CN109679852A - 一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法 - Google Patents

一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法，包括根瘤的采集和分离、根瘤菌的培养并保藏、苦参种子的萌发、在蛭石条件下接种根瘤菌和在土壤条件下接种根瘤菌；本发明改良了筛选环节，增加了土壤里接种验证结瘤情况的方法，得到的菌株菌剂通过在蛭石培养和土壤条件下接种苦参后，植株生长显著，有效药用成分有较高积累，是全新的生物菌肥促进植物生长的案例，与对照相比，温室30d培养后苦参植株生物量统计包括地上部分干重、地下部分干重和叶绿素含量等都显著提高，选择出高效菌株后在实验室内的土壤培养基中进一步验证了高效菌株对于苦参植株的促生长能力，同时测试了高效根瘤菌能够提高苦参的根部有效药用成分即生物碱的含量。

Description

一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法
技术领域
本发明涉及菌株的筛选和大田应用领域，具体为一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法。
背景技术
众所周知：大气成分中80％是氮气，但是这些氮无法直接被动植物利用，需要通过固氮还原的方式将大气中的分子态氮还原为氨类有机氮形态，供给动植物利用。地球上主要通过三种方式来固定大气中的氮气：工业固氮、大气固氮和生物固氮。依靠工业固氮的方法虽然解决了地球上日益增长的氮需求问题，但是人工氮肥的过量施用也给全球的氮循环带来了巨大的压力。由于化学合成氮肥的技艺提升和价格下降，农民为了增产增收盲目过量使用氮肥的现象普遍，而我国的平均化肥利用率只有30％左右，过量的氮素进入水体，给我们的生态系统造成了沉重的负担，引发空气污染，水污染以及臭氧层的破坏，进而威胁人类健康。因此，使用生物肥料进行化学氮肥控制是保护地球和环境的需要，是生态系统健康可持续发展的需要。
其中通过豆科植物－根瘤菌共生体系固定的氮素总量约占总生物固氮量的65％，是生物固氮的主力军。根瘤菌与豆科植物的共生体系不仅能够为宿主豆科植物提供有机氮，同时还可以改善土壤结构，因此施用高效固氮的根瘤菌给匹配的豆科植物对于发展绿色生态的有机农业至关重要。根瘤菌剂是国内外应用最早的一种细菌肥料，优质的根瘤菌剂不仅需要菌种与栽培的豆科植物具有很好的结瘤匹配性并能够高效固氮，而且还需要适应当地土壤条件(酸碱度、含水量、氮磷钾含量、有机质含量等)和天气条件(降水和光照等)，因此，选育与特定地区的特定栽培品种高效匹配的根瘤菌菌种是非常重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法，包括如下具体步骤：
S1：根瘤的采集和分离：根瘤连带须根，用剪刀剪下，保存在装有变色硅胶的5ml离心管中，带回实验室，将干燥的根瘤在无菌去离子水中浸润2h，然后转入到超净工作台中操作；
在超净工作台中的具体操作为：将浸泡好的根瘤转入无菌的小烧杯中，倒入95％的乙醇浸润30s，用来消除根瘤表皮的表面张力，然后将酒精倒掉，并用1mL无菌枪头将残余的酒精吸出，加入次氯酸钠消毒液，浸泡5min，每隔1min摇晃一次烧杯，5min以后将次氯酸钠消毒液倒掉，用1mL无菌枪头将残余液体吸出，加入无菌去离子水摇晃洗涤7次；用镊子将消过毒的根瘤分装至无菌200μL PCR管中，每管加入30μL无菌生理盐水，使用无菌200μL枪头将根瘤捣碎，将捣碎后的汁液涂到YMA培养基上，在28℃条件下倒置培养2-15d，直至长出白色根瘤菌菌落；
S2：根瘤菌的培养并保藏：将上述纯化好的菌株接种于YMA斜面上，在28℃条件下培养2-7d，使用无菌长吸管吸取20％的甘油，加到斜面培养基上，与斜面上的菌落吹吸混合均匀，将混合液体加入到无菌1.5mL甘油管中，在-80℃条件下保藏；
S3：苦参种子的萌发：挑选颗粒饱满，没有虫眼的苦参的种子，用浓硫酸破壳处理25min，将浓硫酸倒掉，水洗至不掉颜色，然后转到超净工作台中进行操作；
超净工作台中的具体操作为：将破壳处理后的种子放入无菌小烧杯中，加入95％的乙醇，静置30s，倒掉乙醇，并用无菌枪头吸干净残留的乙醇，加入次氯酸钠消毒液处理5min，每1min摇晃一次，倒掉次氯酸钠消毒液，枪头洗净残留的消毒液，再用无菌水洗7次，将消过毒的种子均匀摆在0.5％的水琼脂平板上，在28℃条件下避光发芽；
S4：在蛭石条件下接种根瘤菌：将步骤S3中得到的芽长为1-2cm的种子栽种到双层钵中的蛭石中，接种1mL菌液到种子根部，封口膜封口，在16h光照，8h黑暗的光照温室中培养35d，收获并统计结瘤情况，对菌株进行筛选；
S5：在土壤条件下接种根瘤菌：将步骤S3中得到的芽长1-2cm的种子栽种到双层钵中的土壤中，接种1mL菌液到种子根部，封口膜封口，在16h光照，8h黑暗的光照温室中培养35d，收获并统计结瘤情况，对菌株进行筛选。
优选的，次氯酸钠消毒液的成分配比为：次氯酸钠：无菌水＝1:5。
优选的，步骤S1中的镊子事先将其尖端在酒精灯火焰上烧红，冷却至室温后再使用。
优选的，步骤S5中的土壤取自当地的苦参种植区。
优选的，筛选的指标为菌株叶片叶绿素含量、植株高度、地上部分干重、地下部分干重、根瘤数目和根瘤干重等
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明改良了筛选环节，增加了土壤里接种验证结瘤情况的方法，得到的菌株菌剂通过在蛭石培养和土壤条件下接种苦参后，植株生长显著，有效药用成分有较高积累，是全新的生物菌肥促进植物生长的案例，与对照相比，温室30d培养后苦参植株生物量统计包括地上部分干重、地下部分干重和叶绿素含量等都显著提高，选择出高效菌株后在实验室内的土壤培养基中进一步验证了高效菌株对于苦参植株的促生长能力，同时测试了高效根瘤菌能够提高苦参的根部有效药用成分即生物碱的含量。
附图说明
图1为高效菌株E5和H4单独接种和混合接种苦参后叶片叶绿素含量；
图2为地上植株干重；
图3为根瘤湿重；
图4为地下植株根部干重。
图中，Mix指混合接种E5和H4；Control指对照不接种根瘤菌。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“竖直”、“上”、“下”、“水平”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法，包括如下具体步骤：
S1：根瘤的采集和分离：根瘤连带须根，用剪刀剪下，保存在装有变色硅胶的5ml离心管中，带回实验室，将干燥的根瘤在无菌去离子水中浸润2h，然后转入到超净工作台中操作；
在超净工作台中的具体操作为：将浸泡好的根瘤转入无菌的小烧杯中，倒入95％的乙醇浸润30s，用来消除根瘤表皮的表面张力，然后将酒精倒掉，并用1mL无菌枪头将残余的酒精吸出，加入次氯酸钠消毒液，浸泡5min，每隔1min摇晃一次烧杯，5min以后将次氯酸钠消毒液倒掉，用1mL无菌枪头将残余液体吸出，加入无菌去离子水摇晃洗涤7次；用镊子将消过毒的根瘤分装至无菌200μL PCR管中，每管加入30μL无菌生理盐水，使用无菌200μL枪头将根瘤捣碎，将捣碎后的汁液涂到YMA培养基上，在28℃条件下倒置培养2-15d，直至长出白色根瘤菌菌落；
S2：根瘤菌的培养并保藏：将上述纯化好的菌株接种于YMA斜面上，在28℃条件下培养2-7d，使用无菌长吸管吸取20％的甘油，加到斜面培养基上，与斜面上的菌落吹吸混合均匀，将混合液体加入到无菌1.5mL甘油管中，在-80℃条件下保藏；
S3：苦参种子的萌发：挑选颗粒饱满，没有虫眼的苦参的种子，用浓硫酸破壳处理25min，将浓硫酸倒掉，水洗至不掉颜色，然后转到超净工作台中进行操作；
超净工作台中的具体操作为：将破壳处理后的种子放入无菌小烧杯中，加入95％的乙醇，静置30s，倒掉乙醇，并用无菌枪头吸干净残留的乙醇，加入次氯酸钠消毒液处理5min，每1min摇晃一次，倒掉次氯酸钠消毒液，枪头洗净残留的消毒液，再用无菌水洗7次，将消过毒的种子均匀摆在0.5％的水琼脂平板上，在28℃条件下避光发芽；
S4：在蛭石条件下接种根瘤菌：将步骤S3中得到的芽长为1-2cm的种子栽种到双层钵中的蛭石中，接种1mL菌液到种子根部，封口膜封口，在16h光照，8h黑暗的光照温室中培养35d，收获并统计结瘤情况，对菌株进行筛选；
S5：在土壤条件下接种根瘤菌：将步骤S3中得到的芽长1-2cm的种子栽种到双层钵中的土壤中，接种1mL菌液到种子根部，封口膜封口，在16h光照，8h黑暗的光照温室中培养35d，收获并统计结瘤情况，对菌株进行筛选。
优选的，次氯酸钠消毒液的成分配比为：次氯酸钠：无菌水＝1:5。
优选的，步骤S1中的镊子事先将其尖端在酒精灯火焰上烧红，冷却至室温后再使用。
优选的，步骤S5中的土壤取自当地的苦参种植区。
具体实施方式：首先将从山西长治苦参基地分离到的首批根瘤菌种群中，分别接种在蛭石中生长的苦参幼苗上，验证共生固氮能力，筛选的指标包括：叶片叶绿素含量、植株高度、地上部分干重、地下部分干重、根瘤数目和根瘤干重等。初步筛选到两株潜在高效菌株，分别是Rhizobium sp.CCBAU 03386(E5)、Mesorhizobium amphorae CCBAU 03399(H4)，与不接种根瘤菌对照相比，接种H4后苦参植株生长增高,叶片颜色发绿。如图1-4，A为阳性对照,其中右边的峰值为在特定时间点氧化苦参碱的峰，B为阴性对照，即未接种根瘤菌的苦参根部样品，C显示接种高效菌株E5后苦参氧化苦参碱较少积累，D显示接种高效菌株H4后苦参氧化苦参碱也有部分积累。接种高效菌株E5和H4后的3个月，收集根部样品测定有效成分氧化苦参碱的积累情况(图1-2)，与不接种苦参根瘤菌相比较,接种高效菌株后尽管苦参根部氧化苦参碱的积累峰值不高,但有明显的的积累。选择出高效菌株后在实验室内的土壤培养基中进一步验证了本方法得到的高效菌株对于苦参植株具有明显的促生长能力，同时测试了本方法得到的高效根瘤菌能够提高苦参的根部有效药用成分即生物碱的含量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
S1：根瘤的采集和分离：根瘤连带须根，用剪刀剪下，保存在装有变色硅胶的5ml离心管中，带回实验室，将干燥的根瘤在无菌去离子水中浸润2h，然后转入到超净工作台中操作；
在超净工作台中的具体操作为：将浸泡好的根瘤转入无菌的小烧杯中，倒入95％的乙醇浸润30s，用来消除根瘤表皮的表面张力，然后将酒精倒掉，并用1mL无菌枪头将残余的酒精吸出，加入次氯酸钠消毒液，浸泡5min，每隔1min摇晃一次烧杯，5min以后将次氯酸钠消毒液倒掉，用1mL无菌枪头将残余液体吸出，加入无菌去离子水摇晃洗涤7次；用镊子将消过毒的根瘤分装至无菌200μL PCR管中，每管加入30μL无菌生理盐水，使用无菌200μL枪头将根瘤捣碎，将捣碎后的汁液涂到YMA培养基上，在28℃条件下倒置培养2-15d，直至长出白色根瘤菌菌落；
S2：根瘤菌的培养并保藏：将上述纯化好的菌株接种于YMA斜面上，在28℃条件下培养2-7d，使用无菌长吸管吸取20％的甘油，加到斜面培养基上，与斜面上的菌落吹吸混合均匀，将混合液体加入到无菌1.5mL甘油管中，在-80℃条件下保藏；
S3：苦参种子的萌发：挑选颗粒饱满，没有虫眼的苦参的种子，用浓硫酸破壳处理25min，将浓硫酸倒掉，水洗至不掉颜色，然后转到超净工作台中进行操作；
超净工作台中的具体操作为：将破壳处理后的种子放入无菌小烧杯中，加入95％的乙醇，静置30s，倒掉乙醇，并用无菌枪头吸干净残留的乙醇，加入次氯酸钠消毒液处理5min，每1min摇晃一次，倒掉次氯酸钠消毒液，枪头洗净残留的消毒液，再用无菌水洗7次，将消过毒的种子均匀摆在0.5％的水琼脂平板上，在28℃条件下避光发芽；
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S5：在土壤条件下接种根瘤菌：将步骤S3中得到的芽长1-2cm的种子栽种到双层钵中的土壤中，接种1mL菌液到种子根部，封口膜封口，在16h光照，8h黑暗的光照温室中培养35d，收获并统计结瘤情况，对菌株进行筛选。
2.根据权利要求1所述的一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法，其特征在于：次氯酸钠消毒液的成分配比为：次氯酸钠：无菌水＝1:5。
3.根据权利要求1所述的一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法，其特征在于：步骤S1中的镊子事先将其尖端在酒精灯火焰上烧红，冷却至室温后再使用。
4.根据权利要求1所述的一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法，其特征在于：步骤S5中的土壤取自当地的苦参种植区。
5.根据权利要求1所述的一种筛选豆科苦参高效固氮根瘤菌的方法，其特征在于：筛选的指标为菌株叶片叶绿素含量、植株高度、地上部分干重、地下部分干重、根瘤数目和根瘤干重等。
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190426

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