CN114959100A

CN114959100A - 筛选矮秆密小穗抗赤霉病小麦的kasp引物组及其应用

Info

Publication number: CN114959100A
Application number: CN202210680831.2A
Authority: CN
Inventors: 胡文静; 朱冬梅; 蒋正宁; 王慧; 刘健; 王君婵; 刘大同; 陆成彬; 吴宏亚; 高德荣; 张勇; 张春梅; 程晓明; 赵蝶
Original assignee: JIANGSU LIXIAHE REGION AGRICULTURAL RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: JIANGSU LIXIAHE REGION AGRICULTURAL RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明公开了筛选矮秆密小穗抗赤霉病小麦的KASP引物组及其应用。本发明利用Wheat55K小麦高通量基因芯片获取基因型数据，在2D和5A染色体上检测到来源于扬麦11的2个与株高、小穗着生密度和赤霉病抗性相关的QTL区域Q.2D和Q.5A，其紧密连锁标记是AX110519154(2D)和AX111618105(5A)，并据此开发了2个KASP标记引物组。通过实验证明本发明所述KASP分子标记可用于小麦株高、小穗着生密度和赤霉病抗性的分子标记辅助选择育种。本发明为株高、小穗着生密度和赤霉病抗性相关的两个QTL区域Q.2D和Q.5A在育种中有效利用提供了良好工具。

Description

筛选矮秆密小穗抗赤霉病小麦的KASP引物组及其应用

技术领域

本发明属于小麦分子育种方法技术领域，涉及筛选矮秆密小穗抗赤霉病小麦的KASP引物组及其应用。

背景技术

小麦赤霉病主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)等引起，一旦侵染小麦穗部，就会产生和积累各种毒素，例如脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deo xynivalenol，DON)、雪腐镰孢菌烯醇(nivalenol，NIV)和玉米赤霉烯酮(zearalenol，ZEN)，从而扩展到穗轴，影响营养物质和水分运输，严重时导致枯白穗、籽粒干瘪，进而降低小麦产量、损害品质，毒素污染更会对人、畜健康造成巨大伤害，成为粮食安全的主要威胁。小麦抗赤霉病的表现形式可分为5类：第一类为抗侵染(resistance to invasion，type I)、第二类为抗扩展(resistanceto spreading，type II)；第三类为籽粒抗感染(resistance to kernel infection,typeIII)、第四类为耐病性(tolerance ag ainst FHB and trichothecenes,type IV)、第五类为抗毒素积累(resistanceto trichothecene accumulation，type V)。其中第一类和第二类是国内外学者长期以来致力研究的类型，已知的几个抗赤霉病品种例如苏麦3号、望水白、白三月黄、新中长等，虽然赤霉病抗性优良，但是这些材料的综合农艺性状差、丰产性差，最常见的缺点是株高偏高(120cm以上)，小穗密度稀等，因此用这些小麦材料与其他小麦材料杂交后后代普遍存在植株太高、易倒伏、小穗密度稀、单株穗数少等较难克服的缺点，造成育种选择效率低和工作量大，更是不能选育出能推广应用的品种。江苏里下河地区农科所在中亚、欧美引进种质中选用综合丰产性好、赤霉病轻的亲本进行配组，后代加强抗赤霉病与综合农艺性状选择，育成了一批抗赤霉病与丰产结合的小麦品种，如扬麦4号，1983年小麦生长后期阴雨连绵，赤霉病重发，扬麦4号仍表现较好的丰产性，赤霉病严重度(PSS％)低，后又利用扬麦4号和郑引1号育成了扬麦5号、扬麦158优良品种，扬麦5号和扬麦158相继获得国家科学技术发明一等奖，是当时长江流域乃至全国推广面积最大的两个小麦品种。本实验室通过研究发现扬麦4号、扬麦5号和扬麦158等均不携已知的抗赤霉病主效基因Fhb1—Fhb7的抗病等位基因型，因此，他们中可能存在其他的抗赤霉病基因。扬麦11是由扬麦158为亲本育成的又一改良品种，2001年在扬州生产示范中，平均亩产542公斤，较扬麦158增产7.8％。该品种丰产、稳产性较好，获得江苏省科技进步二等奖，其株高较扬麦158有所降低，小穗着生密度比一般品种高，赤霉病抗性较扬麦158更强，因此，挖掘出扬麦11的抗赤霉病和相关农艺性状的遗传位点，明确其抗赤霉病和农艺性状的遗传基础，对小麦抗赤霉病改良具有重要意义。迄今为止，还未有对扬麦11抗赤霉病位点及其与农艺性状的相关性报道的先例。

株高(Plant height,PH)和小穗着生密度(Spike compactness,SC)是十分重要的小麦产量相关性状。小麦已报道的矮秆基因主要是Rht-D1和Rht-B1和Rht8，分布于4DS，4BS和2DS，其与赤霉病抗性的关系还未有定论，主要原因是在不同的遗传背景和接种类型下位点对性状的效应不同。小麦的小穗着生密度(每穗总小穗数/穗长)是一个非常复杂的农艺性状，是每穗总小穗数和穗长的综合反映，已报道的相关遗传位点主要集中在2D染色体短臂上的C基因和5A染色体长臂上的Q基因，前人也未研究过这些位点与赤霉病抗性的关系。迄今为止，罕见关于小麦抗赤霉病与相关农艺性状的一因多效位点或者QTL簇的报道。

KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)即竞争性等位基因特异性PCR，可在广泛的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)应用，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。KASP通量高、快速、稳定，是一种较为理想的育种实用分子标记。近年来，随着小麦全基因组测序的不断完善，对小麦各种性状的遗传研究已经深入到SNPs水平，因此KASP标记的开发与利用成为小麦分子标记辅助育种的主要途径之一，该技术已在小麦株高、粒重和春化基因/位点等育种应用上广泛采用。

因此，加强小麦抗赤霉病遗传与育种研究，培育抗性和产量等协同提高的小麦品种十分迫切。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，提供一种可供分子标记辅助选择矮秆密小穗抗赤霉病基因型的小麦育种使用的连锁分子标记。本发明利用Wheat 55KSNP小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于小麦品种扬麦11的2个与赤霉病抗性、株高和小穗着生密度显著相关的QTL区域Q.2D和Q.5A，进一步通过筛选附近标记的有效性、可靠性，确定这两个QTL区域的紧密连锁标记分别是AX110519154(2D)和AX111618105(5A)，并据此开发了2个KASP标记引物组，用以对矮秆密小穗抗赤霉病基因型进行高效筛选。

第一方面，本发明提供了一种检测赤霉病抗性、株高和小穗着生密度的物质，所述物质为用于检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是GG、还是AA、还是G和A的成套引物X1，和用于检测小麦基因组中染色体5A上SEQ IDNo.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是TT、还是CC、还是T和C的成套引物X2的引物组合或含有所述引物组合的检测试剂或试剂盒。

进一步地，所述成套引物X1中含有一条上游引物和两条下游引物；

所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计；

所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计，且一条所述下游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为T，另一条所述下游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为C。

进一步地，所述成套引物X1由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ IDNo.2的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.3的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物组成；其中，所述SEQ ID No.2的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ IDNo.2的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A；所述SEQ ID No.3的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.3的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。

进一步地，所述成套引物X2中含有两条上游引物和一条下游引物；

所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为T，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为C；

所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。

进一步地，所述成套引物X2由SEQ IDNo.5的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.6的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.7所示的单链DNA分子组成；其中，所述SEQ ID No.5的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ IDNo.5的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A；所述SEQ ID No.6的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.6的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。

进一步地，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX。

进一步地，所述成套引物X1由所述上游引物序列SEQ ID No.1及所述下游引物的序列SEQ ID No.2、SEQ ID No.3组成；所述成套引物X2由所述上游引物序列SEQ ID No.5、SEQ ID No.6及所述下游引物的序列SEQ ID No.7组成。

第二方面，本发明还提供了本发明第一方面所述的物质在如下任一中的应用：

(A)鉴定或辅助鉴定小麦矮秆密小穗抗赤霉病性状；

(B)比较待测小麦株高高低、小穗着生密度高低和赤霉病抗性强弱；

(C)选育或筛选株高较低、小穗着生密度高、赤霉病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；

(D)选育或筛选株高较高、小穗着生密度低、赤霉病抗性相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种；

(E)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较株高高低、小穗着生密度高低和赤霉病抗性强弱的产品；

(F)制备用于选育或筛选株高较低、小穗着生密度高、赤霉病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(G)制备用于选育或筛选株高较高、小穗着生密度低、赤霉病抗性相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种的产品。

第三方面，本发明还提供了如下任一方法：

方法A：一种比较待测小麦矮秆密小穗抗赤霉病性状的方法，包括如下步骤(A1)或(A2)：

(A1)检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示分子标记的第36位基因型是AA还是GG还是AG，同时检测小麦基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示分子标记的第36位基因型是CC还是TT还是CT；

(A2)按照如下确定所述待测小麦矮秆密小穗抗赤霉病性状：基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是GG且基因组中染色体5A上SEQ IDNo.8所示分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是TT的纯合体，所述待测小麦具有矮秆密小穗抗赤霉病性状；

方法B：一种选育或筛选株高较低、小穗着生密度高、赤霉病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

(B1)检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示分子标记的第36位基因型是AA还是GG还是AG，同时检测小麦基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示分子标记的第36位基因型是CC还是TT还是CT；

(B2)选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是G且基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体2D上SEQ IDNo.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是G且基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体的小麦，最终获得株高较低、小穗着生密度高、赤霉病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；

方法C：一种选育或筛选株高较高、小穗着生密度低、赤霉病抗性相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

(C1)检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示分子标记的第36位基因型是AA还是GG还是AG，同时检测小麦基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示分子标记的第36位基因型是CC还是TT还是CT；

(C2)选择基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是A且基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体2D上SEQ IDNo.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是A且基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体的小麦，最终获得株高较高、小穗着生密度低、赤霉病抗性相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种。

进一步地，所述(A1)(B1)(C1)具体操作为，

采用本发明第一方面提供的检测试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体2D上SEQ ID No.4所示的的第36位脱氧核糖核苷酸种类和所述待测小麦基因中染色体5A上SEQ ID No.8所示的的第36位脱氧核糖核苷酸种类：

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体，或所述待测小麦基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是T的纯合体；

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为红色，则所述待测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体，或所述待测小麦基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是C的纯合体。

本发明相对于现有技术而言，利用Wheat55K小麦高通量基因芯片获取基因型数据，在2D和5A染色体上检测到来源于扬麦11的2个与株高、小穗着生密度和赤霉病抗性相关的QTL区域Q.2D和Q.5A，其紧密连锁标记是AX110519154(2D)和AX111618105(5A)。在此研究基础上，本发明将连锁SNPs转化为可用于高通量、低成本和低失误率地检测或辅助检测株高、小穗着生密度和赤霉病抗性的KASP标记，并进一步开发了KASP标记专用引物组KASP_2D和KASP_5A。通过实验证明本发明所述KASP分子标记可用于小麦株高、小穗着生密度和赤霉病抗性的分子标记辅助选择育种。本发明为株高、小穗着生密度和赤霉病抗性相关的两个QTL区域Q.2D和Q.5A在育种中有效利用提供了良好工具，这两个KASP标记可快速对小麦株高、小穗着生密度和赤霉病抗性进行筛选，为筛选携带优异等位变异的小麦材料提供便捷，提高小麦抗赤霉病育种效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为遗传连锁图谱及定位示意图，其中，图1a为2D染色体的部分遗传连锁图谱及Q.2D定位示意图；图1b为5A染色体的部分遗传连锁图谱及Q.5A定位示意图。

图2为实施例2中KASP_2D标记和KASP_5A标记应用在小麦自然群体基因型扩增检测结果。图2a为KASP_2D标记在小麦自然群体基因型扩增检测结果；图2b为KASP_5A标记在小麦自然群体基因型扩增检测结果。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。作为专业性农业研究机构，申请人长期保存有相关种质材料，而且相关小麦品种均是可以市场或者现有种质库中公开获得的。

实施例1筛选稳定的与小麦株高、小穗着生密度和赤霉病抗性显著相关的SNP位点并且初步验证

本实施例以293份来源于“扬麦11×郑麦9023”的重组自交系(F₆)为材料，2018年、2019年和2020年连续3个生长季将该重组自交系及其亲本种植于江苏里下河地区万福试验基地。采用随机区组设计，每个系种植3行，每行30粒，行长2.2m，行距0.23m，两次重复，常规大田管理。进一步于2019年、2020年和2021年在田间进行小麦赤霉病抗性接种鉴定，制备赤霉菌孢子悬浮液(1×10⁵—5×10⁵孢子mL^–1)，采用单花滴注法接种，于小麦开花初期，用注射器吸取10μL孢子液注入麦穗自顶部小穗开始自上而下第6个小穗的任意一个小花中，每个系接种15个穗子。接种后采用人工弥雾保湿(每1.5小时喷弥雾5min)。接种25天后调查接种穗的病小穗数，计算病小穗率。病小穗率(PSS)＝发病小穗数/总小穗数×100％。抗病调查和鉴定标准按照《中华人民共和国农业行业标准NY/T 2954-2016：小麦区域试验品种抗赤霉病鉴定技术规程》。同时在2019年、2020年和2021年的小麦灌浆成熟期对每个系随机调查10个单株的株高(PH)、主茎穗长(SL)和每穗总小穗数(SNS)，取10个单株的平均值，计算每个系的平均小穗着生密度(SC＝SNS/SL)。

采用CTAB法提取基因组DNA，利用Wheat 55K SNP芯片获取基因型，并构建遗传图谱。利用IciMapping v4.1软件对基因型数据进行前期处理和分群，利用JoinMap v4.0构建和校正遗传图谱，利用MapChart2.3(ht tps://www.wur.nl/en/show/Mapchart.htm)绘制遗传图谱。利用完备区间作图法(Inclusive composite interval mapping，ICIM)检测与株高、小穗着生密度和赤霉病抗性显著相关的QTL，LOD阈值设为3.0。为了与前人结果比较，将连锁标记或者基因序列与小麦参考基因组序列2.1版本的数据库(http://202.194.139.32/blast/blast.html)进行比对。

实验获得2个相对稳定的同时与小麦株高、小穗着生密度和赤霉病抗性显著相关的QTL区域Q.2D和Q.5A，Q.2D的LOD值范围5.92–14.77，表型贡献率9.28％–26.24％，Q.5A的LOD值范围7.44–13.16，表型贡献率12.63％–20.36％，降低株高、提高小穗着生密度和增强赤霉病抗性的基因型来源均是扬麦11，结果如下表所示。

表1 Q.2D和Q.5A的紧密连锁标记和物理位置

如图1和表1所示，本申请通过完备区间作图分别在2D和5A上检测到来源于扬麦11的与小麦株高、小穗着生密度和赤霉病抗性显著相关的QTL区域Q.2D和Q.5A，经过与小麦参考基因组2.1数据库比对发现分别位于小麦2D和5A染色体长臂上，经过比对这两个QTL区域与小麦的C基因和Q基因不在相似的物理区间，前人也未曾在这两个区间报道过与小麦株高、小穗着生密度和赤霉病抗性显著相关的QTL簇。进一步依据标记同源性初步筛选SNPs标记，选择LOD峰值附近的SNP标记并且与表型连锁性最好的SNP进行KASP标记转化，确定AX110519154(2D)和AX111618105(5A)的基因组特异性最好、与赤霉病抗性相关性最显著，其侧翼序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8，利用Primer3.0(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)进行KASP引物设计，引物由北京嘉程生物科技有限公司合成。最终成功将AX110519154(2D)和AX111618105(5A)标记分别转化为有效的KASP标记KASP_2D和KASP_5A，在小麦基因组上特异性最好，无同源扩增序列，其对应的变异位点分别是G/A(C/T的互补碱基)和T/C，具体序列情况如表2：

表2 KASP_2D和KASP_5A的引物序列信息和侧翼序列信息

KASP_2D引物的制备和PCR反应

取上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)30μL(100μM)，取下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)各12μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液，备用。PCR扩增反应体系：待测小麦DNA模板2μL(约30ng/μL)、引物工作液0.08μL、KASP Master Mix 2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL；PCR反应程序：第一步，95℃预变性12min；第二步，95℃变性20s、65–57℃(每个循环下降1℃)60s，共8个循环；第三步，95℃变性20s、57℃复性1min，33个循环；4℃保存。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。取小麦幼苗，采用CTAB法提取待测小麦基因组DNA，以待测小麦基因组DNA为模板，采用如上KASP引物组、PCR试剂进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。PCR反应在S1000^TM Ther mal CyclerPCR仪(Bio-Rad Laboratories Inc.)上进行，用多功能酶标仪(PHERAstar Plus,BMGLABTECH，Germany)对PCR扩增产物进行扫描读取荧光值。FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm；VIC激发波长为535nm，发射波长为556nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。采用Kluster Caller软件(KBioscience)进行基因分型，根据分析结果确定KASP_2D基因型。

KASP_5A引物的制备和PCR反应

取上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)各12μL(100μM)，取下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)30μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液，备用。PCR扩增反应体系：待测小麦DNA模板2μL(约30ng/μL)、引物工作液0.08μL、KASP Master Mix 2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL；PCR反应程序：第一步，92℃预变性12min；第二步，94℃变性20s、64–56℃(每个循环下降1℃)60s，共9个循环；第三步，94℃变性20s、56℃复性1min，31个循环；4℃保存。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。取小麦幼苗，采用CTAB法提取待测小麦基因组DNA，以待测小麦基因组DNA为模板，采用如上KASP引物组、PCR试剂进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。PCR反应在S1000^TM Ther mal CyclerPCR仪(Bio-Rad Laboratories Inc.)上进行，用多功能酶标仪(PHERAstar Plus,BMGLABTECH，Germany)对PCR扩增产物进行扫描读取荧光值。FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm；VIC激发波长为535nm，发射波长为556nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。采用Kluster Caller软件(KBioscience)进行基因分型，根据分析结果确定KASP_5A基因型。

293份“扬麦11×郑麦9023”的重组自交系连同两个亲本按照如上方法进行KASP_2D和KASP_5A扩增。KASP_2D扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦11相同，即证明这些小麦在分子标记KASP_2D侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.4)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为G；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦11分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为A。KASP_5A扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦11相同，即证明这些小麦在分子标记KASP_5A侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.4)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为T；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦11分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为C。部分家系的基因型检测和表型平均值试验结果如表3所示，材料分型良好，KASP引物组设计成功。

表3部分RIL家系的Q.2D和Q.5A的基因型和平均表型值结果

表4携带不同基因型的RIL家系的T测验结果

^a数字后面的不同小写字母表示有极显著差异(P<0.01)

^bt值后面的**表示有极显著差异(P<0.01)

表4所示利用Excel 2019的双样本T测验，可以看出，扬麦11的Q.2D基因型是GG，Q.5A基因型是TT，而郑麦9023的Q.2D基因型是AA，Q.5A基因型是CC，RIL家系的T测验结果表明，Q.2D基因型是GG的家系比AA的家系株高显著低(降低6.73％)、小穗密度显著高(提高7.69％)、赤霉病严重度显著低(降低27.77％)(P<0.01)；Q.5A基因型是TT的家系比CC的家系株高显著低(降低9.99％)、小穗密度显著高(提高9.79％)、赤霉病严重度显著低(降低18.06％)(P<0.01)(统计方法为本领域常规方法，具体也可以参见文献“盖钧镒，《试验统计方法》，中国农业出版社，2000年9月”中公开的内容)。

表5 Q.2D和Q.5A的聚合效应分析

^a数字后面的不同小写字母表示基因型组合之间至少在P<0.05水平上有显著差异

^bt值后面的**表示相对于基因型组合“AA+CC”有极显著差异(P<0.01)，*表示相对于基因型组合“AA+CC”有显著差异(P<0.05)

表5所示可以看出，Q.2D和Q.5A基因型是“GG+CC”时，相对于“AA+CC”，家系的株高降低4.68％(P<0.05)，小穗着生密度提高5.79％(P<0.05)，赤霉病严重度降低29.08％(P<0.01)；Q.2D和Q.5A基因型是“AA+TT”时,相对于“AA+CC”，家系的株高降低7.98％(P<0.01)，小穗着生密度提高8.42％(P<0.01)，赤霉病严重度降低20.72％(P<0.01)；Q.2D和Q.5A基因型是“GG+TT”时,相对于“AA+CC”，家系的株高降低13.93％(P<0.01)，小穗着生密度提高15.79％(P<0.01)，赤霉病严重度降低36.81％(P<0.01)。由此可见，Q.2D基因型是GG且Q.5A基因型是TT时，家系株高最低、小穗密度最高、赤霉病严重度最低(P<0.01)，因此聚合Q.2D基因型GG和Q.5A基因型TT，能够显著降低株高、提高小穗着生密度、增强赤霉病抗性(统计方法为本领域常规方法，具体也可以参见文献“盖钧镒，《试验统计方法》，中国农业出版社，2000年9月”中公开的内容)。

表3至表5显示上述两套KASP的引物组及基因型检测体系各自单独应用或者同时应用于小麦株高高低、小穗着生密度高低和赤霉病抗性强弱的材料选择中，Q.2D和Q.5A的效应显著，说明KASP标记开发成功，可进一步用于育种材料检测。

实施例2 KASP引物组育种应用

田间试验：120份来源于全国的小麦品种(系)为材料，2019年和2020年连续2个生长季种植于江苏里下河地区万福试验基地。采用随机区组设计，每个系种植5行，每行30粒，行长2.2m，行距0.23m，两次重复，常规大田管理。进一步于2020年和2021年在田间进行小麦赤霉病抗性接种鉴定，制备赤霉菌孢子悬浮液(1×10⁵–5×10⁵孢子mL^–1)，采用单花滴注法接种，于小麦开花初期，用注射器吸取10μL孢子液注入麦穗自顶部小穗开始自上而下第6个小穗的任意一个小花中，每个品种(系)接种15个穗子。接种后采用人工弥雾保湿(每1.5小时喷弥雾5min)。接种25天后调查接种穗的病小穗数，计算病小穗率。病小穗率(PSS)＝发病小穗数/总小穗数×100％。抗病调查和鉴定标准按照《中华人民共和国农业行业标准NY/T2954-2016：小麦区域试验品种抗赤霉病鉴定技术规程》。同时在2020年和2021年的小麦灌浆成熟期对每个品种(系)随机调查10个单株的株高(PH)、主茎穗长(SL)和每穗总小穗数(SNS)，取10个单株的平均值，计算每个系的平均小穗着生密度(SC＝SNS/SL)

利用实施例1获得的KASP引物组对120份种植于万福试验基地小麦鉴定圃的全国推广小麦品种(系)进行基因分型，2019年、2020年和两年大田试验赤霉病鉴定结果的平均值以及基因型检测结果如表6和附图2所示。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦11分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为A。KASP_5A扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦11相同，即证明这些小麦在分子标记KASP_5A侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.4)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为T；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦11分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为C。

表6 120份小麦推广品种(系)的Q.2D和Q.5A的基因型和平均表型值结果

表7携带不同基因型的供试品种(系)的T测验结果

^a数字后面的**表示相对于“AA+CC”有极显著差异(P<0.01)，*表示相对于“AA+CC”有显著差异(P<0.05)。

表7利用Excel 2019的双样本T测验结果表明120份小麦品种(系)中，Q.2D基因型是AA且Q.5A基因型是CC时，品种(系)株高最高、小穗密度最低、赤霉病严重度最高(P<0.01)；当Q.2D基因型是GG且Q.5A基因型是CC时，相对于“AA+CC”，品种(系)的株高降低3.86％(P<0.01)、小穗密度提高4.17％(P<0.05)、赤霉病严重度降低33.16％(P<0.01)；当Q.2D基因型是AA且Q.5A基因型是TT时，相对于“AA+CC”，品种(系)的株高降低2.07％(P<0.05)、小穗密度提高4.17％(P<0.05)、赤霉病严重度降低29.33％(P<0.05)；当Q.2D基因型是GG且Q.5A基因型是TT时，相对于“AA+CC”，品种(系)的株高降低5.52％(P<0.01)、小穗密度提高7.29％(P<0.01)、赤霉病严重度降低54.36％(P<0.01)；Q.2D基因型是GG且Q.5A基因型是TT时，品种(系)株高最低、小穗密度最高、赤霉病严重度最低(P<0.01)，说明聚合Q.2D基因型GG和Q.5A基因型TT，能够极显著降低株高、提高小穗着生密度、增强赤霉病抗性(统计方法为本领域常规方法，具体也可以参见文献“盖钧镒，《试验统计方法》，中国农业出版社，2000年9月”中公开的内容)。上述两套KASP的引物组及基因型检测体系可以各自单独应用或者同时应用于小麦株高、小穗着生密度和赤霉病的分子标记辅助选择育种中。

由上述实验结果可以得出：通过本发明的两套KASP引物组对小麦基因组DNA进行PCR扩增，可以直接通过KASP分型判断是否携带扬麦11的矮杆密小穗抗赤霉病的基因型，检测方法操作简单，检测结果非常直观，检测效果明显有效，利用这两套KASP引物组可以大大提高矮杆密小穗抗赤霉病的小麦的分子标记辅助选择育种工作效率。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏里下河地区农业科学研究所

<120> 筛选矮秆密小穗抗赤霉病小麦的KASP引物组及其应用

<130> 202206

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

cgagcctccc atatccgtct 20

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tccagctagg ctcttcacac t 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat tccagctagg ctcttcacac c 41

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L）

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> R为碱基为A或G

<400> 4

ttaaggggta tcggtctagc cgggcattta ggaccrgtgt gaagagccta gctggatctt 60

tttttatggt c 71

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

gaaggtgacc aagttcatgc ttggacaccg aagtagttcc c 41

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat ttggacaccg aagtagttcc t 41

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

tctgcgggca catcagttag 20

<210> 8

<211> 71

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L）

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> R代表碱基为C或T

<400> 8

gcagccctaa ctgatatgga caccgaagta gttccrgtaa taaccaacta actgatgtgc 60

ccgcagagaa g 71

Claims

1.一种检测小麦矮秆密小穗抗赤霉病的物质，其特征在于，所述物质为用于检测小麦基因组中染色体2D上SEQ ID No.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是GG、还是AA、还是G和A的成套引物X1，和用于检测小麦基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是TT、还是CC、还是T和C的成套引物X2的引物组合或含有所述引物组合的检测试剂或试剂盒。

2.根据权利要求1所述的物质，其特征在于，

所述成套引物X1中含有一条上游引物和两条下游引物；

3.根据权利要求2所述的物质，其特征在于，所述成套引物X1由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.3的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物组成；其中，所述SEQ ID No.2的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.2的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A；所述SEQ ID No.3的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.3的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。

4.根据权利要求1所述的物质，其特征在于，

所述成套引物X2中含有两条上游引物和一条下游引物；

5.根据权利要求4所述的物质，其特征在于，所述成套引物X2由SEQ IDNo.5的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.6的第22-41位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.7所示的单链DNA分子组成；其中，所述SEQ ID No.5的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.5的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A；所述SEQ ID No.6的第22-41位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.6的第22-41位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。

6.根据权利要求3或5所述的物质，其特征在于，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX。

7.根据权利要求6所述的物质，其特征在于，所述成套引物X1由所述上游引物序列SEQID No.1及所述下游引物的序列SEQ ID No.2、SEQ ID No.3组成；所述成套引物X2由所述上游引物序列SEQ ID No.5、SEQ ID No.6及所述下游引物的序列SEQ ID No.7组成。

8.权利要求1-7任一项所述的物质在如下任一中的应用：

(A)鉴定或辅助鉴定小麦矮秆密小穗抗赤霉病性状；

9.如下任一方法：

(A2)按照如下确定所述待测小麦矮秆密小穗抗赤霉病性状：基因组中染色体2D上SEQID No.4所示分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是GG且基因组中染色体5A上SEQ ID No.8所示分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是TT的纯合体，所述待测小麦具有矮秆密小穗抗赤霉病性状；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述(A1)(B1)(C1)具体操作为，

采用权利要求1-7任一所述的物质对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体2D上SEQ ID No.4所示的的第36位脱氧核糖核苷酸种类和所述待测小麦基因中染色体5A上SEQ ID No.8所示的的第36位脱氧核糖核苷酸种类；