CN107787360B - 微生物聚生体 - Google Patents

微生物聚生体 Download PDF

Info

Publication number
CN107787360B
CN107787360B CN201680024075.0A CN201680024075A CN107787360B CN 107787360 B CN107787360 B CN 107787360B CN 201680024075 A CN201680024075 A CN 201680024075A CN 107787360 B CN107787360 B CN 107787360B
Authority
CN
China
Prior art keywords
microbial
chitin
composition
plants
soil
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680024075.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107787360A (zh
Inventor
S-Y·H·尹
K·索兹
D·R·瓦格纳
S·拉加古帕兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Emwack chemical Co.
Original Assignee
Emwack Chemical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Emwack Chemical Co filed Critical Emwack Chemical Co
Publication of CN107787360A publication Critical patent/CN107787360A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107787360B publication Critical patent/CN107787360B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/25—Paenibacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/27—Pseudomonas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F1/00—Fertilisers made from animal corpses, or parts thereof
    • C05F1/002—Fertilisers made from animal corpses, or parts thereof from fish or from fish-wastes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/20—Fertilizers of biological origin, e.g. guano or fertilizers made from animal corpses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/141—Feedstock
    • Y02P20/145—Feedstock the feedstock being materials of biological origin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/40—Bio-organic fraction processing; Production of fertilisers from the organic fraction of waste or refuse

Abstract

本文中公开用于农业或生物降解应用中的微生物聚生体和包括微生物的组合物，在一些实施方案中，使土壤、植物和/或植物部分(如种子、幼苗、芽、根部、叶、果实、茎或分枝)与所公开的微生物聚生体或包括微生物的组合物接触。可以将微生物聚生体或含微生物的组合物单独或与额外组分(如几丁质、壳聚糖、葡糖胺、氨基酸和/或液体肥料)组合施用于土壤、植物和/或植物部分，在额外实施方案中，所公开的微生物聚生体或包括微生物的组合物用于使生物材料如含几丁质的生物材料降解的方法中。

Description

微生物聚生体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年2月27日提交的美国临时申请第62/126,323号的权益，该申请通过引用全部并入本说明书中。
技术领域
本公开内容涉及微生物聚生体和使用该聚生体中所包括的微生物的方法，特别用于生物降解和农业方法和使用。
背景技术
在人口增长加快的压力下，世界食物需求量持续增加。然而，农业工人面临可供农业使用的土地量缩小，土壤耗竭和环境条件改变以及其它挑战。因此，需要研发可以增加食物产量，同时还减少潜在地有害的除草剂、杀昆虫剂和杀真菌剂使用的组合物和技术。
发明内容
本文中公开用于农业或生物降解应用中的微生物聚生体和包括微生物的组合物。在一些实施方案中，本公开内容的微生物组合物是于2014年11月25日保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))保藏号为PTA-121750(在本文中也称为A1001)的微生物聚生体或包括A1001中的一些或全部微生物的组合物。在其它实施方案中，本公开内容的组合物包括来自五种或更多种选自以下的微生物物种的微生物：芽孢杆菌(Bacillus spp.)、固氮螺菌(Azospirillumspp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)、脱硫球菌(Desulfococcus spp.)、脱硫肠状菌(Desulfotomaculum spp.)、海杆菌(Marinobacterspp.)、亚硝化侏儒菌(Nitrosopumilus spp.)、瘤胃球菌(Ruminococcus spp.)、水杆菌(Aquabacterium spp.)、细鞘丝藻(Leptolyngbya spp.)、钩端螺菌(Leptospirillumspp.)、类芽孢杆菌(Paenibacillus spp.)、微鞘藻(Microcoleus spp.)、梭菌(Clostridium spp.)、异球藻(Xenococcus spp.)、醋杆菌(Acetobacter spp.)、Candidatus spp.以及甲烷鬃毛菌(Methanosaeta spp.)。在额外实施方案中，组合物包括来自表1中所列的五种或更多种(如5、10、15、20或更多种)微生物的微生物。所公开的组合物还可以包括额外组分，包括但不限于额外微生物物种、几丁质、壳聚糖、葡糖胺和/或氨基酸中的一种或多种。
本文还公开了所公开的微生物聚生体或组合物的农业用途。在一些实施方案中，该方法(用途)包括使土壤、植物和/或植物部分(如种子、幼苗、芽、叶、茎或分枝)与所公开的微生物聚生体(如A1001)、包括来自A1001的一些或全部微生物的组合物、或包括表1中所列的五种或更多种微生物物种的组合物接触。可以将微生物聚生体或含微生物的组合物单独或与额外组分(如额外微生物、几丁质、壳聚糖、葡糖胺、氨基酸、和/或土壤补充剂或肥料，如液体肥料)组合施用于土壤、植物和/或植物部分。
在额外实施方案中，所公开的微生物聚生体或包括微生物的组合物用于降解生物材料的方法中，如含几丁质的生物材料。在一些实例中，将含几丁质的材料与微生物聚生体(如A1001)或包括表1中所列的五种或更多种微生物物种的组合物混合，并且使其发酵以产生发酵混合物。发酵混合物任选地可以被分离成固体和液体组分。发酵混合物或由其产生的组分可以与所公开的微生物聚生体或组合物组合用于农业应用，或可以用于进一步降解过程，例如在组分中产生提高水平的降解产物。
本公开的前述的和其它的特征将因以下详细描述而变得更加明显，以下详细描述参考附图进行。
附图说明
图1的示意图显示用于获得A1001微生物聚生体的例示性发酵过程。
图2的示意图显示用于用所公开的微生物聚生体或微生物组合物对含几丁质的生物材料(例示为虾废料)进行生物降解的例示性过程。
图3的示意图显示用于用所公开的微生物聚生体或微生物组合物(如A1001)对几丁质进行生物降解的例示性过程。
图4A-4G的图显示用微生物组合物(图4A-4C和4E)、HYTb(图4D和4F)或处于水分胁迫(water stress)条件下的微生物组合物(图4G)处理玉米对产量的影响。
图5A-5D显示用微生物组合物(图5A-5B)或用微生物组合物加HYTb(图5C)处理小麦对产量的影响。图5D的数字图像展示用微生物组合物加HYTb处理的小麦植物根部(测试组)与对照植物的对比。
图6A-6E的一系列图显示用微生物组合物处理番茄对产量的影响。
图7的图显示用微生物组合物处理向日葵对产量的影响。
图8的图显示用微生物组合物处理水稻对产量的影响。
图9A-9B显示用微生物组合物(图9A)或用微生物组合物加HYTb(图9B)处理大豆对产量的影响。
图10的图显示用微生物组合物加HYTb处理草莓对产量的影响。
图11的图显示用微生物组合物加HYTb处理甜菜根对产量的影响。
图12A和12B的图显示用微生物组合物加HYTb在两个试验(分别为图12A和12B)中处理绿色卷心菜对产量的影响。
图13的黄瓜活力测定图显示用HYTa(A1001)处理的植物在第18天时的第一叶片面积指数。通过ANOVA分析，*p<0.001。
序列表
如37C.F.R.§1.822中所定义，使用用于核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写来展示本文中或随附序列表中所列的任何核酸和氨基酸序列。在至少一些情况下，仅展示每一个核酸序列的一条链，但应理解互补链通过参考所显示的链也包括在内。
SEQ ID NO:1和2分别是用于扩增来自A1001的16S rDNA的正向引物和反向引物。
发明详述
在自然中，土壤中微生物物种的平衡受土壤类型、土壤肥力、水分、竞争性微生物和植物影响(Lakshmanan et al.,Plant Physiol.,166:689-7002014)。微生物物种与植物之间的相互作用进一步受农业实践影响，所述农业实践可以使土壤微生物群落改良或降解(Adair et al.,Environ Microbiol Rep,5:404-413 2013；Carbonetto et al.,PLoSOne,9:e99949 2014；Ikeda et al.,Microbes Environ.,29:50-59 2014)。肥沃或高产土壤含有与耗尽营养物并且与低农作物生产力相关的土壤不同的天然微生物组成。不同微生物物种与植物密切相关，在叶际(phyllosphere)中的植物地上部分表面、在土壤根际中的根部表面处、或密切地以內生菌形式。大规模DNA分析这些微生物群(microbeassociations)已经揭示出人意料的系统发生复杂性(Rincon-Florez et al.,Diversity,5:581-612 2013；Lakshmanan et al.,Plant Physiol.,166:689-700 2014)。研究已经确定复杂微生物组可能与植物生产力、农作物产量、应激耐受性、次级代谢物积聚以及疾病抗性(Bhardwaj et al.,Microbial Cell Factories,13:66-75,2014；Vacheron et al.,Frontiers Plant Science,4:1-19 2014)相关。此外，植物可以特异性地从本地环境中选择微生物混合物，并且可以在农作物品种水平上潜在地微调微生物组(Hartmann et al.,Plant Soil,321:235-257 2009；Doornbos et al.,Agron.Sustain.Dev.,32:227-2432012；Marasco et al.,PLoS One,7:e48479 2012；Peiffer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,110:6548-6553；Bulgarelli et al.,Ann.Rev.Plant Biol.,64:807-838 2014)。
根部相关的微生物可以通过促进营养物循环和获取，通过直接植物促进作用(phytostimulation)、通过调节生物肥力、或通过病原体的生物防治而提供生长优势来促进植物和根部生长。农业上适用的种群包括植物根际促生菌(plant growth promotingrhizobacteria，PGPR)、病原体抑制细菌、菌根、固氮蓝细菌、应激耐受性内生菌、以及具有一系列生物降解能力的微生物。参与氮循环的微生物包括固氮性固氮菌属(Azotobacter)和慢生瘤菌属(Bradyrhizobium)、固氮蓝细菌、氨氧化细菌(例如亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和硝化螺菌属(Nitrospira))、亚硝酸盐氧化属(如硝化螺菌属和硝化杆菌属(Nitrobacter))以及异养反硝化细菌(例如假单胞菌属(Pseudomonas)和固氮螺菌属(Azospirillum)；Isobe and Ohte,Microbes Environ.,29:4-16 2014)。据报道在溶解和增加植物对磷的获取中有活性的细菌包括假单胞菌属、芽孢杆菌属、微球菌属(Micrococcus)以及黄杆菌属(Flavobacterium)、以及多种真菌属(Pindi et al.,J.Biofertil Biopest.,3:42012)，而芽孢杆菌属和梭菌属物种帮助钾的溶解和移动(Mohammadi et al.,J.Agric.Biol.Sci.,7:307-316 2012)。植物生长的植物促进作用以及生物和非生物胁迫的缓解是由许多细菌群或真菌群实现的，直接经由产生刺激性次级代谢物或间接通过触发低级植物防御反应(Gaiero et al.,Amer.J.Bot.,100:1738-17502013；Bhardwaj et al.,Microbial Cell Factories,13:66-76 2014)。
除在环境中的活性以外，微生物还可以在定向发酵的条件下在体外提供独特的生物降解特性。使用特定微生物混合物使几丁质和总蛋白降解可以得到新的生物活性分子，如游离L-氨基酸、L-肽、几丁质和壳聚糖，这些生物活性分子已知通过激活植物先天免疫来促进生长或提高应激耐受性(Hill et al.,PLoS One,6:e19220 2011；Tanaka et al.,Plant Signal Behav.,E22598-147 2013)。特定微生物群体可通过提供独特发酵分解产物(其本身是在生物学上对农作物有益的)加所得微生物聚生体(其可作为农业产品提供以提高农作物生产力)而用于多种任务。
如本文中所描述，已经成功地对来源于肥沃土壤和海洋来源的好氧和/或厌氧微生物的聚生体进行共发酵和稳定化，从而对农作物提供直接的生长和生产益处。此等微生物混合物的酶活性已经进一步产出具有几丁质、葡糖胺、蛋白质和/或氨基酸的发酵产物。在一些实施方案中，直接提供微生物聚生体和/或组合物可以允许早期根部定殖并且促进根际或内生关系。在一些实施方案中，向植物提供微生物聚生体的益处包括以下的一个或多个：根部生长增加，根毛产生增加，根部表面积增加，植物更强壮以能够承受移植冲击(transplantation shock)，成苗(stand establishment)更快，对非生物胁迫的抗性，以及植物生产力和产量更高。复杂微生物混合物可以跨越植物物种和基因型，与微生物土壤群体相互作用以向在不同农业条件下生长的广泛农作物提供益处。
I.术语
除非另外指出，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可以见于：Krebs et al.,Lewin's Genes XI,由Jones and Bartlett Learning出版,2012(ISBN 1449659853)；Kendrew等人(编),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Publishers出版,1994(ISBN0632021829)；Robert.A.Meyers(编),MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由Wiley,John&Sons,Inc.)出版,2011(ISBN8126531789)；以及George P.Rédei,Encyclopedic Dictionary ofGenetics,Genomics,and Proteomics,第2版,2003(ISBN:0-471-26821-6)。
提供以下术语和方法的解释以更好地描述本公开内容并指导本领域普通技术人员实践本公开内容。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种”和“所述”是指一个或超过一个。举例来说，术语“包含细胞”包括单数或复数细胞，并且被视为等效于“包含至少一个细胞”。如本文中所使用，“包含”意味着“包括”。因此，“包含A或B”意味着“包括A、B、或A和B”，而不排除额外元素。本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都出于所有目的通过引用全部并入。如果发生冲突，将以本说明书(包括术语的解释)为准。
尽管类似于或等效于本文中所描述的那些方法和材料可以用于实践或测试所公开的技术，但下文描述合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的并且并不是限制性的。
为了便于浏览本公开内容的各种实施方案，提供特定术语的以下解释：
水生动物：在盐水或淡水中生存的动物。在本文中所公开的具体实施方案中，水生动物包括水生节肢动物，如虾、磷虾、桡足动物、藤壶、蟹、龙虾以及螯虾。在其它实施方案中，水生动物包括鱼类。水生动物副产物包括水生动物的任何部分，特别是由对水生动物进行商业加工而产生的部分。因此，在一些实例中，水生动物副产物包括以下的一种或多种：虾头胸部或外骨骼、蟹或龙虾外骨骼、或鱼皮或鱼鳞。
接触：直接物理性联系的放置，包括固体和液体形式两者。举例来说，接触可以在一种或多种微生物(如微生物聚生体中的微生物)和溶液中的生物样品发生。接触还可以在一种或多种微生物(如微生物聚生体中的微生物)和土壤、植物和/或植物部分(如叶、茎、幼苗、根部和/或种子)发生。
培养：一种或多种生物体或细胞在可同化的碳、氮和矿物盐来源存在下有意生长。例如，此类生长可以发生在固体或半固体营养培养基中，或在营养物溶解于或悬浮于其中的液体培养基中。在另一个实例中，培养可以发生在表面上或通过浸没培养。营养培养基可以由复杂营养物组成，或可以是化学成分明确的。
发酵：引起复杂有机化合物分解成更简单化合物的过程，例如通过微生物细胞(如细菌和/或真菌)进行。发酵过程可以在好氧条件、厌氧条件或两者下进行(例如，在其中一些部分是好氧并且其它部分厌氧的大体积中)。在一些非限制性实施方案中，发酵包括酶促和/或非酶促分解存在于水生动物或动物副产品中的化合物(如几丁质)。
液体肥料：含有可溶性氮的水溶液或悬浮液。在一些实例中，液体肥料中的可溶性氮包括有机氮源，如尿素，或衍生自无水氨的尿素(如尿素和硝酸铵的溶液(UAN))。也可以使用氨水(20％-32％无水氨)。在其它实例中，液体肥料中的可溶性氮包括含氮无机盐，如氢氧化铵、硝酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、硫代硫酸铵或其中两种或更多种的组合。在一些实施方案中，液体肥料包括非天然存在的氮源(如焦磷酸铵或硫代硫酸铵)和/或其它非天然存在的组分。
常见液体非天然肥料掺混物(blend)由其氮-磷酸-钾含量(N-P-K百分比)指定，且包括添加其它组分，如硫或锌。人造掺混物的实例包括10-34-0、具有2％硫和0.25％锌(螯合)的10-30-0、11-37-0、具有3％硫的12-30-0、2-4-12、2-6-12、4-10-10、3-18-6、7-22-5、8-25-3、15-15-3、具有2％硫的17-17-0、18-18-0、具有2％硫的18-18-0、28-0-0UAN、具有2％硫和硫代硫酸钾的9-27-0。
微生物：微小生物体，包括但不限于细菌、古细菌、真菌和藻类(如微藻)。在一些实例中，微生物是单细胞生物体(例如细菌、蓝细菌、一些真菌或一些藻类)。在其它实例中，术语微生物包括多细胞生物体，如某些真菌或藻类(例如多细胞丝状真菌或多细胞藻类)。
微生物组合物：包括至少一种微生物(或至少一种微生物群)的组合物(其可以是固体、液体或至少部分地两者)。在一些实例中，微生物组合物是处于液体培养基(如储存、培养或发酵培养基)中的一种或多种微生物(或一种或多种微生物群)，例如于液体培养基中的悬浮液。在其它实例中，微生物组合物是于固体或胶状培养基(包括但不限于培养板)表面上或嵌入于其中的一种或多种微生物(或一种或多种微生物群)。
微生物聚生体：两种或更多种微生物物种的混合物、联合物(association)或聚集物(assemblage)，其在一些情况下彼此物理接触。聚生体中的微生物可以通过直接物理接触或经由生化相互作用或两者而彼此影响。举例来说，聚生体中的微生物可以彼此交换营养物、代谢物或气体。因此，在一些实例中，聚生体中的至少一些微生物可以是代谢上相互依赖的。此类相互依赖的相互作用的特征和程度可能随时间和随培养条件改变而变化。
II.微生物聚生体和组合物
本文公开若干种微生物聚生体。本公开内容的例示性微生物聚生体于2014年11月25日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)并且指定保藏号PTA-121750(在本文中称为A1001)。如由微阵列分析和/或16S rDNA测序所鉴定，A1001聚生体包括芽孢杆菌、固氮螺菌、假单胞菌、乳杆菌、脱硫球菌、脱硫肠状菌、海杆菌、亚硝化侏儒菌、瘤胃球菌、水杆菌、细鞘丝藻、钩端螺菌、类芽孢杆菌、微鞘藻、梭菌、异球藻、醋杆菌、Candidatus spp.、甲烷鬃毛菌、类芽孢杆菌以及短小芽孢杆菌(Brevibacillus spp.)。本文中还公开了包括A1001中两种或更多种(如2种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、20种或更多种或50种或更多种)或全部微生物的聚生体或微生物组合物。在一些实施方案中，本文中所公开的微生物组合物是确定的组合物，例如包括指定的微生物物种以及任选地包括额外非微生物组分(包括但不限于盐、微量元素、几丁质、壳聚糖、葡糖胺和/或氨基酸)的组合物。
如下文所论述，存在于A1001中的至少一些微生物的鉴定使用微阵列分析(实施例3)和/或16S rDNA测序(实施例4)来确定。用于鉴定存在于微生物混合物或聚生体中的微生物的额外技术是本领域普通技术人员公知的，包括测序或PCR分析核酸，如来自于聚生体或混合物内生长的单微生物菌落的16S rDNA。用于鉴定存在于微生物混合物或聚生体中的微生物的额外技术还包括1)基于核酸的方法，其是基于对微生物DNA的分析和区分(如核酸的DNA微阵列分析，宏基因组学或原位杂交联合荧光激活细胞分选(FACS))，2)依赖于分离和鉴定一系列生物分子的生化方法，包括脂肪酸甲酯分析(FAME)、基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析或通过高效液相色谱进行的细胞霉菌酸分析(MYCO-LCS)，和3)依赖于传统工具的微生物学方法(如选择性生长和显微镜检查)以提供整体群体的更广泛特征，和/或缩小并鉴定该群体成员的小子集。
在一些实例中，分离混合物或聚生体中的微生物(例如使用物理尺寸和/或细胞分选技术)，后接对所得微生物(或微生物的亚组或亚群)的深度DNA或全基因组测序。由于所选分析技术的敏感性和特异性的差异，使用不同微阵列或使用其它鉴定技术与本文中所描述对A1001进行的微阵列分析相比可能鉴定存在不同微生物(更多，更少或不同微生物分类群或物种)。另外，各种技术(包括微阵列分析或PCR DNA分析)可能不能检测特定微生物(即使其存在于样品中)，举例来说，如果能够检测特定微生物的探针未包括在该分析中。另外，本领域普通技术人员将意识到，微生物分类和命名可以随时间变化并且导致微生物的重分类和/或重命名。
在其它实施方案中，所公开的微生物聚生体或组合物包括表1中所列的微生物的2种或更多种(如5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、20种或更多种、或全部)，基本上由表1中所列的微生物的2种或更多种(如5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、20种或更多种、或全部)组成，或由表1中所列的微生物的2种或更多种(如5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、20种或更多种、或全部)组成。
表1.微生物
Figure BDA0001445181850000091
Figure BDA0001445181850000101
聚生体或组合物可以任选地包括一种或多种额外微生物。额外微生物包括但不限于以下的一种或多种：异常球菌(Deinococcus spp.)、酸体(Acidisoma spp.)、固氮菌(Azotobacter spp.)(例如棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii))、密螺旋体(Treponemaspp.)(例如原始密螺旋体(Treponema primitia))、根瘤菌(Rhizobium spp.)(例如日本根瘤菌(Rhizobium japonicum))、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium spp.)、红育菌(Rhodoferaxspp.)、盐棍菌(Halorhabdus spp.)、噬细胞菌(Cytophaga spp.)、放线菌(Actinomycesspp.)、德沃斯氏菌(Devosia spp.)、微球菌(Micrococcus spp.)(例如滕黄微球菌(Micrococcus luteus))、链霉菌(Streptomyces spp.)、链球菌(Streptococcus spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)、硝化杆菌(Nitrobacter spp.)、亚硝化单胞菌(Nitrosomonasspp.)、硝化球菌(Nitrococcus spp.)、变形杆菌(Proteus spp.)(例如普通变形杆菌(Proteus vulgaris))、木霉菌(Trichoderma spp.)(例如哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum))、片球菌(Pediococcus spp.)(例如戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus))、短杆菌(Brevibacterium spp.)、酵母菌(Saccharomyces spp.)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、青霉菌(Penicillium spp)(例如娄格法尔特氏青霉菌(Penicillium roqueforti))、红曲霉(Monascus)(例如红色红曲霉(Monascus ruber))、曲霉菌(Aspergillus spp.)(例如米曲霉菌(Aspergillus oryzae))、节旋藻(Arthrospiraspp.)(例如钝顶节旋藻(Arthrospira platensis))以及褐藻(Ascophyllum spp))(例如泡叶藻(Ascophyllum nodosum))。合适的额外微生物可以由本领域的技术人员来鉴定，例如基于包括于聚生体或组合物中所需的特征。
所公开的微生物聚生体或组合物除所述微生物以外可以包括一种或多种其它组分，包括但不限于盐、金属离子和/或缓冲剂(例如KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、MgSO4、FeCl3、NaMoO4和/或Na2MoO4中的一种或多种)、微量元素(如硫、硫酸盐、亚硫酸盐、铜或硒)、维生素(如维生素B族或维生素K)、糖(如蔗糖、葡萄糖或果糖)、几丁质、壳聚糖、葡糖胺、蛋白质和/或氨基酸。也可以包括于组合物中的额外组分包括HYTb、HYTc和/或HYTd，一种或多种肥料(例如液体肥料)、一种或多种杀虫剂、一种或多种杀真菌剂、一种或多种除草剂、一种或多种杀昆虫剂、一种或多种植物激素、一种或多种植物诱导剂或这些组分中两种或更多种的组合。
在一些实施方案中，微生物聚生体或包括本文中所描述的微生物聚生体中的五种或更多种微生物物种的组合物处于液体培养基(如培养或发酵培养基)或接种物中。在其它实施方案中，微生物聚生体或包括表1中所列五种或更多种微生物物种的组合物存在于含有或支持该微生物的固体或胶状培养基(如培养板)上。
在其它实施方案中，微生物聚生体或包括五种或更多种微生物物种的组合物以干燥制剂形式存在，如干粉、丸剂或颗粒。干燥制剂可以通过向溶液中的微生物组合物添加所需比例的渗透保护剂(如糖，例如海藻糖和/或麦芽糊精)来制备。将此溶液与干燥载体或吸收剂(如木粉或粘土)以所需微生物组合物浓度(如2％-30％，例如2.5％-10％、5％-15％、7.5％-20％或15％-30％)组合。颗粒可以通过掺入用以将颗粒固定在一起或提供特定物理或降解特性的粘土或聚合物粘合剂来产生。颗粒可以使用旋转造粒、混合造粒或挤压作为几种可能方法来形成。用于制备包括一种或多种微生物物种的干燥制剂的额外方法是本领域普通技术人员公知的，例如如Formulation of Microbial Biopesticides:BeneficialMicroorganisms,Nematodes and Seed Treatments,Burges编,Springer Science,1998；Bashan,Biotechnol.Adv.16:729-770,1998；Ratul et al.,Int.Res,J.Pharm.4:90-95,2013中所描述。
在一些实例中，包括微生物或微生物聚生体的组合物可以维持在支持微生物生长的温度，例如在约25℃-45℃(如约30℃-35℃、约30℃-40℃或约35℃-40℃)。在其它实例中，组合物储存在微生物不生长或无活性的温度，如低于25℃(例如4℃、-20℃、-40℃、-70℃或更低)。本领域技术人员可以配制用于冷藏的组合物，例如通过包括稳定剂(如甘油)。在再另外的实例中，组合物储存在环境温度，如约0℃-35℃(例如约10℃-30℃或约15℃-25℃)。
III.生物降解过程
所公开的微生物聚生体或组合物可以用于降解生物材料，如富含几丁质的材料，例如水生动物或水生动物副产物、昆虫或真菌。因此，在一些实施方案中，本文中公开以下方法，其包括将所公开的微生物聚生体或组合物的一种或多种与含几丁质的生物材料混合以形成混合物，和使所述混合物发酵。在一些实施方案中，所述方法还包括将混合物分离成固体组分、水性组分和任选地分离成脂质组分(图2)。
在一些实施方案中，本文中所公开的生物降解过程包括将微生物聚生体(如A1001，包括A1001中的一些或全部微生物的组合物，或包括表1中五种或更多种微生物物种的组合物)与一种或多种含几丁质的生物材料混合。含几丁质的生物材料包括但不限于水生动物或水生动物副产物、昆虫或真菌。在一些实例中，含几丁质的生物材料是水生动物，如水生节肢动物(例如软甲纲的成员)。用于所公开的方法中的水生节肢动物包括虾、蟹、龙虾、螯虾或磷虾。在一些实例中，在本文中所公开的生物降解方法中使用整个水生动物(如水生节肢动物)或水生动物副产物。水生动物副产物包括水生动物的任何部分，如通过加工所述水生动物产生的任何部分。在一些实例中，水生动物副产物是水生动物外骨骼的全部或一部分，如虾、蟹、螯虾或龙虾外壳。在其它实例中，水生动物副产物是水生动物的一部分，例如虾头胸部。
在其它实例中，含几丁质的生物材料包括真菌，如来自接合菌门、担子菌门、子囊菌门或半知菌门的真菌。具体例示性真菌包括曲霉菌、青霉菌、木霉菌、酵母菌以及裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp.)。因此，烘炉、酿酒器皿和蒸馏器的废料流可以提供含几丁质的生物材料的来源。在另外的实例中，含几丁质的生物材料包括在其外骨骼中含有几丁质的昆虫，如蚱蜢、蟋蟀、甲虫以及其它昆虫。也涵盖加工此类昆虫的副产物作为几丁质来源。
将含几丁质的生物材料与包括上文章节II中所描述微生物的组合物(如微生物聚生体A1001或其它聚生体或章节II中所描述的组合物)混合以形成基本上均质的混合物。在一些实例中，在与本文中所描述的微生物或微生物聚生体混合之前，研磨、压碎、剁碎、磨碎或以其它方式分散含几丁质的生物材料。在具体实例中，混合物在接种物中含有约10-50％(如约10％-20％、约20％-30％、约30％-40％、约25-40％，例如约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％)含几丁质的材料(如虾头)(重量/体积)，该接种物含有约0.1％-5％(如约0.1％-1％、约0.5％-2％、约1％-2％、约2％-3％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.5％、约0.8％、约1％、约1.25％、约1.5％、约1.75％、约2％、约2.5％、约3％、约4％或约5％)微生物(体积/体积)。
在一些实例中，将接种物、含几丁质的生物材料和糖(或其它碳源)混合在一起，例如通过搅拌或搅动进行。在其它实例中，在与含几丁质的生物材料混合和发酵之前，任选地使微生物组合物或聚生体中的一种或多种微生物活化。活化不是本文中所公开的方法必需的。取决于微生物在发酵之前是否被活化，本领域技术人员可以对发酵的时间和/或温度进行调节。微生物组合物的活化可以是通过将微生物接种物与碳源(如糖，例如葡萄糖、蔗糖、果糖或其它糖)在使微生物生长的温度下孵育足以使微生物生长的时间段。在一些实例中，微生物的接种物(如本文中所描述的微生物聚生体或组合物)在液体培养基中的浓度为约0.05％-5％体积/体积(例如约0.5％-5％、约0.5％-2％、约1％-2％或约2％-3％)。将接种物用含有约0.1％-1％糖(例如约0.1％-0.5％、约0.1％-0.3％、约0.2％-0.6％或约0.5％-1％，如约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1％)的溶液稀释，并且在环境温度例如约20℃-40℃(如约20℃、约25℃、约30℃、约35℃或约40℃)孵育约1-5天(如约24小时、约48小时、约72小时、约96小时或约120小时)。在其它实例中，微生物组合物的活化可以通过将微生物的接种物在使微生物生长的温度孵育足以使微生物生长的时间段，例如在约20℃-40℃(如约25℃-35℃)孵育12小时到5天(如1-4天或2-3天)来活化。在一些非限制性实例中，当培养物达到在600nm的光密度>0.005时，认为微生物被活化。
在将含几丁质的生物材料和微生物或微生物聚生体(其任选地被活化)混合之后，使混合物发酵。在一些实例中，在发酵之前测量混合物的pH。必要时，在发酵之前，将pH调节到所选范围(例如，pH约3到约4或约3.5到4)。将混合物在约20℃-40℃(例如约30℃-36℃，如约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或约40℃)的温度孵育约1-30天(如约3-28天、约7-21天、约3、5、7、10、14、16、20、24、28或30天)。定期搅动混合物(例如非连续搅动)。在一些实例中，每1-7天搅动混合物一段时间，例如每1、2、3、4、5、6或7天。在一些非限制性实例中，发酵继续直到可滴定酸度(TTA)是约3％-5％并且pH是约4-5。
在发酵后，将所得发酵混合物分离成至少固体和液体组分。在一些实例中，使发酵从罐传送到沉淀设备。随后对液体进行倾析和离心。在一个非限制性实例中，对发酵混合物在约5℃以1250rpm(930×g)离心15分钟以获得液体和脂质(例如色素)组分。可以将获自生物降解过程的液体(或水相)组分储存在环境温度。在一些非限制性实例中，向液体组分中添加糖，例如以1-10％体积/体积添加。
液体组分可以包括成分如蛋白质、氨基酸、葡糖胺、微量元素(如钙、镁、锌、铜、铁和/或锰)和/或酶(如乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶和/或几丁质酶)。在一些非限制性实例中，液体组分含有(重量/体积)约1％-5％总氨基酸、约3％-7％蛋白质、约0.1％-2％氮、少于约0.2％磷、约0.5％-1％钾、约4％-8％碳、约0.2％-1％钙、少于约0.2％镁、少于约0.2％钠和/或约0.1％-0.4％硫。在额外非限制性实例中，液体组分包括约0.01％-0.2％葡糖胺(例如约0.1％或更少)。液体组分还可以含有一种或多种微生物(例如来自用于启动发酵过程的接种物)和/或痕量的壳聚糖或几丁质。在一些实例中，液体组分在本文中称为“HYTb”。
获自生物降解过程的固体组分含有几丁质(例如约50％-70％或约50％-60％几丁质)。固体组分还可以含有一种或多种微量元素(如钙、镁、锌、铜、铁和/或锰)、蛋白质或氨基酸、和/或一种或多种来自用于启动发酵过程的接种物的微生物。在一些实例中，固体组分在本文中称为“HYTc”。HYTc任选地被微粉化以形成微粉化几丁质和残余几丁质。在一些非限制性实例中，固体组分含有(重量/体积)约9％-35％总氨基酸、约30％-50％粗蛋白质、约5％-10％氮、约0.3％-1％磷、少于约0.3％钾、约35％-55％碳、约0.5％-2％钙、少于约0.1％镁、约0.1％-0.4％钠和/或约0.2％-0.5％硫。
在一些实例中，还使脂质组分与固体和液体组分分离。脂质组分是液体组分的上相。脂质组分含有如固醇、维生素A和/或维生素E、脂肪酸(如DHA和/或EHA)的化合物，并且在一些实例中，含有类胡萝卜素色素(例如虾青素)。脂质组分可以用于多种目的，包括但不限于生产化妆品或营养产品。
在额外实施方案中，使几丁质与微生物聚生体(如A1001或A1001中的一些或全部微生物)或含有表1中五种或更多种微生物物种的组合物一起发酵。在一些实例中，将几丁质(如HYTc，或如上文所描述产生的微粉化和/或残余几丁质)与微生物聚生体或含有本文中所描述的微生物的组合物以及蛋白质水解产物(例如HYTb)混合，并且使其发酵以形成发酵混合物。由于发酵，起始混合物中的至少一部分几丁质被消化。在一些实例中，将混合物在约20℃-40℃(例如约30℃-35℃，如约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或约40℃)的温度孵育约1到30天(如约2-28天、约4-24天、约16-30天、约10-20天或约12-24天)。在一些实例中，定期搅动混合物(例如非连续搅动)。在其它实例中，连续地搅动混合物。在一个非限制性实例中，每日搅动混合物约1-12小时(如约2-8小时或约4-10小时)。可以定期监测发酵混合物的pH。在一些实例中，pH任选地维持在约4-5。在一些实例中，发酵继续直到总可滴定酸度(TTA)是至少约1％-10％(如约2％-8％、约4％-8％或约5％-10％)。
在发酵后，将所得发酵混合物分离成至少固体和液体组分，例如通过倾析、过滤和/或离心。在一些实例中，由HYTb和几丁质与微生物组合物一起发酵产生的液体组分在本文中称为“HYTd”。在一些非限制性实例中，液体组分含有(重量/体积)约0.5％-2％总氨基酸、约3％-7％蛋白质、约0.5％-1％氮、少于约0.1％磷、约0.4％-1％钾、约3％-7％碳、少于约0.5％钙、少于约0.1％镁、少于约0.3％钠和/或约少于约0.3％硫。另外，HYTd含有少于约50％几丁质(如少于约45％、少于约40％、少于约35％或少于约30％几丁质)和少于2％葡糖胺(如少于约1.5％或少于约1％葡糖胺)。在其它实例中，HYTd含有约25％-50％几丁质和约0.5％-2％葡糖胺。
IV.用于处理土壤、植物和/或种子的方法
所公开的微生物聚生体、含有微生物的组合物和/或本文中所公开的产物(如HYTb、HYTc和/或HYTd)可以用于处理土壤、植物或植物部分(如根、茎、叶、种子或幼苗)。在一些实例中，用微生物聚生体、含有微生物的组合物和/或产品处理促进植物生长、改良应激耐受性和/或增加农作物产量。
在一些实施方案中，该方法包括使土壤、植物(如植物叶、茎、根、幼苗或其它植物部分)或种子与聚生体(如A1001)或包括存在于一种或多种所公开的微生物聚生体或组合物中的微生物的组合物接触。该方法还可以包括使经过处理的植物、植物部分或种子生长，和/或在经过处理的土壤中培育植物、植物部分或种子。
在施用之前任选地使微生物活化。在一些实例中，微生物的活化如上文章节III中所描述。在其它实例中，微生物通过混合100份水和1份微生物聚生体或组合物并且在约15℃-40℃(如约20℃-40℃、约15℃-30℃或约25℃-35℃)孵育约12小时-14天(如约1-14天、3-10天、3-5天或5-7天)活化。如果微生物聚生体或组合物待与HYTb组合施用，那么活化混合物任选地还可以包括1份HYTb。
在其它实施方案中，该方法包括使土壤、植物(或植物部分)或种子与所公开的微生物聚生体或组合物的产物(如HYTb、HYTc、HYTd或其组合)接触。在再另外的实施方案中，该方法包括使土壤、植物或种子与所公开的微生物聚生体或包括所公开微生物的组合物以及HYTb、HYTc和HYTd中的一种或多种(如HYTb、HYTc和HYTd中的一种、两种或全部)接触。HYTb、HYTc和/或HYTd可以分开地施用于土壤、植物(或植物部分)和/或种子，例如与所公开的微生物聚生体或含有微生物的组合物依序、同时或基本上同时施用。
在一些实例中，该方法进一步包括使土壤、植物(或植物部分)或种子与一种或多种额外组分接触，该额外组分包括但不限于几丁质、壳聚糖、葡糖胺、蛋白质、氨基酸、液体肥料、一种或多种杀虫剂、一种或多种杀真菌剂、一种或多种除草剂、一种或多种杀昆虫剂、一种或多种植物激素、一种或多种植物诱导剂或其中两种或更多种的组合。额外组分可以包括于本文中所公开的包括微生物的组合物或微生物聚生体中，或可以分开地施用于土壤、植物(或植物部分)和/或种子，例如与所公开的微生物聚生体或含有微生物的组合物依序、同时或基本上同时施用。
在具体实施方案中，将微生物聚生体或组合物与液体肥料(例如含有可溶性氮的水溶液或悬浮液)组合。在一些实例中，液体肥料包括有机氮源，如尿素；或含氮无机盐，如氢氧化铵、硝酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、硫代硫酸铵或其组合。氨水(20-24.6％无水氨)也可以用作可溶性氮。在一些实例中，在即将使用之前或在使用之前短时内(如在使用之前10分钟到24小时内，例如在使用之前约30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时或24小时内)将微生物聚生体或组合物与液体肥料组合(例如与液体肥料混合)。在其它实例中，在使用之前至少24小时(如在使用之前24小时到6个月，例如至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少一周、至少两周、至少四周、至少八周或至少12周)时将微生物聚生体或组合物与液体肥料组合(例如与液体肥料混合)。
在一些实例中，计算待施用的组合物的量(例如每英亩或公顷)并且将组合物在水(或在一些实例中，液体肥料)中稀释到足以喷洒或灌溉待处理的区域的量(如果该组合物是液体，如微生物聚生体或组合物、HYTb或HYTd)。在其它实例中，可以将组合物与经稀释的除草剂、杀昆虫剂、杀虫剂或植物生长调控化学品混合。如果待施用的组合物是固体(如微生物、HYTc、几丁质、葡糖胺、壳聚糖或氨基酸的干燥制剂)，那么可以向土壤、植物或植物部分直接施用该固体，或可以在使用之前使其悬浮或溶解于水(或其它液体)中。在一些实例中，在使用之前使HYTc干燥和微粉化。
取决于种植情况和农业措施，所公开的微生物组合物(单独或与本文中所公开的其它组分(如HYTb、HYTc和/或HYTd)组合)可以在植物的不同发育阶段通过多种方式提供。在一些实例中，使所公开的微生物组合物和HYTb混合并用液体肥料稀释，并且在种子播种时以每英亩各0.5比1比2升的比率施用，或替代性地单独施用。在其它实例中，使所公开的微生物组合物和HYTb混合并稀释，并且在种子播种时施用，并且还在植物生长期间多次以每英亩各0.5比1比2升的比率施用于接近根部的土壤处，或替代性地单独施用。在更进一步的实例中，对所公开的微生物组合物和HYTb进行稀释并且在幼苗或移植苗成苗时以低浓度滴灌来一起提供，以漫灌形式提供，或与营养物一起作为稀释的混合物在温室中向幼苗或成苗植物以高空喷灌或滴灌的形式分配，或替代性地单独施用。在额外实例中，将所公开的微生物组合物添加到田地的其它土壤处理剂中，如添加到杀昆虫剂处理剂中以实现简易操作。在其它实例中，如在温室中，所公开的微生物组合物和HYTb单独地或一起与液体肥料(如鱼类肥料)和其它营养物组合一起使用，并且在植物生长过程中注入到高空喷水灌溉系统或滴灌管线中。在一个温室实例中，所公开的微生物组合物和HYTb一起使用，例如对其进行稀释并且在幼苗出芽时以0.25比1升的比率用高空灌溉或滴灌施肥施用，之后在生长周期中期以0.25比1升的比率用滴灌施肥施用，并且最终在生长周期最后5-10天以0.25比1升的比率用滴灌施肥施用。
在一些实施方案中，所公开的微生物组合物或聚生体和HYTb一起或单独地(例如依序)施用以提高农作物的产量、活力、类型、品质、根部发育和应激耐受性。在其中农作物是玉米的一个特定实例中，1-2升/英亩的微生物组合物在种子播种时与液体肥料一起开沟施肥(in-furrow)添加，或在V3阶段之后在施肥期间以侧施肥形式施用，后接在V5阶段之后以叶面喷洒形式施用0.5-2升/英亩的HYTb，添加和用除草剂、叶面杀虫剂、微量营养物或肥料稀释。
在其中农作物是土豆的另一个特定实例中，对1-3升/英亩的微生物组合物进行稀释并且在块茎栽植时单独或与1-3升/英亩的HYTb一起使用；在此之后在块茎形成之前，单独(例如依序)或一起后续土壤施用微生物组合物和HYTb。在植物出苗之后，HYTb以1-2升/英亩在土豆叶面施用，其可以单独经过稀释施用或与除草剂、叶面杀虫剂、微量营养物或肥料处理剂混合施用，并且在生长季期间施用一次、两次、三次、四次或更多次。
在其中农作物是棉花的又另一个特定实例中，1-2升/英亩的微生物组合物在栽植时开沟施肥、以侧施肥形式施用、或在存在或不存在肥料的情况下2×2(距离种子侧面2英寸并且在种子下方2英寸)施用。在第一次白色棉花开花，0.5-2升/英亩的HYTb的叶面处理剂可以单独经过稀释施用或与其它营养物、除草剂或杀虫处理剂组合施用。
在其中农作物是小麦的另一个特定实例中，微生物组合物(1-2升/英亩)在冬季休眠(S4阶段)之后施用，并且HYTb以叶面施用(0.5-2升/英亩；S4到S10阶段)。
在其中农作物是甘蔗的一个实例中，一种施用方法以各自2-4升/英亩使用所公开的微生物组合物和HYTb，在甘蔗栽植期间或以侧施肥形式施用于土壤，并且叶面HYTb以1-2升/英亩与水或肥料或微量营养物混合施用。
HYTb可以在所有农作物中以叶面处理剂形式单独使用以改良性状，如植物应激耐受性、营养体活力、收获品质和产量。在其中农作物是玉米的一个实例中，HYTb可以以1/2至1升/英亩在与水或杀虫剂或除草剂混合的情况下施用一次或多次。在另一实例中，HYTb可以以叶面喷洒形式用于处理小麦，其与水或杀虫剂或除草剂混合，以1/2至1升/英亩的比率施用一次或多次。
在所有农作物中，可以在农作物成苗或栽植时将HYTc以约0.5-2千克/英亩(如约0.5千克/英亩、约1千克/英亩、约1.5千克/英亩或约2千克/英亩)的比率添加到土壤中。在其它实例中，将HYTc添加到所公开的微生物组合物和HYTb的滴灌溶液中，或在温室中添加到含有所公开的微生物组合物和HYTb的施肥应用中，如上文实例。
在额外实施方案中，HYTd(单独或与本文中所公开的微生物或其它组分组合)以约1-20升/公顷(如约1-15升/公顷、约3-10升/公顷或约3-5升/公顷)使用。在其它实例中，HYTd(单独或与本文中所公开的微生物或其它组分组合)用作种子处理剂以提高农作物产量和性能(例如约1-10L/kg种子，如约1-3L/kg、约3-5L/kg或约5-10L/kg)。替代性地，HYTd可以以约1-3升/公项用于土壤中(单独或与本文中所公开的微生物或其它组分组合)以促进植物生长，例如在胁迫条件下帮助植物保持产出。
在一些实例中，用包含所公开的微生物聚生体中微生物的组合物处理土壤、种子、植物或植物部分使植物生长(如整体植物尺寸、叶量、根数目、根直径、根长度、分蘖产生、果实产生、花粉产生或种子产生)增加至少约5％(例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约2倍、至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍或更多)。在其它实例中，与未经处理的农作物相比，所公开的方法引起农作物产量增加约10％-75％(如约20％-60％或约30％-50％)。农作物性能的其它度量包括果实品质、产量、淀粉或固体含量、糖含量或白利糖度、果实或可收获产品的存放期、可出售成品的产量或目标尺寸、果实或产品品质、草分蘖和草皮对步行的抗性、授粉作用和产果、开花、花数目、花生命期、开花品质、生根和根质量、农作物对倒伏的抗性、针对热、干旱、冷的非生物胁迫的耐受性和胁迫之后的恢复、对不良土壤的适应性、光合作用和绿化水平以及植物健康状况。为了确定产品功效，对照组包括平行进行的不添加微生物的相同农艺学操作。
所公开的方法可以与任何农作物结合使用(例如用于直接农作物处理或用于在栽植之前或之后的土壤处理)。例示性农作物包括但不限于苜蓿、扁桃、香蕉、大麦、椰菜、加拿大油菜(canola)、胡萝卜、柑橘和果树作物、玉米、棉花、黄瓜、花和观赏性植物、大蒜、葡萄、蛇麻草、园艺植物、韭葱、甜瓜、油棕、洋葱、花生和豆科植物、凤梨、白杨、松树和产木材树木、土豆、覆盆子、水稻、芝麻、高粱、大豆、南瓜、草莓、甘蔗、向日葵、番茄、草皮和草料草、西瓜、小麦以及桉树。
提供以下实施例以说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应解释为将本发明局限于所描述的具体特征或实施方案。
实施例1
微生物聚生体A1001
此实施例描述微生物聚生体A1001的产生。
A1001由原先来源于肥沃土壤的种子批次的微生物和额外微生物(如芽孢杆菌)产生(参见例如美国专利第8,748,124号，通过引用并入本说明书中)。将“种子”培养物与含有5.5％w/w乳清蛋白和1.2％w/w酸奶于水中的悬浮液(“C桶”)以及含有0.1％w/w螺旋藻和0.1％w/w海带提取物于水中的悬浮液(“A桶”)混合。在与种子培养物混合并在环境温度下培育之前3天时，单独地各自制备A桶和C桶悬浮液。以约81:9:9的比例混合种子培养物、C桶和A桶。在混合之后，将含有约70％v/v糖蜜、0.5％v/v HYTb、0.003％w/v阿拉伯胶和0.02％w/v啤酒酵母(brewer's yeast)(酿酒酵母(S.cerevisiae))的额外组分的悬浮液与种子培养物、C桶和A桶的混合物以及额外水以约16:34:50的比例混合。使混合物在环境温度(约19℃-35℃)发酵约7天。在7天之后，每隔一天对罐充气30分钟。添加额外的水(约10％以上v/v)并且在相同条件下再继续发酵约10天。添加额外的水(约4％以上v/v)并且再继续发酵约7天，此时收集样品用于分析并在ATCC保藏。随后将A1001储存在处于环境温度下的搬运箱中。
实施例2
通过铺板来分析A1001中的微生物
此实施例描述通过在好氧和厌氧条件下重复铺板来对存在于A1001中的微生物的分析。
使用经过消毒的手持型虹吸管回转泵从A1001的充气搬运箱(用不锈钢搅拌叶片以120rpm搅拌8分钟)中收集样品(50mL)。在第1天，使样品振荡(例如以2000rpm振荡60秒)以确保微生物的平均分布。在具有9.8mL无菌水的试管中，添加0.1mL A1001样品和0.1mLHYTb(10-2稀释)。在不摇动的情况下将试管在35℃孵育72小时。在72小时之后(第3天)，使试管短暂振荡并且用无菌水制备10倍连续稀释液(10-3到10-9稀释度)。
将每一稀释液铺板(100μL)在营养琼脂板(用于好氧微生物培养)和标准方法琼脂板(用于厌氧微生物培养)上，各自3个重复。将营养琼脂板在27℃培养48小时。将标准方法琼脂板在厌氧室中在35℃孵育72小时。在孵育之后，对于每一培养，选择产生少于100个菌落的稀释度。对于所选择的稀释度，对每一个重复培养板上的所有菌落进行计数并且计算菌落形成单位(CFU)/mL。A1001铺板展示出在好氧条件下有4.0×107CFU/mL并且在厌氧条件下有4.3×107CFU/mL。
实施例3
通过微阵列分析A1001中的微生物
此实施例描述对存在于A1001中的微生物的微阵列分析。
通过Second Genome(South San Francisco,CA)使用G3PhyloChipTM测定来分析A1001的样品。根据制造商说明书，使用
Figure BDA0001445181850000211
DNA分离试剂盒(Mo BioLaboratories,Inc.,Carlsbad,CA)从样品分离DNA。通过使用如下引物扩增基因使16SrRNA扩增(35个PCR循环)：简并正向引物27F.1(AGRGTTTGATCMTGGCTCAG；SEQ ID NO:1)和非简并反向引物1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT；SEQ ID NO:2)。使用固相可逆固定方法浓缩扩增产物并且使用Agilent 2100
Figure BDA0001445181850000212
通过电泳量化。向每一扩增产物中添加PhyloChip Control MixTM。扩增子是片段化的、生物素标记的，并且与PhyloChipTMG3阵列杂交，该阵列包括>110万个探针靶向约55,000个个体微生物分类群，其中每个操作分类单位(OTU)有多个探针。对阵列进行洗涤，染色，并且使用
Figure BDA0001445181850000213
扫描仪(
Figure BDA0001445181850000214
微阵列分析套件，Affymetrix)扫描。
测定大约3300亿个分子并且使用Second Genome的PhyloChip处理软件分析。一系列完美匹配(PM)和错配(MM)探针组发出荧光强度(FI)，其被捕获为图像中的像素并且以整数值收集。软件接着对背景荧光和噪音估算进行调节，并且对结果进行秩归一化。接着使用结果作为经验性探针组发现的输入。接着基于来自探针组中的所有探针中所含有8聚体(8-mer)的组合的Greengenes 16S rRNA基因数据库2013年5月版本(greengenes.lbl.gov)对探针组跟踪的经验性OTU进行分类学注解。接着通过标准分类名称或用等级分类标识符(hierarchical taxonomy identifier)来鉴定分类群。
在鉴定出包括在分析中的分类群之后，将每一分类群样品所用的值以两种不同方式填入。在第一种情况下，相对丰度度量用于对每一分类群相对于其它分类群的丰度进行分级。第二种情况使用二元度量或存在/不存在评分以确定每一分类群是否实际处于样品中。
来自微阵列分析的数据也用于选择包括在本文中所描述组合物中的微生物(如表1中和本文中其它地方所列的微生物)。按相对丰度顺序对微生物(分类群、属或种)进行分级，并且基于所需特征来选择微生物。
实施例4
通过测序分析A1001中的微生物
此实施例描述通过对16S rDNA测序来对存在于A1001中的微生物的序列分析。
从A1001的样品提取基因组DNA。通过PCR使16S rDNA扩增，并且使用MICROSEQ ID微生物鉴定系统(Applied Biosystems/Life Technologies,Grand Island,NY))测序。使用SHERLOCK DNA软件(MIDI Labs,Newark,DE))分析测序数据。鉴定纯化的分离株并且列于表2中。如果未知与最接近匹配之间的属差异％(％GD)小于该特定遗传家族内物种之间的近似平均％GD(其通常是1％)，那么指定种水平匹配。当序列不满足种水平匹配的要求，但仍在明确界定的属的分支内丛集时，指定属水平匹配(GD大于1％并且小于约3％)。
表2.通过16S rDNA测序在A1001中鉴定的微生物
Figure BDA0001445181850000221
Figure BDA0001445181850000231
实施例5
含几丁质的材料的生物降解
此实施例描述用于使用微生物聚生体A1001对含几丁质的生物材料进行生物降解的例示性方法。然而，本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于使含几丁质的生物材料成功生物降解。
虾副产物获自虾加工厂并且在密闭冷藏容器中运输。在检验原料品质之后，对虾副产物均质化以降低颗粒大小到约3-5mm。将预先活化的A1001微生物培养物(约0.2-100mL/L)和蔗糖(约5g/L)与均质化的虾副产物(约50g/L)混合并且搅动直到混合物变成均匀的。在连续搅动的情况下，将温度保持在环境温度(约19℃-35℃)并且用柠檬酸将pH调节到3.5-4.0。将混合的成分转移到经过消毒的发酵罐中(25,000L)并且在30℃-36℃发酵120小时。一天至少两次实施搅动，每次30分钟。在发酵过程期间，监测pH，并且通过用0.1NNaOH滴定来测定总可滴定酸度(TTA，％)。当TTA是约3.5％和/或pH是约4-5时，中止发酵。
将经过发酵的培养物进料到连续倾析器中。对由倾析步骤分离的固体层进行离心以去除脂质层。将经过纯化的液体(HYTb)与糖(如糖蜜，10％体积/体积)混合，接着储存在保存罐中或分配到搬运箱中。在120℃用过热空气干燥来自倾析步骤的固体材料，直到其水分含量低于8％，接着研磨到200目。将经过干燥的产物(HYTc)包装在包或袋中。
实施例6
几丁质的生物降解
此实施例描述用于使用微生物聚生体A1001对几丁质进行生物降解的例示性方法。然而，本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于使几丁质成功生物降解。
在10,000L罐中用糖(约2.5g/L)对A1001微生物培养物进行预活化，持续三天。将活化的接种物与蛋白质水解产物如HYTb(约500mL/L)和几丁质(HYTc，例如如实施例5所述产生)混合。将混合物轻轻地混合1小时以实现完全搅匀。使混合物在环境温度(例如约19℃-35℃)发酵20天，每日搅动约8小时并且监测pH(pH 4.0-5.0)。可以定期(例如每两天)收集样品，用于对葡糖胺以及任选地对壳聚糖进行量化。在发酵完全之后，经由保留300目颗粒的滤器来过滤混合物，主要是残留的几丁质。保留滤液，并且在进行产物鉴定之后装瓶。
实施例7
用微生物组合物处理原料玉米(field corn)
此实施例描述使用微生物聚生体获得增加的玉米作物产量的代表性方法。本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于增加农作物产量。
用与A1001类似的微生物组合物或用HYTb处理原料玉米表现出最终可收获产量的极大增加。施肥、培育、杂草控制和害虫防治的所有农学措施对于微生物组合物或HYTb处理的地块(测试组)和对照组(检验组)地块都是相同和并行的。
试验1评估在V2阶段施用的情况下，向典型氮侧施肥中添加微生物组合物(1升/英亩的微生物组合物；32UAN液体肥料；测试组)之后的产量与未处理的对照组(检验组)相比。在两个大规模重复带试验(总计1英亩)，测试带中的产量比平行对照带(检验组)高8％到10％(图4A)。
试验2证明了开沟施肥和在侧施肥中添加对于增加玉米产量同等有效。在1英亩带试验中，在种子栽植期间开沟施肥(1升/英亩)或在V2阶段以侧施肥形式添加(3加仑NPK液体肥料，1升微量营养物混合物)的微生物组合物处理大地块。两种施用方法都表现出与对照组相比，测试带具有约5％产量增加，约为10蒲式耳/英亩(图4B)。与未处理的对照组相比，向测试组开沟施肥10％腐殖酸/生物刺激剂的商业掺混物(Actuate)与单独微生物组合物添加一样提供相同的5％产量(图4B)。
试验3证明了添加氮稳定化产品不影响或略微提升微生物组合物在玉米中的产量提高作用，并且进一步验证开沟施肥或在侧施肥中混合提供的微生物组合物一致提升产量(图4C)。在1英亩带试验中，开沟施肥和侧施肥料处理提供相对于对照组(检验组)的3％产量升高(8蒲式耳/英亩)。Actuate的添加引起产量略微增加(4％产量升高，比对照组高9蒲式耳/英亩)。添加氮稳定化产品(Instinct或N-Kress)不造成影响(对于Instinct有适度的2.5％产量升高)或引起略微更高的产量提升(对N-Kress有4.6％产量增加，比对照组高11蒲式耳/英亩)。
试验4证明了开沟施肥的HYTb也使产量相对于对照地块升高。在20英亩试验中，向开沟施肥肥料/营养物混合物中添加HYTb(1升/英亩)与平行对照耕地面积(检验组)相比，HYTb处理的耕地提供3.5％(7蒲式耳/英亩)产量增加(图4D)。
试验5证明了当在评估重复地块设计试验时，在V6阶段以1升/英亩开沟施肥微生物组合物对玉米进行单次土壤接种，并与28％氮肥一起经由滴灌提供，这提供了相对于未经处理的对照组的五个重复地块14％产量增加(图4E)。
试验6证明了当在随机重复地块设计试验中测试时，HYTb在作为叶面处理剂单独用于玉米时，还提供了相较于未经处理的对照组9.5％产量增加。在V8阶段和VT阶段，在两次使用中叶面喷洒HYTb，每次施用1升/英亩(图4F)。
试验7还是在水分胁迫条件下进行的玉米中的随机和重复地块设计试验。在此研究中，灌溉量限制于11英寸水对比接受17英寸灌溉的恰当浇灌地块。相对于单独用肥料处理的地块(未经处理的检验组)，在阶段V6与28％氮肥一起经由滴灌提供的单次1升/英亩微生物组合物处理(处理组)产生38％产量增加。观察到用微生物组合物处理的收获增加表示潜在的高出31蒲式耳/英亩的产量(图4G)。
实施例8
用微生物组合物处理小麦
此实施例描述用于使用微生物聚生体获得小麦作物产量增加的代表性方法。本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于增加农作物产量。
用与A1001类似的微生物组合物或用HYTb处理小麦表现出最终可收获产量的极大增加。施肥、培育、杂草控制和害虫防治的所有农学措施对于微生物组合物或HYTb处理的地块(测试组)和对照组(检验组)地块都是相同和并行的。
试验1展示了通过土壤施用微生物组合物来促进的小麦产量极大增加。在此80英亩试验中，在阶段S4以1升/英亩的比率向顶施肥料中添加微生物组合物。使用微生物组合物，收获产量展现11％(10蒲式耳/英亩)产量增加(图5A)。
试验2比较了相同地理区域中的三个大型试验，总计271英亩微生物组合物处理的小麦(测试组)和354英亩平行未经处理的小麦(对照组)。相同进行所有试验，向顶施肥料混合物中添加微生物组合物(1升/英亩)并且在小麦生长阶段S4施用。相对于相同农场上的平行对照耕地，经过处理的小麦产生介于高出6％到17％到36％的产量增加范围内的更高产量，其中三个农场产量增加平均值为约16％(图5B)。
试验3评估微生物组合物和HYTb组合对小麦的处理并且发现该组合提高产量。在大型关键性试验(129英亩)中，在与正常营养程序合并的情况下，以1升/英亩的比率在栽植前施用微生物组合物，后接在小麦生长阶段S6以叶面喷洒形式关键性提供HYTb(1升/英亩)加除草剂。与未经处理的对照组(检验组)相比，经过处理的耕地产生比对照耕地高出10％的产量(14蒲式耳/英亩)(图5C)。此外，来自经过处理的地块的典型小麦植物具有比未经处理的对照组明显更多的根部(图5D)。
实施例9
用微生物组合物处理番茄
此实施例描述用于使用微生物聚生体获得番茄作物产量增加的代表性方法。本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于增加农作物产量。
用与A1001类似制备的微生物组合物处理番茄表现出最终可收获产量的极大增加。施肥、培育、杂草控制和害虫防治的所有农学措施对于微生物组合物处理的地块(测试组)和对照组(检验组)地块都是相同和并行的。
试验1评估以1升/英亩对番茄施用的微生物组合物处理，其中在移植时施用一次(在移植水中)，后接通过每三周滴灌一次来施用(四次)。10英亩测试地块与10英亩对照地块相比，经过处理的耕地面积产生比对照组高出约8％的产量(图6A)。
试验2评估通过每三周滴灌一次(五次)以1升/英亩对番茄施用的微生物组合物处理。49.6英亩测试地块与4.45英亩对照地块相比，经过处理的耕地面积产生比对照组高出约9％的产量(图6B)。
试验3评估以1升/英亩对番茄施用的微生物组合物处理，其中在移植时施用一次(在移植水中)，后接通过每三周滴灌一次来施用(三次)。15.6英亩测试地块与73.2英亩对照地块相比，经过处理的耕地面积产生比对照组高出约29％的产量(图6C)。
试验4评估通过每三周滴灌一次(四次)以1升/英亩对番茄施用的微生物组合物处理。8.7英亩测试地块与6.57英亩对照地块相比，经过处理的耕地面积产生与对照组相比减少的产量(图6D)。然而，试验受严重疾病压力(镰孢菌属(Fusarium))影响，其很可能影响试验结果。另外，此试验是相对较小的地块尺寸，并且还在处理中包括不同农作物品种。
试验5评估与肥料处理剂组合以1升/英亩对番茄施用的微生物组合物处理。一次施用是在用8-7-7移植时，后接通过每三周用UAN滴灌一次来施用(三次)。33.3英亩测试地块与16.45英亩对照地块相比，经过处理的耕地面积产生比对照组高出约5％的产量(图6E)。
实施例10
用微生物组合物处理向日葵
此实施例描述用于使用微生物聚生体获得向日葵作物产量增加的代表性方法。本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于增加农作物产量。
用与A1001类似制备的微生物组合物处理向日葵作物表现出最终可收获产量的极大增加。施肥、培育、杂草控制和害虫防治的所有农学措施对于微生物组合物处理的地块(测试组)和对照组(检验组)地块都是相同和并行的。
此试验评估在栽植后30天和60天通过滴灌以1升/英亩向向日葵施用的微生物组合物处理。93.5英亩测试地块与97.13英亩对照地块相比，经过处理的耕地面积产生比对照组高出约50％的产量(图7)。另外，处理引起出芽率增加。
实施例11
用微生物组合物处理水稻
此实施例描述用于使用微生物聚生体获得水稻作物产量增加的代表性方法。本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于增加农作物产量。
用与A1001类似制备的微生物组合物处理水稻表现出最终可收获产量的极大增加。施肥、培育、杂草控制和害虫防治的所有农学措施对于微生物组合物处理的地块(测试组)和对照组(检验组)地块都是相同和并行的。
此试验评估与氨水一起以1升/英亩向水稻施用的微生物组合物处理。61.8英亩测试地块与100.7英亩对照地块相比，经过处理的耕地面积产生比对照组高出约6％的产量(图8)。
实施例12
用微生物组合物处理大豆
此实施例描述用于使用微生物聚生体获得大豆作物产量增加的代表性方法。本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于增加农作物产量。
用与A1001类似制备的微生物组合物或用HYTb处理大豆表现出最终可收获产量的极大增加。施肥、培育、杂草控制和害虫防治的所有农学措施对于微生物组合物或HYTb处理的地块(测试组)和对照组(检验组)地块都是相同和并行的。
试验1展示通过与杀真菌剂一起施用的以1升/英亩施用HYTb促进大豆产量增加。在两个一英亩测试中，经过处理的耕地面积产生与对照组相比增加约5％的产量(图9A)。
试验2评估通过叶面和侧施肥施用以1升/英亩向大豆施用的微生物组合物处理或微生物组合物加HYTb处理。经过处理的耕地面积具有与对照组相比减少的产量(图9B)。然而，试验受较小地块尺寸与野生动物问题(鹿筑窝并且在收获之前食用豆子)组合影响。
试验3展示在通过施用0.5升/英亩HYTb与施用杀真菌剂一起叶面施肥来促进的大豆产量增加。60英亩测试地块与26.48英亩对照地块相比，经过处理的耕地面积产生与对照组相比增加约12％的产量。
实施例13
用微生物组合物处理草莓
此实施例描述用于使用微生物聚生体获得草莓作物产量增加的代表性方法。本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于增加农作物产量。
用与A1001类似制备的微生物组合物加HYTb处理草莓表现出最终可收获产量的增加。施肥、培育、杂草控制和害虫防治的所有农学措施对于处理组(测试组)地块和对照组(检验组)地块两者都是相同和并行的。
通过施用通过滴灌来施用的微生物组合物和HYTb来促进累积可出售产量的增加。在这五个独立试验中，在西班牙的韦尔瓦(Huelva)地区评估塞布丽娜(Sabrina)品种。在将小植物移植在抬高苗床(raised bed)地块中之前一周，将2L微生物组合物加4L HYTb用水稀释，并且向每公项的滴灌中添加，在栽植后第2、4和6周时进行相同施用量。在第3、5和7周时，以1升/公顷的比率添加经过稀释的微生物组合物并且以2升/公顷的比率添加经过稀释的HYTb。从第9周到收获季结束时，以各自1升/公顷的比率添加经过稀释的微生物组合物和HYTb。在所有五个试验中，处理使产量比平行的未处理的地块升高5％到11％，所有五个试验平均产量增加约8％(图10)。
实施例14
用微生物组合物处理甜菜根
此实施例描述用于使用微生物聚生体获得甜菜根作物产量增加的代表性方法。本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于增加农作物产量。
用与A1001类似制备的微生物组合物加HYTb处理甜菜根表现出最终可收获产量的增加。施肥、培育、杂草控制和害虫防治的所有农学措施对于处理组(测试组)地块和对照组(检验组)地块两者都是相同和并行的。
通过施用通过滴灌来施用的微生物组合物(2升/英亩)和HYTb(2升/英亩)和通过叶面施用来施用的HYTb(1升/英亩)促进平均收获头部重量的增加。8英亩测试地块与9英亩对照地块相比，经过处理的耕地面积产生比对照组高约2.2倍的产量(图11)。
实施例15
用微生物组合物处理绿色卷心菜
此实施例描述用于使用微生物聚生体获得绿色卷心菜作物产量增加的代表性方法。本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于增加农作物产量。
用与A1001类似制备的微生物组合物或用HYTb处理绿色卷心菜表现出最终可收获产量的极大增加。施肥、培育、杂草控制和害虫防治的所有农学措施对于微生物组合物或HYTb处理的地块(测试组)和对照组(检验组)地块是相同和并行的。
试验显示通过施用通过滴灌来施用的微生物组合物(2升/英亩)和HYTb(2升/英亩)和通过叶面施用来施用的HYTb(1升/英亩)促进的卷心菜产量增加。在两个周期中收获卷心菜，如由“首次收割”收获卷心菜头和稍晚“二次收割”卷心菜头来表示。如图12A中所示，10.9英亩测试地块与14.9英亩对照地块相比，经过处理的耕地面积产生比对照组高出约18％的产量(首次收割)和比对照组高出约31％的产量(二次收割)。如图12B中所示，3.7英亩测试地块与1.5英亩对照地块相比，经过处理的耕地面积产生比对照组高出约61％的产量(首次收割)和比对照组高出约64％的产量(二次收割)。
实施例16
用HYTd进行的种子和块茎处理
此实施例描述用于使用HYTd对种子或种块进行预处理来获得小麦和土豆作物产量增加的代表性方法。本领域的技术人员将了解，偏离这些特定方法的方法也可以用于增加农作物产量。
在栽植之前用使用与A1001类似的微生物聚生体制备的HYTd处理小麦种子或土豆种块显示最终可收获产量的增加。施肥、培育、杂草控制和害虫防治的所有农学措施对于处理组(测试组)地块和对照组(检验组)地块两者都是相同和并行的。
对于小麦，在HYTd的稀悬浮液中处理种子，该悬浮液以每千克种子3mL HYTd水溶液的比率进行稀释。在包衣种子并使其风干之后，种植经过处理的种子并且将其与未经处理的种子的相同地块相比。一英亩平行田间地块显示小麦收获产量的约22％增加(表3)。
土豆种子处理通过用水稀释HYTd并且以每千克种子1mL的比率处理土豆种子来进行。在风干之后，将经过处理的土豆种子与未经处理的对照种子在1200米重复地块中平行种植。HYTd处理的土豆种子在两个独立试验中使土豆产量增加32％到35％(表4)。
表3.来自HYTd处理的小麦种子的产量
Figure BDA0001445181850000311
表4.来自HYTd处理的土豆种子的产量
Figure BDA0001445181850000312
Figure BDA0001445181850000321
实施例17
土豆增加的应激耐受性
此实施例描述用于在于胁迫田地条件下生长期间通过用与A1001类似的微生物组合物和HYTb处理来获得土豆块茎品质增加的代表性方法。
在重复地块试验(四个重复)中并且在经过处理(在栽植时以每英亩各自1L开沟施肥微生物组合物加HYTb，后接在栽植之后55天时及85天时以1升/英亩两次叶面喷洒施用HYTb)或未经处理(对照组)的情况下使褐色布尔班克(Russet Burbank)品种土豆在常规条件下生长。褐色布尔班克品种在水、热或营养物胁迫下易于降低品质。在此试验中，微生物组合物和HYTb处理提高了对称为空心病的胁迫诱导品质缺陷的耐受性。与具有8.35％空心病缺陷的对照组相比，用微生物组合物处理的地块中所收获块茎具有空心病的发生率为1.68％(表5)。
表5.土豆空心病品质缺陷
处理 产量(kg/英亩) 空心病百分比
未经处理组(对照组) 32,181 8.35％
微生物组合物加HYTb 32,636 1.68％*
与未经处理组相比，*p<0.01
实施例18
黄瓜活力测定
基于植物的快速功能测定可以用于快速评估植物对新微生物组合物的反应。使用黄瓜活力和植物生长测定，此实施例证明A1001提高植物叶片生长和扩展的速率。
在于营养物浸泡的发芽卷纸中(rolled germination paper)使黄瓜幼苗预发芽四天之后，用经过稀释的液体肥料和微生物聚生体混合物处理经过分期和同步的植物。将小植物移植到所制备的用肥料和测试剂溶液预处理的无土生长培养基中。微生物组合物A1001在营养肥料培养基中以1:2000稀释。作为对照处理，与添加等量水的营养培养基相比较。将在花盆中生长的每一处理的至少16个植物(包括对照组植物)随机分到浅苗床上，并且在控制温度和光的确定生长条件下生长。在18天之后，测量每一植物的第一片真叶片的叶片面积指数(LAI)。还记录植物总湿重。通过One-way ANOVA(方差分析)分析数据，并且用图基事后检验法(pos-hoc Tukey test)来比较实验内的样品。
在第18天，通过A1001处理促进的第一片叶片LAI评分显著大于对照组(图13)。
除上文或作为上文的替代方案以外，描述以下实施方案：
实施方案1涉及包含ATCC保藏物PTA-121750(A1001)中的微生物的组合物。
实施方案2涉及一种包含五种或更多种选自以下的微生物物种的组合物：脱硫球菌、脱硫肠状菌、海杆菌、亚硝化侏儒菌、固氮螺菌、芽孢杆菌、乳杆菌、瘤胃球菌、细鞘丝藻、水杆菌、钩端螺菌、类芽孢杆菌、微鞘藻、假单胞菌、梭菌、异球藻、醋杆菌、Candidatus spp.以及甲烷鬃毛菌。
实施方案3涉及一种包含十种或更多种选自以下的微生物物种的组合物：脱硫球菌、脱硫肠状菌、海杆菌、亚硝化侏儒菌、固氮螺菌、芽孢杆菌、乳杆菌、瘤胃球菌、细鞘丝藻、水杆菌、钩端螺菌、类芽孢杆菌、微鞘藻、假单胞菌、梭菌、异球藻、醋杆菌、Candidatus spp.以及甲烷鬃毛菌。
实施方案4涉及一种包含以下每一种的组合物：脱硫球菌、脱硫肠状菌、海杆菌、亚硝化侏儒菌、固氮螺菌、芽孢杆菌、乳杆菌、瘤胃球菌、细鞘丝藻、水杆菌、钩端螺菌、类芽孢杆菌、微鞘藻、假单胞菌、梭菌、异球藻、醋杆菌、Candidatus spp.以及甲烷鬃毛菌。
实施方案5涉及实施方案1到4任一项，其进一步包含几丁质、壳聚糖、葡糖胺和氨基酸中的一种或多种。
实施方案6涉及一种方法，其包含：
将含几丁质的生物材料与实施方案1到5任一项的组合物混合以形成混合物；
使该混合物发酵；以及
将发酵混合物分离成固体组分、水相组分和脂质组分。
实施方案7涉及实施方案6的方法，其中所述含几丁质的生物材料包含水生动物或水生动物副产物、昆虫或真菌。
实施方案8涉及实施方案7的方法，其中所述水生动物是水生节肢动物。
实施方案9涉及实施方案8的方法，其中所述水生动物是虾、蟹或磷虾。
实施方案10涉及通过实施方案6到9任一项的方法制备的水相组分。
实施方案11涉及通过实施方案6到9任一项的方法制备的固体组分。
实施方案12涉及一种方法，其包含使土壤、植物或植物部分与实施方案1到5任一项的组合物接触。
实施方案13涉及实施方案12的方法，其进一步包含使土壤、植物或植物部分与几丁质、壳聚糖、葡糖胺和氨基酸中的一种或多种接触。
实施方案14涉及实施方案12或13的方法，其进一步包含使土壤、植物或植物部分与实施方案10的水相组分或实施方案11的固体组分接触。
实施方案15涉及实施方案12到14任一项的方法，其进一步包含使土壤、植物或植物部分与液体肥料接触。
鉴于可应用本公开内容原理的许多可能实施方案，应认识到所说明的实施方案仅为举例，不应被视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由所附权利要求书界定。我们因此要求落入这些权利要求的范围和精神内的全部内容作为我们的发明。
序列表
<110> 阿坤纳斯公司
<120> 微生物聚生体
<130> 9223-93738-02
<150> US 62/126,323
<151> 2015-02-27
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide primer
<400> 1
agrgtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide primer
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (15)

1.一种包含ATCC保藏物PTA-121750的微生物的组合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含几丁质、壳聚糖、葡糖胺和氨基酸中的一种或多种。
3.一种降解含几丁质的生物材料的方法，包含：
将含几丁质的生物材料与根据权利要求1或2所述的组合物混合以形成混合物；
使所述混合物发酵；以及
将发酵混合物分离成固体组分、水相组分和脂质组分。
4.根据权利要求3所述的降解含几丁质的生物材料的方法，其中所述含几丁质的生物材料包含水生动物或水生动物副产物、昆虫或真菌。
5.根据权利要求4所述的降解含几丁质的生物材料的方法，其中所述水生动物是水生节肢动物。
6.根据权利要求5所述的降解含几丁质的生物材料的方法，其中所述水生节肢动物是虾或蟹。
7.根据权利要求5所述的降解含几丁质的生物材料的方法，其中所述水生节肢动物是磷虾。
8.一种通过权利要求3到7任一项所述的降解含几丁质的生物材料的方法制备的水相组分。
9.一种通过权利要求3到7任一项所述的降解含几丁质的生物材料的方法制备的固体组分。
10.一种处理土壤、植物或植物部分的方法，包含使土壤、植物或植物部分与根据权利要求1或2所述的组合物接触。
11.根据权利要求10所述的处理土壤、植物或植物部分的方法，进一步包含使所述土壤、植物或植物部分与几丁质、壳聚糖、葡糖胺和氨基酸中的一种或多种接触。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的处理土壤、植物或植物部分的方法，进一步包含使所述土壤、植物或植物部分与根据权利要求8所述的水相组分或根据权利要求9所述的固体组分接触。
13.根据权利要求10或权利要求11所述的处理土壤、植物或植物部分的方法，进一步包含使所述土壤、植物或植物部分与液体肥料接触。
14.根据权利要求10或权利要求11所述的处理土壤、植物或植物部分的方法，进一步包含使所述土壤、植物或植物部分与一种或多种杀虫剂、一种或多种杀真菌剂、一种或多种除草剂、一种或多种植物激素或其两种或更多种的组合接触。
15.根据权利要求10或权利要求11所述的处理土壤、植物或植物部分的方法，进一步包含使所述土壤、植物或植物部分与一种或多种杀昆虫剂、一种或多种植物诱导剂或其两种或更多种的组合接触。
CN201680024075.0A 2015-02-27 2016-02-26 微生物聚生体 Active CN107787360B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562126323P 2015-02-27 2015-02-27
US62/126,323 2015-02-27
PCT/IB2016/051083 WO2016135698A1 (en) 2015-02-27 2016-02-26 Microbial consortia

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107787360A CN107787360A (zh) 2018-03-09
CN107787360B true CN107787360B (zh) 2021-11-30

Family

ID=55586349

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680024075.0A Active CN107787360B (zh) 2015-02-27 2016-02-26 微生物聚生体

Country Status (12)

Country Link
US (2) US20180235236A1 (zh)
EP (1) EP3262152A1 (zh)
CN (1) CN107787360B (zh)
AR (1) AR103799A1 (zh)
AU (1) AU2016224901B2 (zh)
BR (1) BR112017018115A2 (zh)
CA (1) CA2977178A1 (zh)
MX (1) MX2017010787A (zh)
NZ (1) NZ734547A (zh)
RU (1) RU2727830C2 (zh)
UA (1) UA121880C2 (zh)
WO (1) WO2016135698A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2017010786A (es) 2015-02-27 2018-06-08 Agrinos AS Microbiano consorcios.
CA2977178A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Agrinos AS Microbial consortia
CA3010399A1 (en) * 2016-01-29 2017-08-03 Agrinos AS Microbial consortia and agriculture and biodegradation applications thereof
WO2018045004A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 Agrinos AS Defined microbial compositions
EP3764807A4 (en) 2018-03-14 2021-11-03 Sustainable Community Development, LLC PROBIOTIC AND FOOD ADDITIVE COMPOSITION
WO2021011726A1 (en) * 2019-07-16 2021-01-21 David Abecassis Novel soil amendment with reduced metal content for reducing metal uptake by growing plants, and processes for making and using same
WO2023052597A1 (en) * 2021-10-01 2023-04-06 Tessenderlo Group Nv Liquid fertilizers comprising potassium and potassium solubilizing microorganisms

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2138551C1 (ru) 1996-05-29 1999-09-27 Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности Консорциум микроорганизмов propionibacterium shermanii, streptococcus thermophilus, acetobacter aceti, используемый для приготовления кисломолочных продуктов, и способ производства кисломолочного продукта
RU2197453C1 (ru) 2001-05-03 2003-01-27 Федеральное Государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ" Способ получения компоста
BR112012015501A8 (pt) * 2009-12-23 2018-02-06 Agrinos AS Processo de biodegradação e composição
US20120084886A1 (en) * 2010-06-16 2012-04-05 Agrinos AS Microbial process and composition for agricultural use
WO2012037352A2 (en) 2010-09-15 2012-03-22 Microbes, Inc. Methods and compositions for reducing pathogens in soil and improving plant growth
PE20140003A1 (es) 2010-12-10 2014-02-09 Univ Auburn Inoculantes que incluyen bacterias bacillus para inducir la produccion de compuestos organicos volatiles en plantas
US20120329135A1 (en) * 2011-06-23 2012-12-27 Agrinos AS Process for Making Chitin Derivatives
WO2013148278A1 (en) * 2012-03-27 2013-10-03 Agrinos AS Microbial composition comprising liquid fertilizer and processes for agricultural use
CN104195090A (zh) * 2014-09-12 2014-12-10 范鸿仁 一种复合微生物制剂及其在废水处理中的应用
CN104694428B (zh) * 2015-02-12 2018-02-23 何颖霞 一种用于去除土壤中硝基甲苯的微生物制剂
NZ734550A (en) 2015-02-27 2023-06-30 Amvac Chemical Corp Microbial consortia
CA2977178A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Agrinos AS Microbial consortia
CA3010399A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Agrinos AS Microbial consortia and agriculture and biodegradation applications thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AR103799A1 (es) 2017-06-07
NZ734547A (en) 2023-06-30
AU2016224901A1 (en) 2017-08-31
EP3262152A1 (en) 2018-01-03
MX2017010787A (es) 2018-06-08
WO2016135698A1 (en) 2016-09-01
RU2727830C2 (ru) 2020-07-24
RU2017133313A3 (zh) 2019-03-28
UA121880C2 (uk) 2020-08-10
CN107787360A (zh) 2018-03-09
US11230506B2 (en) 2022-01-25
RU2017133313A (ru) 2019-03-28
CA2977178A1 (en) 2016-09-01
BR112017018115A2 (pt) 2018-04-10
AU2016224901B2 (en) 2022-01-06
US20190307131A1 (en) 2019-10-10
US20180235236A1 (en) 2018-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2739079C2 (ru) Консорциумы микроорганизмов
CN107532139B (zh) 微生物聚生体
CN107849516B (zh) 微生物聚生体
CN107787360B (zh) 微生物聚生体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210611

Address after: California, USA

Applicant after: Emwack chemical Co.

Address before: Oslo

Applicant before: AGRINOS A/S

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant