CN111118041A

CN111118041A - 一种水稻类病斑spl36基因的突变体及其应用

Info

Publication number: CN111118041A
Application number: CN202010015083.7A
Authority: CN
Inventors: 郑燕梅; 张建福; 何炜; 朱永生; 连玲; 谢鸿光
Original assignee: Rice Research Institute Fujian Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute Fujian Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2020-01-07
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2040-01-07
Also published as: CN111118041B

Abstract

本发明公开了一种水稻类病斑SPL36基因的突变体及其应用。属于生物技术领域。本发明提供一种水稻类病斑SPL36基因的突变体在水稻抗白叶枯病中的应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。水稻类病斑SPL36基因点突变或敲除部分序列后会造成水稻出现类病斑表型。其类病斑性状受到光的诱导，并且基因突变后会提高水稻对白叶枯病的抗性，为水稻白叶枯病抗性育种和研究水稻细胞编程性死亡提供新的遗传资源。

Description

一种水稻类病斑SPL36基因的突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种水稻类病斑SPL36基因的突变体及其应用。

背景技术

植物类病斑突变体(lesion mimic mutant，lmm或spotted leaves mutants，spl)是一类在没有病原物存在的情况下，植株会自发形成类似病斑或过敏性坏死反应(HR)中的细胞死亡表型的突变体。常伴随酚类化合物的积累、胼胝质的沉积、活性氧中间产物的产生、防卫标记基因的表达以及激素水平的改变，导致植株抗病性发生改变。因此，类病斑材料也为研究细胞编程性死亡以及抗性通路的研究提供了一个很好的材料。

水稻是模式作物，也是我国重要的粮食作物。在过去的几十年，学者们对水稻类病斑突变体进行了大量的研究。水稻中已鉴定了超过60个类病斑基因，克隆了35个类病斑基因，这些已克隆的类病斑基因翻译的蛋白的功能是多样的，包括E3泛素连接酶、甲基转移酶、剪接因子、细胞色素P450单氧酶、酰基转移酶、热激转录因子、锌指蛋白、MAPKKK、蛋白激酶、网格蛋白、粪卟啉原Ⅲ氧化酶、双链RNA结合元件的蛋白、AAA-类型的ATP酶、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶、动力蛋白相关蛋白、组蛋白乙酰酶、真核翻译延伸因子等。这些类病斑基因编码蛋白的多样性也表明了类病斑发生的复杂性，这些基因参与了不同的通路影响着PCD的发生。对类病斑基因的挖掘，将丰富PCD发生过程的理论基础，并将其应用于抗性育种中。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种水稻类病斑SPL36基因的突变体及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种水稻类病斑SPL36基因的突变体在水稻抗白叶枯病中的应用，该突变体由水稻类病斑SPL36基因突变而得；

所述水稻类病斑SPL36基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述水稻类病斑SPL36基因的突变为在核苷酸序列SEQ ID NO.1的基础上进行如下任一突变：

(1)点突变：第821位碱基G替换成A，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)缺失突变：缺失第38～130位碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(3)缺失第38位碱基G，同时缺失第125～131位序列并替换为CAA，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(4)缺失第38位碱基G，同时第130位与131位碱基之间插入碱基G，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(5)第37位与第38位碱基之间插入碱基A，同时第130位与131位碱基之间插入碱基A，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

优选的，水稻类病斑SPL36基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

一种含有水稻类病斑SPL36基因的突变体的重组载体。

一种用于扩增水稻类病斑SPL36基因或其突变体的引物，所述引物的序列如下：

SPL36-F:ATGACGTCGACTTCGCCTGAA；SEQ ID NO.8；

SPL36-R:TCAACGCGCCGCCGGTGTGTC；SEQ ID NO.9。

一种利用引物扩增水稻类病斑SPL36基因或其突变体的方法，扩增的反应体系为：

2×KOD FX buffer 10μL、2mM dNTPs mix 4μL、10μM SPL36-F 0.6μL、DNA 2μL、10μM SPL36-R 0.6μL、KOD FX 0.4μL，ddH₂O加至20μL。

优选的，扩增的反应程序如下：

95℃3min；98℃15s，60℃15s，68℃60s，35个循环。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一个新的水稻类病斑基因，该水稻类病斑SPL36基因的突变会导致水稻出现类病斑表型，类病斑性状的产生受到光的诱导，类病斑的产生会提高水稻对白叶枯病抗性。该基因可应用于水稻抗白叶枯病机理研究以及抗性育种应用。探索该基因的功能及其可能参与的信号途径，将丰富植物产生PCD以及提高抗性的理论基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1野生型云引和突变体(mic)的表型结果，其中a为叶片、b为穗、c为叶鞘包裹的茎秆；

图2附图为本发明实施例2中受光诱导的突变体(mic)类病斑的症状，其中白色虚线部位为包裹区域，其余部位为未包裹区域，a为叶片、b为叶鞘包裹的茎秆；

图3是SPL36基因互补验证。其中A为互补表型鉴定；B为KO-1、KO-2、KO-3敲除植株SPL36基因PCR扩增电泳图；C为KO-1、KO-2、KO-3敲除植株SPL36基因测序结果。

图4附图为本发明实施例4中SPL36基因负调控水稻对白叶枯病菌的抗性结果，其中a为接种白叶枯病菌后的抗性表现，b为4-1-4敲除纯合植株SPL36基因突变位置，c为9-1-9敲除纯合植株SPL36基因突变位置。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种水稻类病斑SPL36基因的突变体及其应用。

本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，再此不再一一赘述。

实施例1

通过对粳稻广谱抗稻瘟病的材料云引进行EMS诱变，获得一个稳定遗传的、具有类病斑表型的突变体(mic)。该突变体类病斑的产生受到光的诱导，在铝箔覆盖遮光的情况下不产生类病斑。对类病斑基因进行遗传分析，通过突变体与野生型云引的杂交，确定该性状为一个隐性单基因控制。野生型云引和突变体(mic)的表型结果见图1。由图1可以看出，突变体(mic)在叶片、穗、穗枝梗、茎、叶鞘上出现类病斑，箭头显示谷粒、穗枝梗、茎上的类病斑。

以雷蒙特(Lemont)为母本，突变体(mic)为父本，进行杂交。F1代自交，构建突变体(mic)与雷蒙特(Lemont)的F2代定位群体，通过图位克隆的方法成功获得导致类病斑性状产生的基因LOC_Os07g46860(Os07g0663900)，该基因位于水稻第7染色体上，将该基因命名为spotted leaf 36(SPL36)。通过序列比对发现在突变体(mic)中该基因第821位碱基发生了替换(G821替换成A821)，导致氨基酸由甘氨酸(G)变成谷氨酸(E)。通过NCBI比对、RAP-DB网站上注释分析，SPL36基因属于短链脱氢酶/降解酶家族(SDRs)成员。

实施例2突变体(mic)的表型鉴定

突变体(mic)在大田情况下，苗期(5叶后)开始出现类病斑，随着水稻的生长，类病斑全株扩展(包括叶和茎杆)。

剪取3cm的铝箔纸在突变体(mic)未出现类病斑症状的时候，包裹叶片，20天后对包裹部位进行调查，结果如图2所示。图2结果表明，包裹部位不会产生类病斑，未包裹叶鞘的茎干显示有类病斑，包裹有叶鞘的茎干，将叶鞘剪去后，发现内部没有经过光照的茎干不产生类病斑。

由图2结果可知，突变体(mic)类病斑表型的产生受到光的影响。

实施例3水稻SPL36基因的克隆

通过CTAB法提取水稻DNA，利用引物SPL36-F/R扩增SPL36基因，引物序列：SPL36-F:ATGACGTCGACTTCGCCTGAA；SEQ ID NO.8；SPL36-R:TCAACGCGCCGCCGGTGTGTC；SEQ IDNO.9。所需反应体系如表1所示：

表1 PCR反应体系

反应物	体积(μL)
		2×KOD FX buffer	10
dNTPs mix(2mM each)	4
		SPL36-F(10μM)	0.6
SPL36-R(10μM)	0.6
		DNA	2
KOD FX	0.4
		ddH<sub>2</sub>O	加至20

按以下程序进行PCR扩增：95℃3min(预变性)；98℃15s(变性)，60℃15s(复性)，68℃60s(延伸)，所述变性-复性-延伸35个循环。

图3为SPL36基因互补验证。其中，云引为野生型；mic为突变体；OE-1为以SPL36基因自身的启动子加上SPL36基因编码区构建的过表达材料PSPL36::SPL36；OE-2为花椰菜35S启动子加上SPL36基因的编码区构建的过表达材料P35S::SPL36；KO-1,KO-2,KO-3为3个TO代CRISPR/cas9转基因敲除植株。敲除材料的构建采用Xing et al.,2014中提到的载体pCBC-MT1T2和pHUE411。登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/ CRISPRsearch.html，筛选SPL36基因的敲除位点，设计引物46860-CR-F:AATAATGGTCTCTGGCGTTCCTGATGAACTCCGCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；SEQ ID NO.10；46860-CR-R：ATTATTGGTCTCTAAACGTGGATTCTCCACGGCGGCGGCTTCTTGGTGCC-3’；SEQ ID NO.11，以pCBC-MT1T2为模板进行扩增，导入载体pHUE411，测序验证后进行农杆菌转化野生型材料云引。

实施例4水稻类病斑SPL36基因的突变体负调控水稻对白叶枯病菌GD8988的抗性实验

用YEB培养基(蔗糖5g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，2％琼脂，pH值为7.2～7.4，1L)培养白叶枯病菌GD8988(由广东农科院提供)，用灭菌水将白叶枯菌GD8988洗下后，OD₆₀₀＝0.5，分别接种云引野生型水稻、突变体(mic)以及SPL36基因敲除纯合材料的完全展开的叶片。

通过OsU3-FD3：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC；SEQ ID NO.12；TaU3-FD2：TTGACTAGCGTGCTGATAATTTGTG；SEQ ID NO.13；引物PCR检测无转基因成分的材料，并对材料的SPL36基因用上述的SPL36-F/R引物扩增测序，筛选获得纯合突变体4-1-4材料和9-1-9材料。

4-1-4为T1代SPL36基因敲除纯合植株；9-1-9为T1代SPL36基因敲除纯合植株。15天后调查统计，结果如图4所示。

图4表明突变体(mic)和SPL36基因敲除纯合材料提高了对白叶枯菌的抗性。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院水稻研究所

<120> 一种水稻类病斑SPL36基因的突变体及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacgtcga cttcgcctga aagtctaatc gccggtggat tctccacggc ggcgagctcc 60

caccagaggt tggccggcaa ggtggccgtc atcaccggcg ccgccagcgg catcggcaag 120

gcgaccgccg cggagttcat caggaacggc gccaaggtga tcatcaccga cgtcaacgac 180

gacctcggcc acgccgcggc ggcggagctc ggcccggacg ccacgtacgc gcgctgcgac 240

gtcgccgacg aggcgcaggt cgccgccgcc gtcgacctcg ccgtggcgcg ccacggccgc 300

ctcgacgtca tgcacaacaa cgccgccatc ccggggaggt tcccgcagga cgacatggcg 360

tccgtcgacc tcgccgactt cgacgccatg atggcggtga acgcccgcgc gtcgctcgcc 420

ggcatcaagc acgccgcgcg cgtcatggcg ccccgccgcg ccggcgtcat cctctgcacg 480

gccagcgccg tcggcgtcct cccgctcccg gcggtcgcca cgcactccat caccaaggcc 540

accatcatcg ccatcgtgcg cgcagcggcg gagcccctgg cgcgccacgg cctgcgggtg 600

aacgccatct cgccgggcgc cgtcaggacg ccggtcctgc agggcaaggt gtcggtgatg 660

tcggcgtcgt ctcctaccat gagcgacgag ctgaagcaga tgatcgacgt cgacgcgaac 720

gacatgatga tggggccgga ggaggtggcc atggcggcgg tgtacctcgc ctccgacgag 780

gccaggtacg tgaccggcca caacctcgtc gtcgacggcg ggtacaccgt gcacaaagga 840

gctgacacac cggcggcgcg ttga 864

<210> 2

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgacgtcga cttcgcctga aagtctaatc gccggtggat tctccacggc ggcgagctcc 60

caccagaggt tggccggcaa ggtggccgtc atcaccggcg ccgccagcgg catcggcaag 120

gcgaccgccg cggagttcat caggaacggc gccaaggtga tcatcaccga cgtcaacgac 180

gacctcggcc acgccgcggc ggcggagctc ggcccggacg ccacgtacgc gcgctgcgac 240

gtcgccgacg aggcgcaggt cgccgccgcc gtcgacctcg ccgtggcgcg ccacggccgc 300

ctcgacgtca tgcacaacaa cgccgccatc ccggggaggt tcccgcagga cgacatggcg 360

tccgtcgacc tcgccgactt cgacgccatg atggcggtga acgcccgcgc gtcgctcgcc 420

ggcatcaagc acgccgcgcg cgtcatggcg ccccgccgcg ccggcgtcat cctctgcacg 480

gccagcgccg tcggcgtcct cccgctcccg gcggtcgcca cgcactccat caccaaggcc 540

accatcatcg ccatcgtgcg cgcagcggcg gagcccctgg cgcgccacgg cctgcgggtg 600

aacgccatct cgccgggcgc cgtcaggacg ccggtcctgc agggcaaggt gtcggtgatg 660

tcggcgtcgt ctcctaccat gagcgacgag ctgaagcaga tgatcgacgt cgacgcgaac 720

gacatgatga tggggccgga ggaggtggcc atggcggcgg tgtacctcgc ctccgacgag 780

gccaggtacg tgaccggcca caacctcgtc gtcgacggcg agtacaccgt gcacaaagga 840

gctgacacac cggcggcgcg ttga 864

<210> 3

<211> 771

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgacgtcga cttcgcctga aagtctaatc gccggtgcgg agttcatcag gaacggcgcc 60

aaggtgatca tcaccgacgt caacgacgac ctcggccacg ccgcggcggc ggagctcggc 120

ccggacgcca cgtacgcgcg ctgcgacgtc gccgacgagg cgcaggtcgc cgccgccgtc 180

gacctcgccg tggcgcgcca cggccgcctc gacgtcatgc acaacaacgc cgccatcccg 240

gggaggttcc cgcaggacga catggcgtcc gtcgacctcg ccgacttcga cgccatgatg 300

gcggtgaacg cccgcgcgtc gctcgccggc atcaagcacg ccgcgcgcgt catggcgccc 360

cgccgcgccg gcgtcatcct ctgcacggcc agcgccgtcg gcgtcctccc gctcccggcg 420

gtcgccacgc actccatcac caaggccacc atcatcgcca tcgtgcgcgc agcggcggag 480

cccctggcgc gccacggcct gcgggtgaac gccatctcgc cgggcgccgt caggacgccg 540

gtcctgcagg gcaaggtgtc ggtgatgtcg gcgtcgtctc ctaccatgag cgacgagctg 600

aagcagatga tcgacgtcga cgcgaacgac atgatgatgg ggccggagga ggtggccatg 660

gcggcggtgt acctcgcctc cgacgaggcc aggtacgtga ccggccacaa cctcgtcgtc 720

gacggcgggt acaccgtgca caaaggagct gacacaccgg cggcgcgttg a 771

<210> 4

<211> 859

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgacgtcga cttcgcctga aagtctaatc gccggtgatt ctccacggcg gcgagctccc 60

accagaggtt ggccggcaag gtggccgtca tcaccggcgc cgccagcggc atcggcaagg 120

cgacaaggag ttcatcagga acggcgccaa ggtgatcatc accgacgtca acgacgacct 180

cggccacgcc gcggcggcgg agctcggccc ggacgccacg tacgcgcgct gcgacgtcgc 240

cgacgaggcg caggtcgccg ccgccgtcga cctcgccgtg gcgcgccacg gccgcctcga 300

cgtcatgcac aacaacgccg ccatcccggg gaggttcccg caggacgaca tggcgtccgt 360

cgacctcgcc gacttcgacg ccatgatggc ggtgaacgcc cgcgcgtcgc tcgccggcat 420

caagcacgcc gcgcgcgtca tggcgccccg ccgcgccggc gtcatcctct gcacggccag 480

cgccgtcggc gtcctcccgc tcccggcggt cgccacgcac tccatcacca aggccaccat 540

catcgccatc gtgcgcgcag cggcggagcc cctggcgcgc cacggcctgc gggtgaacgc 600

catctcgccg ggcgccgtca ggacgccggt cctgcagggc aaggtgtcgg tgatgtcggc 660

gtcgtctcct accatgagcg acgagctgaa gcagatgatc gacgtcgacg cgaacgacat 720

gatgatgggg ccggaggagg tggccatggc ggcggtgtac ctcgcctccg acgaggccag 780

gtacgtgacc ggccacaacc tcgtcgtcga cggcgggtac accgtgcaca aaggagctga 840

cacaccggcg gcgcgttga 859

<210> 5

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgacgtcga cttcgcctga aagtctaatc gccggtgatt ctccacggcg gcgagctccc 60

accagaggtt ggccggcaag gtggccgtca tcaccggcgc cgccagcggc atcggcaagg 120

cgaccgccgg cggagttcat caggaacggc gccaaggtga tcatcaccga cgtcaacgac 180

gacctcggcc acgccgcggc ggcggagctc ggcccggacg ccacgtacgc gcgctgcgac 240

gtcgccgacg aggcgcaggt cgccgccgcc gtcgacctcg ccgtggcgcg ccacggccgc 300

ctcgacgtca tgcacaacaa cgccgccatc ccggggaggt tcccgcagga cgacatggcg 360

tccgtcgacc tcgccgactt cgacgccatg atggcggtga acgcccgcgc gtcgctcgcc 420

ggcatcaagc acgccgcgcg cgtcatggcg ccccgccgcg ccggcgtcat cctctgcacg 480

gccagcgccg tcggcgtcct cccgctcccg gcggtcgcca cgcactccat caccaaggcc 540

accatcatcg ccatcgtgcg cgcagcggcg gagcccctgg cgcgccacgg cctgcgggtg 600

aacgccatct cgccgggcgc cgtcaggacg ccggtcctgc agggcaaggt gtcggtgatg 660

tcggcgtcgt ctcctaccat gagcgacgag ctgaagcaga tgatcgacgt cgacgcgaac 720

gacatgatga tggggccgga ggaggtggcc atggcggcgg tgtacctcgc ctccgacgag 780

gccaggtacg tgaccggcca caacctcgtc gtcgacggcg ggtacaccgt gcacaaagga 840

gctgacacac cggcggcgcg ttga 864

<210> 6

<211> 866

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgacgtcga cttcgcctga aagtctaatc gccggtgaga ttctccacgg cggcgagctc 60

ccaccagagg ttggccggca aggtggccgt catcaccggc gccgccagcg gcatcggcaa 120

ggcgaccgcc gacggagttc atcaggaacg gcgccaaggt gatcatcacc gacgtcaacg 180

acgacctcgg ccacgccgcg gcggcggagc tcggcccgga cgccacgtac gcgcgctgcg 240

acgtcgccga cgaggcgcag gtcgccgccg ccgtcgacct cgccgtggcg cgccacggcc 300

gcctcgacgt catgcacaac aacgccgcca tcccggggag gttcccgcag gacgacatgg 360

cgtccgtcga cctcgccgac ttcgacgcca tgatggcggt gaacgcccgc gcgtcgctcg 420

ccggcatcaa gcacgccgcg cgcgtcatgg cgccccgccg cgccggcgtc atcctctgca 480

cggccagcgc cgtcggcgtc ctcccgctcc cggcggtcgc cacgcactcc atcaccaagg 540

ccaccatcat cgccatcgtg cgcgcagcgg cggagcccct ggcgcgccac ggcctgcggg 600

tgaacgccat ctcgccgggc gccgtcagga cgccggtcct gcagggcaag gtgtcggtga 660

tgtcggcgtc gtctcctacc atgagcgacg agctgaagca gatgatcgac gtcgacgcga 720

acgacatgat gatggggccg gaggaggtgg ccatggcggc ggtgtacctc gcctccgacg 780

aggccaggta cgtgaccggc cacaacctcg tcgtcgacgg cgggtacacc gtgcacaaag 840

gagctgacac accggcggcg cgttga 866

<210> 7

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Thr Ser Thr Ser Pro Glu Ser Leu Ile Ala Gly Gly Phe Ser Thr

1 5 10 15

Ala Ala Ser Ser His Gln Arg Leu Ala Gly Lys Val Ala Val Ile Thr

20 25 30

Gly Ala Ala Ser Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Ala Glu Phe Ile Arg

35 40 45

Asn Gly Ala Lys Val Ile Ile Thr Asp Val Asn Asp Asp Leu Gly His

50 55 60

Ala Ala Ala Ala Glu Leu Gly Pro Asp Ala Thr Tyr Ala Arg Cys Asp

65 70 75 80

Val Ala Asp Glu Ala Gln Val Ala Ala Ala Val Asp Leu Ala Val Ala

85 90 95

Arg His Gly Arg Leu Asp Val Met His Asn Asn Ala Ala Ile Pro Gly

100 105 110

Arg Phe Pro Gln Asp Asp Met Ala Ser Val Asp Leu Ala Asp Phe Asp

115 120 125

Ala Met Met Ala Val Asn Ala Arg Ala Ser Leu Ala Gly Ile Lys His

130 135 140

Ala Ala Arg Val Met Ala Pro Arg Arg Ala Gly Val Ile Leu Cys Thr

145 150 155 160

Ala Ser Ala Val Gly Val Leu Pro Leu Pro Ala Val Ala Thr His Ser

165 170 175

Ile Thr Lys Ala Thr Ile Ile Ala Ile Val Arg Ala Ala Ala Glu Pro

180 185 190

Leu Ala Arg His Gly Leu Arg Val Asn Ala Ile Ser Pro Gly Ala Val

195 200 205

Arg Thr Pro Val Leu Gln Gly Lys Val Ser Val Met Ser Ala Ser Ser

210 215 220

Pro Thr Met Ser Asp Glu Leu Lys Gln Met Ile Asp Val Asp Ala Asn

225 230 235 240

Asp Met Met Met Gly Pro Glu Glu Val Ala Met Ala Ala Val Tyr Leu

245 250 255

Ala Ser Asp Glu Ala Arg Tyr Val Thr Gly His Asn Leu Val Val Asp

260 265 270

Gly Gly Tyr Thr Val His Lys Gly Ala Asp Thr Pro Ala Ala Arg

275 280 285

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgacgtcga cttcgcctga a 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcaacgcgcc gccggtgtgt c 21

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aataatggtc tctggcgttc ctgatgaact ccgcgggttt tagagctaga aatagc 56

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

attattggtc tctaaacgtg gattctccac ggcggcggct tcttggtgcc 50

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacaggcgtc ttctactggt gctac 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttgactagcg tgctgataat ttgtg 25

Claims

1.一种水稻类病斑SPL36基因的突变体在水稻抗白叶枯病中的应用，该突变体由水稻类病斑SPL36基因突变而得；

所述水稻类病斑SPL36基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻类病斑SPL36基因的突变体为在核苷酸序列SEQ ID NO.1的基础上进行如下任一突变：

(3)缺失第38位碱基G，同时缺失第125～131位序列并替换为CAA，核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；

(4)缺失第38位碱基G，同时第130位与131位碱基之间插入碱基G，核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；

3.一种如权利要求1所述的应用，其特征在于，水稻类病斑SPL36基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.一种含有权利要求2所述的水稻类病斑SPL36基因的突变体的重组载体。

5.一种用于扩增如权利要求1所述水稻类病斑SPL36基因或其突变体的引物，其特征在于，所述引物的序列如下：

SPL36-F:ATGACGTCGACTTCGCCTGAA；SEQ ID NO.8；

SPL36-R:TCAACGCGCCGCCGGTGTGTC；SEQ ID NO.9。

6.一种利用权利要求5所述引物扩增水稻类病斑SPL36基因或其突变体的方法，其特征在于，扩增的反应体系为：

2×KOD FX buffer 10μL、2mM dNTPs mix 4μL、10μM SPL36-F 0.6μL、DNA2μL、10μMSPL36-R 0.6μL、KOD FX 0.4μL，ddH₂O加至20μL。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，扩增的反应程序如下：

95℃3min；98℃15s，60℃15s，68℃60s，35个循环。