生物量提高了431.23％。本发明解决现有短小芽孢杆菌培养基中生物量较低的不足，为短小芽抱杆菌菌株工业化生产和获得高产菌剂提供技术支撑和理论指导。

Description

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵工艺技术领域中，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的发酵方法。
背景技术
微生物发酵受诸多因素的影响，微生物发酵的生产水平取决于生产菌的特性和发酵条件(包括培养基)，其中发酵条件对微生物发酵产物的形成有很大的影响。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，菌体细杆状，一般为0.6-0.7μm×2.0-3.0μm，呈革兰氏阳性，能产生热稳定的内生芽孢，抗逆能力强，可抑制多种病原真菌、细菌，抗菌谱广泛。可防治小麦根腐病、草莓灰霉病、黄瓜枯萎病、棉花黄萎病等。也是一种饲用微生物菌种，适用于畜类、禽类、反刍动物，也适用于鱼、虾等水产动物。国家鼓励和倡导植物病害防治要向绿色环保方向进行，微生物菌剂广泛用于生物防治，因此短小芽孢杆菌具有开发为农用菌剂的潜力，极具开发价值。但目前其存在繁殖能力有限、生长速度缓慢等问题，严重制约了短小芽孢杆菌的工业化生产及应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高发酵中短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)的生物量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)发酵方法，所述方法包括：将Bacillus pumilus接种至pH为7-9的培养基中，得到发酵前液；将所述发酵前液在发酵温度为26-34℃和转速为170-230rpm的条件下进行发酵培养，得到Bacillus pumilus发酵液，实现Bacillus pumilus的发酵；所述培养基为能用于培养Bacillus pumilus的培养基。
上述方法中，所述培养基可为基础培养基，所述基础培养基由溶质和水组成，溶剂及其在所述基础培养基中的浓度分别为葡萄糖1.5g/100mL，牛肉膏0.5g/100mL，蛋白胨1.5g/100mL，NaCl 0.5g/100mL。所述培养基的pH可为7-9。进一步，所述培养基的pH可为7-8。更进一步，所述培养基的pH可为7。
上述方法中，所述发酵培养温度可为30-34℃。进一步，所述发酵培养温度可为34℃。
上述方法中，所述将Bacillus pumilus接种至pH为7-9的培养基中包括将Bacillus pumilus的种子液接种至所述培养基中，得到所述发酵前液；所述种子液按照包括如下步骤的方法制备：将Bacillus pumilus接种至所述培养基中进行培养得到所述种子液。
上述方法中，在制备种子液时的培养温度可为30℃。在制备种子液时可在摇床转速为170rpm的条件下进行。在制备种子液时的培养时间可为24h后。
上述方法中，所述发酵前液中所述种子液的体积比可为0.5-3％。所述发酵前液中所述种子液的体积比进一步可为1-3％。更进一步，所述发酵前液中所述种子液的体积比可为2-3％，如2.17％。
上述方法中，所述发酵培养的时间可为36-42小时。进一步，所述发酵培养的时间可为41-42小时，如41.61小时。
上述方法中，所述发酵培养在容器中进行，所述发酵前液的体积与所述容器的容积比可为(80-140)：250。
进一步，所述发酵前液的体积与所述容器的容积比可为(95-110)：250，如95.46:250。
所述容器具体可为三角瓶。
上述方法中，所述转速可为170-230rpm。进一步，所述转速可为200-230rpm。更进一步，所述转速可为230rpm。
所述发酵在所述摇床中进行，所述转速为所述摇床的工作转速。
所用摇床可为上海和呈仪器制造有限公司HS-200B摇床。
所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)发酵方法在制备Bacillus pumilus菌剂中的应用，也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明提供的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的发酵方法较基础发酵工艺中该菌的生物量提高了431.23％。本发明解决现有短小芽孢杆菌培养基中生物量较低的不足，为短小芽抱杆菌菌株工业化生产和获得高产菌剂提供技术支撑和理论指导。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的发酵培养均在无菌条件下进行。
下述实施例中的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为文献(周达，乌拉尔甘草内生菌的分离、典型菌种的生物学功能及抗逆特性的研究，宁夏医科大学硕士研究生学位论文，2016)中的G5短小芽孢杆菌，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用摇床为上海和呈仪器制造有限公司HS-200B摇床。
实施例1、利用Bacillus pumilus发酵方法培养Bacillus pumilus
预实验：对筛选得到的Bacillus pumilus的发酵液进行全波长扫描，在OD275处有最大吸收峰，因此下文测定发酵液的浓度时采用波长275nm处的OD值进行测定。下文均对发酵液稀释100倍时进行比较分析。
一、发酵过程中最佳单因素的确定
1、最佳接种量
将Bacillus pumilus接种在pH为7的牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为30℃、摇床转速为170rpm的条件下培养24h后，得到种子液。下文发酵培养所用培养基均为基础培养基，基础培养基由溶质和水组成，溶剂及其在基础培养基中的浓度分别为葡萄糖1.5g/100mL，牛肉膏0.5g/100mL，蛋白胨1.5g/100mL，NaCl 0.5g/100mL，基础培养基的pH根据不同的实验需要利用HCl或NaOH进行调节。
将种子液分别按照不同接种量(即移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)接种至装有250mL pH为7的培养基的容量为250mL的三角瓶中，得到发酵前液。接种量设置为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％。接种后，将各三角瓶均置于温度为30℃、摇床转速为170rpm的条件下发酵培养24h，得到不同接种量的发酵液。测定各发酵液在275nm下的OD值，接种量为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％时的发酵液的OD275值分别为0.432、0.431、0.420、0.467、0.421、0.422、0.418、0.416、0.386、0.383。
结果显示，接种量为2.0％时的OD275值最大。
2、最佳装液量
将步骤1的种子液按照2.0％接种量接种至pH为7的培养基中得到发酵前液，将发酵前液按照不同的装液量装至容量为250mL的三角瓶中，装液量分别为50mL、80mL、110mL、140mL、170mL、200mL和230mL，即发酵前液的体积与容器的容积比分别为50/250、80/250、110/250、140/250、170/250、200/250、230/250。然后将各装有发酵前液的三角瓶分别置于温度为30℃、摇床转速为170rpm的条件下发酵培养24h，得到不同装液量的发酵液。测定各发酵液在275nm下的OD值，装液量分别为50mL、80mL、110mL、140mL、170mL、200mL和230mL时的发酵液的OD275值分别为0.133、0.125、0.156、0.153、0.126、0.126、0.103。
结果显示，250mL三角瓶中装液量为110mL时的OD275值最大。
3、最佳转速
将步骤1的种子液按照2.0％接种量接种至装有250mL pH为7的培养基的容量为250mL的三角瓶中，得到发酵前液。将发酵前液置于温度为30℃、不同摇床转速的条件下发酵培养24h，得到不同转速的发酵液。摇床转速设置为110rpm、140rpm、170rpm、200rpm、230rpm。测定各发酵液在275nm下的OD值，转速分别为110rpm、140rpm、170rpm、200rpm、230rpm时的发酵液的OD275值分别为0.259、0.208、0.252、0.328、0.326。
结果显示，转速为200rpm时的OD275值最大。
4、最佳发酵温度
将步骤1的种子液按照2.0％接种量接种至装有250mL pH为7的培养基的容量为250mL的三角瓶中，得到发酵前液。将发酵前液置于不同温度、摇床转速为170rpm的条件下发酵培养24h，得到不同温度的发酵液。温度设置为26℃、30℃、34℃、38℃、42℃。测定各发酵液在275nm下的OD值，温度分别为26℃、30℃、34℃、38℃、42℃时的发酵液的OD275值分别为0.278、0.293、0.191、0.169、0.148。
结果显示，温度为30℃时的OD275值最大。
5、最佳初始pH值
将步骤1的种子液按照2.0％接种量分别接种至不同pH的培养基中得到不同发酵起始pH的发酵前液，培养基的pH设置为3、4、5、6、7、8、9和10。培养基的pH用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。
将不同pH的发酵前液分别装至容量为250mL的三角瓶中，装液量均为250mL。然后将各装有发酵前液的三角瓶置于温度为30℃、摇床转速为170rpm的条件下发酵培养24h，得到不同发酵起始pH的发酵液。测定各发酵液在275nm下的OD值，发酵起始pH分别为3、4、5、6、7、8、9和10时的发酵液的OD275值分别为0.038、0.001、0、0.281、0.217、0.301、0.182、0。
结果显示，发酵起始pH为8时的OD275值最大。
6、最佳发酵时间
将步骤1的种子液按照2.0％接种量接种至装有250mL pH为7的培养基的容量为250mL的三角瓶中，得到发酵前液。将发酵前液置于温度为30℃、摇床转速为170rpm的条件下进行不同时间的发酵培养，得到不同发酵时间的发酵液。发酵培养时间设置为12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h和60h。测定各发酵液在275nm下的OD值，发酵时间分别为12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h和60h时的发酵液的OD275值分别为0.040、0.092、0.096、0.141、0.149、0.117、0.098、0.127、0.124。
结果显示，发酵培养36h后较其他时间的发酵液OD275值明显增加。
二、Bacillus pumilus发酵中单因素最佳组合方式的确定
根据单因素试验结果，选取发酵时间、发酵温度、初始pH、摇床转速、接种量、装液量6个因素为自变量，以发酵液OD275为响应值，对单因素实验得到的较为显著的影响因素进行RSM设计。每个试验重复3次，取其平均值，试验因素水平及相应的编码见表1。RSM方法采用“Design-Expert 8.0”软件，采用BBD模型，得到6因素3水平共54组的试验设计(表2)。将实验后的数据进行多元回归拟合，并对回归方程进行方差分析及拟合度检验，讨论模型所在响应面特征，预测响应值是否为极大值、极小值，或是鞍点。若为极值，则进行验证；若为鞍点，则进行脊岭分析，确定在何处进行实验可得到最好结果。
实验得到的数据在“Design-Expert 8.0”软件中的BBD模型对数据进行拟合和分析，通过ANOVA分析得到二次多项式，最终确定六种单因素最优发酵组合为：发酵时间为41.61h，发酵温度为34.00℃，初始pH为7.00，摇床转速为230.00rpm，接种量为2.17％，装液量为95.46mL/250mL，该组合方式下得到的OD275预测值为0.822。
所用回归分析的二次多项回归方程为：
Y＝24.80751-0.0342X1-0.38531X2-3.04681X3-0.079177X4+0.49074X5+0.019816X6+5.96875E-004X1X2+4.96042E-003X1X3+7.65278E-005X1X4+8.79167E-003X1X5-2.23681E-004X1X6+0.028787X2X3+1.35271E-003X2X4-2.28125E-004X2X5-2.94479E-004X2X6-1.52083E-003X3X4-0.034850X3X5+2.64312E-003X3X6-2.75833E-003X4X5+2.46111E-005X4X6+1.48417E-003X5X6-4.12346E-004X1 2-1.24314E-003X2 2+0.12319X3 2+1.33353E-004X4 2-0.024361X5 2-1.47832E-004X6 2。
其中，Y：OD275值；X1：发酵时间；X2：发酵温度；X3：初始pH；X4：摇床转速；X5：接种量；X6：装液量。
表1、6因素3水平试验设计
表2、响应面试验设计
三、利用最佳单因素组合方式发酵
将步骤1的种子液按照2.17％接种量接种至装有95.46mL的pH为7的培养基的容量为250mL的三角瓶中，得到发酵前液。将发酵前液置于温度为34℃、摇床转速为230rpm的条件下发酵培养41.61小时，得到发酵液，此时发酵液的OD275值为0.650。OD275值较基础发酵工艺提高了431.23％(经基础发酵工艺发酵后测得发酵液OD275值为0.122)。
其中，基础发酵工艺的步骤如下：
将步骤1的种子液按照2.0％接种量接种至装有250mL的pH为7的培养基的容量为250mL的三角瓶中，得到发酵前液。将发酵前液置于温度为30℃、摇床转速为170rpm的条件下发酵培养24h，得到发酵液，测得发酵液OD275值为0.122。

Claims (10)

1.Bacillus pumilus发酵方法，包括：将Bacillus pumilus接种至pH为7-9的培养基中，得到发酵前液；将所述发酵前液在发酵温度为26-34℃和转速为170-230rpm的条件下进行发酵培养，得到Bacillus pumilus发酵液，实现Bacillus pumilus的发酵；所述培养基为能用于培养Bacillus pumilus的培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养基为基础培养基，所述基础培养基由溶质和水组成，溶剂及其在所述基础培养基中的浓度分别为葡萄糖1.5g/100mL，牛肉膏0.5g/100mL，蛋白胨1.5g/100mL，NaCl 0.5g/100mL，所述基础培养基的pH为7-9。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述培养基的pH为a1)或a2)：
a1)7-8；
a2)7。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养温度为b1)或b2)：
b1)30-34℃；
b2)34℃。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述将Bacillus pumilus接种至pH为7-9的培养基中包括将Bacillus pumilus的种子液接种至所述培养基中，得到所述发酵前液；所述种子液按照包括如下步骤的方法制备：将Bacillus pumilus接种至所述培养基中进行培养得到所述种子液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵前液中所述种子液的体积比为f1)-f4)中的任一种：
f1)0.5-3％；
f2)1-3％；
f3)2-3％；
f4)2.17％。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的时间为c1)或c2)或c3)：
c1)36-42小时；
c2)41-42小时；
c3)41.61小时。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养在容器中进行，所述发酵前液的体积与所述容器的容积比为d1)或d2)或d3)：
d1)(80-140)：250；
d2)(95-110)：250；
d3)95.46:250。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述转速为e1)或e2)或e3)：
e1)170-230rpm；
e2)200-230rpm；
e3)230rpm。
10.权利要求1-9中任一所述的方法在制备Bacillus pumilus菌剂中的应用。
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