CN107523574A - 调控细胞程序化死亡与抗病性的水稻类病斑基因spl35及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控细胞程序化死亡和抗病性的水稻类病斑基因SPL35及其编码蛋白与应用。本发明以水稻类病斑突变体spl35为实验材料，通过TAIL‑PCR技术和图位克隆策略分离到一个控制水稻类病斑性状的基因SPL35，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其所编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。本发明初步解析了SPL35基因的生物学功能，为阐明植物程序化细胞死亡机制提供了理论依据；特别地，通过基因工程或常规手段将该基因突变位点导入植物，可以显著增强抗病性，在植物抗病品种培育方面具有重要应用价值。

Description

调控细胞程序化死亡与抗病性的水稻类病斑基因SPL35及其 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一个调控水稻细胞程序化死亡与抗病性的基因SPL35编码区的分离及其应用。

背景技术

植物为应对病原菌侵染进化出多种防卫机制。过敏反应(Hypersensitiveresponse，HR)是植物在遭受病原菌侵染后，其被侵染部位或周围细胞迅速死亡而形成坏死斑，进而限制病原菌进一步侵染和繁殖的一种防御反应。HR是一种典型的细胞程序化死亡(Programmed cell death，PCD)过程，通常伴随着活性氧迸发、自由基产生、病程相关(Pathogenesis-related)基因诱导表达、抗菌物质积累及胼胝质沉积与细胞壁增厚等生理过程。尽管HR对寄主抗病性起到重要作用，但其分子机理尚不明晰。

植物类病斑突变体(Lession mimic mutant)是指在未遭受明显的逆境胁迫、机械损伤或病原菌侵染时，植物体自发产生类似过敏反应的坏死斑的一类突变体，是研究植物HR介导的PCD和抗病性机制的重要实验材料。目前已在拟南芥、玉米和水稻等植物中鉴定出一批类病斑突变体，并克隆出20多个水稻类病斑基因。这些基因编码多种类型的蛋白，包括膜相关蛋白、离子通道蛋白、锌指蛋白、转录因子、E3泛素连接酶、卟啉、氧化还原酶、蛋白激酶、网格蛋白相关的衔接蛋白、NBS-LRR类蛋白、剪切因子、AAA类ATP酶，以及参与脂肪酸或脂类及酚类物质合成与代谢的蛋白等。鉴定新的类病变突变体及其突变基因，对于全面揭示植物HR介导的PCD及抗病防卫通路具有重要的意义。

目前水稻育种面临抗源匮乏局面，尤其缺乏广谱、持久抗性的遗传资源。一些水稻类病变突变体对多个病害表现广谱或非专化抗性，为培育广谱持久抗病品种开辟了一条新的途径。

发明内容

为深入解析植物体HR介导细胞死亡和抗病防卫反应的分子机制，发明人从水稻品种Kinmaze的T-DNA插入突变体中分离和鉴定了一个新的水稻类病变突变体，并暂命名为spl35(spotted leaf 35)。该突变体表现斑点叶和对稻瘟病和白叶枯病抗性增强。通过TAIL-PCR和图位克隆策略获得SPL35基因，它编码一个含有CUE(coupling of ubiquitinconjugation to endoplasmic reticulum(ER)degradation)结构域的功能未知的蛋白。该基因在所有被检测的组织和器官及发育时期组成性表达。突变体产生类病斑后诱导防御反应相关基因显著上调表达，即激活了植物自身的防卫反应，进而显著增强了对病原菌的抗性。

因此，本申请鉴定了一个新的水稻类病斑突变体并克隆了控制该性状的目标基因SPL35，该基因编码一个包含CUE结构域的，其突变引起细胞程序化死亡，并显著增强对真菌病害(稻瘟病)和细菌病害(稻白叶枯病)，为研究PCD和防卫反应形成机制及培育广谱持久抗病水稻品种准备了有用材料。

对此，本发明首先是提供一种调控类似过敏性反应的细胞死亡及防卫反应的基因SPL35，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一目的是提供上述基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的第三目的是提供含有上述基因的重组载体。

本发明的第四目的是提供上述基因、蛋白及重组载体在提高水稻抗病性上的用途。上述基因或蛋白突变能调控水稻细胞程序化死亡和抗病防卫反应，利用上述基因或蛋白可以改良水稻对稻瘟病和稻白叶枯病的抗性。

本发明的第五目的是提供利用上述基因或蛋白培育抗病作物品种的方法。通过基因工程手段在目标植物中干扰或敲除上述基因或蛋白，均可使目的植物显著增强对真菌和细菌病害的抗性。利用携带SPL35突变基因的水稻材料，通过杂交、回交和分子标记辅助选择手段，将该突变基因导入到其他水稻材料，也可以显著提高其他水稻材料对真菌和细菌病害的抗性。

为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明从野生型Fujisaka 5的T-DNA插入突变群体中鉴定出一个新的类病斑突变体，并命名为spl35。该突变体从3叶期开始，最下部叶片叶尖开始出现类病斑的表型，并逐渐扩展至整个叶片至全株，呈现程序化细胞死亡特征。突变体spl35产生过量过氧化氢(H₂O₂)，一些防御相关基因如OsPR1b、OsPR5、OsPBZ1等的表达被显著上调，并显著增强对水稻稻瘟病和白叶枯病的抗性。利用TAIL-PCR技术及图位克隆策略分离了控制类病斑表型的基因LOC_Os03g10750，通过功能互补实验证实LOC_Os03g10750即为控制类病斑形成的目标基因SPL35。进一步研究表明，在水稻中干扰SPL35均会诱发类病斑。荧光定量PCR分析表明，SPL35基因是一个组成性表达的基因，在各组织器官中均有表达。应用突变体spl35及其目标突变基因有助于培育广谱持久抗病的水稻新材料和新品种。

本发明具有如下明显的有益效果：

本发明初步解析了SPL35基因的生物学功能，为阐明植物程序化细胞死亡机制提供了理论依据。利用水稻类病斑突变体spl35及SPL35突变基因，通过常规杂交、分子标记辅助选择或遗传工程等手段将SPL35的突变基因引入水稻，可以显著增强水稻对真菌病害(如稻瘟病等)及细菌病害(如稻白叶枯病等)的抗性。本发明对进一步阐明植物PCD及抗病防卫反应的分子机理及培育广谱持久抗病品种具有重要的理论和应用价值。

附图说明

图1为野生型和突变体spl35表型比较，其中，(a)和(b)为野生型和突变体3叶期田间表型；(c)为突变体类病斑逐渐扩展表型；(d)为突变体用锡箔纸遮光后7天和14天表型；(e)为野生型和突变体分蘖期田间表型；(f)为野生型和突变体抽穗后30天的田间表型。

图2为野生型和突变体叶绿素含量比较，其中，(a)为叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)、叶绿素a和b(Chl a+b)、和类胡萝卜素(Carotenoids)含量；(b)为野生型和突变体的离体叶片暗处理表型。Pre-WT代表暗处理前的野生型；Dark-WT代表暗处理后的野生型；Pre-spl35-代表暗处理前出现类病斑的突变体；Pre-spl35+代表暗处理后出类病斑的突变体；Dark-spl35-代表暗处理后未出现类病斑的突变体；Dark-spl35+代表暗处理后出现类病斑的突变体。

图3为野生型和突变体叶绿体的超微结构观察，其中，(a)为野生型；(b)为未出现类病斑的突变体；(c)为已出现类病斑的突变体。

图4为野生型和突变体细胞死亡和H₂O₂含量测定。其中，(a)为台盼蓝染色结果；(b)为DAB染色结果；(c)为H₂O₂含量的定量测定结果。

图5为防御相关基因的表达分析和抗病性鉴定，其中，(a)为防御相关基因的qRT-PCR分析；(b)为稻瘟病菌抗性鉴定；(c)为稻白叶枯菌抗性鉴定；(d)为稻白叶枯菌侵染14天后平均病斑长度，数据表示10个生物学重复的平均值±标准差SD(*P<0.05,**P<0.01；Student’s t test)。

图6为spl35突变体的分子鉴定，其中，(a)为spl35突变体的T-DNA插入位点；(b)为SPL35基因定位的物理图谱；(c)为T-DNA插入位点侧翼序列验证；(d)为T-DNA拷贝数Southern blot分析；(e)为T-DNA插入位点上下游基因的表达分析；(f)为LOC_Os03g10750基因的RT-PCR验证。

图7为spl35基因的功能互补，其中(a)为野生型，spl35突变体和互补植株(spl35-C)的表型；(b)为a中植株叶片的放大和转基因植株的T17-F/R(上)和NPTII-F/R(下)标记检测。

图8为SPL35编码蛋白的结构域预测。

图9为SPL35基因的RNAi分析，其中，(a)为RNAi转基因植株的SPL35基因表达量；(b)为RNAi转基因植株的叶片表型；(c)为RNAi转基因植株的整株表型。

具体实施方式

以下实施例仅对本发明做进一步说明，并不限制本发明。实施例中如无特殊说明，所采用的实验方法，均为常规方法；所用的实验材料、试剂等，均可通过商业途径得到。

实施例1：突变体的获得及其表型

将植物表达载体pCUbi1390转化到农杆菌EHA105中，以农杆菌介导法转化粳稻品种Kiname(金南风)创制了一些T-DNA插入突变体。从T₁代突变株系T466中鉴定出一个类病斑突变体并命名为spl35。该突变体在3～4叶期时，在第一片叶片上始现少量不规则的褐色斑点，随后斑点逐渐增多面积变大布满整个叶片，呈现类病斑表型。随着植株生长，褐色斑点出现在各叶片和叶鞘上，在成熟期斑点遍及整个植株(图1)。在突变体spl35叶片未出现病斑时，将部分叶片用锡箔纸遮住，则该部位就不会出现病斑；叶片产生少量病斑后再遮住，病斑大小和密度则不会增加；即使在褐色斑点布满整个叶片时，遮光部位由于缺少光合产物而呈现黄色，但未现褐色斑点，表明该类病斑的产生受光照调节(图1d)。另外，将突变体spl35种植在23℃、30℃(光照)/25℃(黑暗)、30℃(光周期：13h光照/11h黑暗)培养箱中，突变体的叶片都会产生类病斑，表明该类病斑的产生受温度影响不明显。

实施例2：野生型和突变体的农艺性状考查

在北京正季种植野生型Kinmaze和突变体spl35，农艺性状考查发现，与野生型相比，突变体的株高、结实率和千粒重极显著降低，每穗粒数和有效穗数显著减少(表1)。

表1 野生型Kinmaze和突变体spl35的主要农艺性状比较

*和**分别表示突变体与野生型相比在P<0.05和P<0.01水平上差异显著性。

实施例3：突变体和野生型的叶绿素含量测定

选取抽穗后10天左右的野生型和突变体(分出现类病斑部分和未出现类病斑部分)叶片，直接提取并计算叶绿素含量；或者将叶片剪成1～2cm左右的片段置于直径10cm中的无菌水中，黑暗处理5天，处理完毕后提取并计算叶绿素含量。提取步骤：取0.1g左右新鲜叶片并剪碎置于10ml离心管中，加入5ml 95％无水乙醇离心10min，使叶片完全进入液体中，然后避光抽提48h，吸取200μl抽提液用分光光度计测定665nm、649nm和470nm处的吸光度值，并计算叶绿素含量。结果发现，突变体在出现类病斑表型以后，叶绿素a和b以及类胡萝卜素含量比野生型显著下降；经过暗诱导以后，突变体产生类病斑后的离体叶片更容易衰老发黄，其叶绿素a和b以及类胡萝卜素含量显著降低(图2)。

实施例4：叶绿体超微结构观察

对野生型、未出现类病斑和已出现类病斑的突变体叶片通过透射电镜对叶绿体的超微进行了观察。新鲜叶片样品剪成1～2mm小块置于含2.5％戊二醛的pH7.2磷酸缓冲液中固定，抽真空使样品完全浸入固定液，4℃固定4h。样品用pH 7.2磷酸缓冲液清洗几次，固定在含有1％OsO₄的pH7.2磷酸缓冲液中。再经乙醇梯度脱水后，将样品浸透和包埋在Spurr树脂中。树脂中样品经超微切片机切片，切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。制作好的切片在H-7650透射电子显微镜下观察。电镜观察发现，野生型的叶绿体发育完全，叶绿体膜、类囊体膜完整，清晰可见整齐堆积的基粒(图3a)；未出现类病斑的突变体中叶绿体已发生降解，类囊体膜紊乱和基粒异常(图3b)；而出现类病斑的叶肉细胞中的叶绿体细胞内含物已经大部分消失，叶绿体严重降解、皱缩，很难看出类囊体膜(图3c)。

实施例5：突变体和野生型的细胞死亡和H₂O₂含量测定

台盼蓝染色是检测细胞死亡和细胞膜不可逆性破坏的一种重要的组织学方法。分别取突变体spl35和野生型叶片被台盼蓝染色后，突变体中类病斑处的细胞有深蓝色着色点，表明该部位的细胞已经死亡或正在死亡的进程中，而其野生型亲本的叶片上无着色点(图4a)。植物在受到胁迫情况下会产生大量的H₂O₂，DAB染色可以在细胞水平上检测H₂O₂的产生。突变体spl35和野生型的叶片进行DAB染色后，突变体叶片上有H₂O₂褐色沉积斑产生，而野生型没有(图4b)，表明突变体中产生了大量的H₂O₂。利用H₂O₂试剂盒对对突变体spl35和野生型的叶片中H₂O₂含量进行测定，结果表明，突变体未出现类病斑叶片中产生的H₂O₂量大约是野生型的1.5倍，出现类病斑后叶片中产生的H₂O₂量大约为野生型的2倍(图4c)。

实施例6：防御相关基因的表达和抗性鉴定

为了检测突体是否激活了防御反应，利用qRT-PCR方法检测了一些不同抗性信号通路上基因的表达水。利用天漠公司的ZR Plant RNA MiniPrep^TM Kit分别提取30天左右野生型、突变体产生类病斑前(spl35-)和突变体产生类病斑后(spl35+)叶片的总RNA，取5μg左右RNA利用北京全式金公司的One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix kit合成cDNA第一链。利用ABI的7500real-time PCR System仪器进行qRT-PCR实验，以水稻ubiquitin基因作为内参，qRT-PCR引物见表2。结果发现，突变体产生类病斑后显著诱导了抗性相关基因的表达，其PR基因OsPR1b、OsPR5、OsPBZ1，SA途径基因OsPAL、OsCHS，JA途径基因OsAOS2、OsLOX，及ET途径基因OsACS的表达都显著上调(图5a)，这表明类病斑的产生激活了植物自身的防卫反应。

利用2个稻瘟病菌株CH43和CH680分别在分蘖期注射接种野生型和突变体spl35，发现野生型极端感病而突变体未出现病斑，这显示突变体增强了对稻瘟病的抗性(图5b)。利用4个稻白叶枯病菌株PXO61、PXO86、PXO79和PXO71剪叶接种野生型和突变体，结果突变体叶片的病斑长度明显缩短，抗性明显优于野生型(图5c和5d)。这些结果表明突变体既显著提高对真菌病害的抗性，也显著提高对细菌病害的抗性，因而表现出广谱抗性特点。

表2 防御相关基因qRT-PCR引物

实施例7：SPL35基因的鉴定和分离

对上述实施例1中所获得的突变体spl35进行遗传分析，结果发现类病斑的表型与潮霉素鉴定标记Hyr-F/R(表4)共分离，受单个隐性基因控制(表3)。以被地高辛标记后的Hyg-F/R扩增产物为探针，以被限制性内切酶HindIII酶解后的野生型和突变体基因组DNA为模板进行Sourthern杂交，结果显示在突变体含有一个单拷贝的T-DNA插入片段(图6d)。根据载体的边界序列，利用在线设计软件设计了3条特异嵌套引物作为下游引物，利用TaKaRa公司Genome walking kit中的TAIL-PCR方法分离T-DNA插入位点的侧翼序列，并对第三轮扩增所获得的一个750bp左右的PCR片段进行测序和BLAST分析，结果显示T-DNA插入位点位于3号染色体短臂，距离基因LOC_Os03g10740起始密码子上游948bp，距离基因LOC_Os03g10750终止密码子下游458bp(图6a)。用标记T17-F/R、T18-F/R和T17-F/T18-R(表4)对T-DNA扩增，结果验证了T-DNA插入位点(图6c和6d)。以突变体spl35为母本，93-11为父本配制杂交组合，在其杂交F₂群体中选取280个类病斑单株，利用6个InDel标记将SPL35突变基因定位在3号染色体短臂标记ID3-10(物理位置：4894747)和ID3-11(物理位置：5654369)之间(图6b)。进一步，设计特异性引物(表4)对插入位点附近的2个基因LOC_Os03g10740和LOC_Os03g10750进行qRT-PCR分析，结果所示，T-DNA插入导致LOC_Os03g10750基因的表达量严重下调(图6e和6f)。因此，将LOC_Os03g10750确定为目标基因的候选基因。

表3 突变体的类病斑性状遗传分析

表4 Spl35基因分离引物

实施例8：SPL35基因功能互补验证

根据日本晴参考序列，通过引物设计软件设计LOC_Os03g10750基因的特异性引物(03g10750-Com-F：ATGATTACGAATTCGAGCTCAGTTTTGCTGTAGTGCTAGTTGTTC；03g10750-Com-R：ATGCCTGCAGGTCGACTTGTTAGAACGTAACTCTCCTGTGT，下划线部分为用于连接的重组序列)。通过高保真KOD酶(TOYOBO)用PCR方法扩增候选基因全长，经测序确定候选基因片段8,729bp，包含自身启动子区2,369bp、全部编码区5,507bp和终止序列853bp(SEQ ID NO.1)。利用ClonetechPCR Cloning system(TaKaRa)对纯化后的PCR产物连接到经用SacI/SalI酶切并纯化回收的pCAMBIA2300载体上，并转入大肠杆菌Trans10(TransGen Biotech)中保存。将经酶切验证的阳性质粒测序。将经测序验证序列正确的阳性克隆质粒，通过电击法转入农杆菌菌株EHA105中，而后通过农杆菌介导侵染突变体spl35愈伤组织。转基因互补实验结果显示，转基因T₀代植株恢复了正常表型(图7a)。提取转基因植株DNA，并利用引物T17-F(CCGTACACCCAGAAAACCGA)和T17-R(ACTGTCGGGCGTACACAAAT)以及新霉素磷酸转移酶基因引物NPT-F(ATGCGATGTTTCGCTTGGTG)和NPT-R(CAGACAATCGGCTGCTCTGA)鉴定，结果显示互补植株可以扩增出特异条带(图7b)。这些结果表明，基因LOC_Os03g10750能够成功互补突变体的类病斑表型，因而据此确定LOC_Os03g10750为目标基因SPL35。

SPL35基因编码一个包含927个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO.2)，其分子量为101.95 KD,pI为6.65。经SMART软件预测(http://smart.embl-heidelberg.de)，该蛋白含有一个CUE[Coupling of Ubiquitin conjugation to Endoplasmic reticulum(ER)degradation]结构域(图8)。目前该类型蛋白的生物学功能在水稻中尚未见报道。

实施例9：SPL35基因RNAi植株的获得及功能鉴定

为构建SPL35基因的RNAi载体，通过序列比对，将SPL35基因中一段特异的序列(SEQ ID NO.3)整合到Ubiquitin启动子驱动的RNAi干涉载体pLH-FAD1390RNAi中，构建反向遗传转化载体。利用SacI酶酶切质粒pLH-FAD1390RNAi，纯化后回收备用。利用引物SPL35-R1-F：TTCTGCACTAGGTACCAGGCCTGGAGTTGAGGAACTACTGAACACTCT和SPL35-R1-R：CTGACGTAGGGGCGATAGAGCTCTCATAGGATCTTCGACTTTAGCTGG(下划线部分为接头序列)扩增得到一个279bp片段，纯化并回收。利用Clonetech PCR Cloning system(TaKaRa)将PCR片段重组到SacI酶切后的质粒pLH-FAD1390RNAi上，得到中间重组质粒，经测序，将正确重组质粒命名为Spl35-RNAi1。利用引物SPL35-R2-F：CGGGGATCCGTCGACTACGAGTTGAGGAACTACTGAACACTCT和引物SPL35-R2-R：AGGTGGAAGACGCGTTACTCATAGGATCTTCGACTTTAGCTGG(下划线部分为对应的载体重组序列)扩增上述279bp的反向连接序列，纯化并回收后重组到SnaBI酶切后质粒SPL35-RNAi1中，构建SPL35-RNAi2质粒，经测序挑选正确克隆并提取质粒。将正确的SPL35-RNAi2质粒通过农杆菌介导方法转化水稻品种Kitaake愈伤组织而获得转基因植株。经潮霉素标记Hyr-F/R(表4)鉴定，获得15个T₀代阳性RNAi植株，其中12株出现了类病斑的表型。对5个类病斑植株衍生的T₁家系利用引物q03g10750-F/R(表4)进行qRT-PCR分析，结果表明这5个T₁家系中SPL35基因的表达明显下调(图9a)，而且SPL35基因被RNAi能引发与突变体spl35类似的类病斑表型(图9b和9c)。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 调控细胞程序化死亡与抗病性的水稻类病斑基因SPL35及其应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8729

<212> DNA

<213> 稻属水稻（Oryza sativa L.）

<220>

<221> Promoter

<222> (1)..(2275)

<220>

<221> 5’UTR

<222> (2276)..(2369)

<220>

<221> CDS

<222> (2370)..(2765), (3455)..(3615), (3730)..(3789), (3900)..(3995), (4176)..(4288),(4812)..(4874), (4965)..(5062), (5145)..(5572), (6508)..(7876)

<220>

<221> 3’UTR

<222> (7877)..(8155)

<220>

<221> Terminator

<222> (8156)..(8729)

<400> 1

agttttgctg tagtgctagt tgttcccgat gttttgctat ctgagttata aattacgcgg 60

acttgtattc ttatgaagtc tgactttttg tataaaaaaa tgcttaacat accaaagcac 120

tgtaatatcg tccttgtact ttttcgcttt tcttcgagca tttatgggag atatatagca 180

ttcgattgtt acacatcgca ggctgtgctc agttgacaaa cggaaaaaat ctgagataga 240

aagttcttat attatatctg aataccgaat gattagtgaa gttattatac tgagaatgat 300

gagttagtgt tcgagaatgt ataatgagtt agtgttcgag aatggataat ggatgagtta 360

gtgttcgaga atggatgagt tagtgttctt atacctaata atgaatgagt tagggagtgt 420

ttgaggagaa ggggattgag gagattggga agatacgcaa aacgaggtga gccattagct 480

catgattaat tgagtattaa ctattttaaa atttaaaaat ggattaatat gattttttaa 540

agcaactttc ctatagaaat tttttgcaaa aaacacaccg tttagtagtt tgaaaagtgt 600

gcgcgcggaa aacgagagcc aatctcccct atcaccccta aacgaacgat gccttagtgt 660

tcttagccga atgattagtt atagagcatt gtttaaatta gaaacgttta acatcctaaa 720

caacaccatc agagtggcgc agcggaagcg tggtgggccc ataacccaca ggtcccagga 780

tcgaaacctg gctctgataa ttaatttttg acttcttaat cgtctaattt tattttattt 840

attcatcttt tttgaatcgt ctaaatttat tttatttatt catctttttt gaattattgc 900

ttcttaatct tctacgctag ctctatgcaa ccacaatctc accaaatggc gaagtaatat 960

tagtgtcttt ttttgataat taatttttgc tgatttatca ttcatttatc gaatttgttc 1020

ttaatgcata cgtacttaac ctatctcatg agcacctcta aaaaaattgg tccgtatatc 1080

ttgagctcga tgaaaacatc acagacatat aagctcactc ttatataata cacacgtgta 1140

catttggttc taatgaatac ttttgaagat tgagttagta atatgttaag attgacgagg 1200

ttaccggtca ccactggtgt ctgtatatac ctacaaattt tgagttcgac gaagtcacca 1260

caagtaatat ggtacgttgt ccaccactaa aaataattag ctataaatac aagcacatca 1320

tagactcgct gtcaacatgt atatcgctac cagtgaaaat aattactcct tccggacatg 1380

tctcatgtcc agattcatag tcttagatgg gtctcatccc atcatagttt gctatatttt 1440

gaaacggagg tagtagctgt aaatacaagt attcgtgcta aaattagaac ttaaacttag 1500

attagcaggt tccatcataa gaaaccttac tagtagctaa ggtatcctca attcgccata 1560

aatatcaggc aaaaaaggat cctcaaagtt tatggtattt gttgtatgac atccaaagaa 1620

tgtgtattta ttacatgaca ccactaaaaa catggtaatt agctggtgga tgctgaacgt 1680

attattttat tatatcggat ctaaatggag agagaaactt tcaaaaaaga caacttttta 1740

cctatggtgc atgtttcttt ttaacccaac cagatctagt tcggatcaga cctacaccaa 1800

gagaaaagtt acaattttgc ccttgtgtca atcggcttgt aagataactt tgtttgaacc 1860

aaaccagacc tagtccattc tcactccctc gatagaagag tccaacaaag cgaaaagtac 1920

aaatttgtaa tgcaataaat acacgttttt tgggtgttct acgacaaagg ctataaaatt 1980

tgagtgtctt agagcacatt ttgcctaaat aatagtagta ctgctcctac taatattcag 2040

atatgcactc tttcataaaa catggcttag tattttgatt ttctacccga cagggtgaac 2100

agacaaaata caaactataa accaaatcat atgaagagct tgagacgaaa aaaaaaacaa 2160

aaatgatcga aatacgcccc ttccaatttt tacaattttt aaaggtggaa attgtcacat 2220

ggcaatttaa atattgtaca ttgtcacaag aaaccttggg tctccccaaa attccgggaa 2280

acccctccgg aatctacaaa gcctactcct ctccctgtcc tgaaacgccg tgacggcttc 2340

tccttctccc tcctcccccc gatccagcca tgtcgtccgc gccgccgccg cagcaatcca 2400

aaccctccta caaccaccgc cgccacaaca acgccgcccc gaggcaccac cacggccagc 2460

agcagcagca gccgcagccg cagccgcagc cgcagcagcg ctacgtcccc aagcccgccg 2520

cacctaaacc ctcgcccccg ccgacgctca ccaccgccct ccgatcatcg gcttccccgt 2580

ctgcatctgg cgccggcagg gtgggcggag aggccgatgg gttcgtggcg tacctgccgc 2640

acgacgaggt ggtcgcggcc gggctcggcg ggcccgacgc ccaggagtcg caggccgtcg 2700

tcgacctcct caacgatgcc ctcgccgcgc tcctccgcgc taagccccgc gagttctggc 2760

gccagggtaa ccgaaacgct cgcttgtgca ttactgtgct catgaaaccg tgtagctgga 2820

aggcgtgaat tgttattttg ggattgggaa atcagagctg aaagcttgga agcgataact 2880

agttaaccac ttaatgttcg gtgtttactg cttgtttgct tcaattgtgt ttgttgaatg 2940

catcttctga tgcttcggtc tctgtgatta tctaaggcta cggattatgt gtaaaattct 3000

agtgtatgct tgttcaaatg tcagtttgca cttttaagcg caagataaaa tgcgtgcagt 3060

taaatttatt actacatttg cagttgaagt ggctagtagt tgcataagca aagcaaagcc 3120

tatgcaatca tattcttatc actatcatga cctatgatcc tttgaaatag ttttaatggg 3180

aaggaattaa tcctagtccc ttcagattga caggaacttc agattgacag gaataactac 3240

cctacaatca gaggaatttg gcattttttc ttatgcaaac taagcctgaa caataattga 3300

gcgagtagat gagtcaacat aaaagcttga gttgaggaca cgcctagatc tgtgattatc 3360

cattgtttca ctcctagaat ttaacttatg aataaatccg cgtgcatttg aactttacca 3420

atggtttcct aatgcttatc gttacctttt cccagtggca cagaatactt ccctgcatga 3480

gttcctggac agttacctac aattcaggca tcggtggtat gacttgcctc atcgtgcacc 3540

caaagggaca gttgctggct tagttgtcgg ggagcttgag ctttgccgtc gagtctttat 3600

ggtcctgtac cgcatgtgag atttatacca tttcgctatc tttcttgtat acatattttt 3660

cataagataa tgcacactgt tcagattcac atgagatttg tcatgatatg gctcttgttt 3720

gggtggtaga tcttcaaaca aggatcctgg agcattcagg ggtgaatccc ttagcatgaa 3780

ggagcatgca ggtgagatta gaactactca tatgatcact gtttgagttt accttttttt 3840

agagcagaat ggatagtgac cattggttca aatatactat attcacgttg ttcggttgta 3900

gccctcctgc aggagaaaag attgcttgat ttacccaagt tgttggacat ttgtgctatt 3960

tatgggcatg acaattgcaa attgacaagt tcactggttg gttcctgaag tgtttattat 4020

tgttgttgtt tttctccttt tcattttgca gacagatgct aacttaaatg caaattctaa 4080

ttcattccct tagtctcaga taaccttttt ctattcattg gcatgaatac ttttataatt 4140

ttattaataa caagtgcaca ttttctgtat ctgtaggttg aaaacgctat caatgtccag 4200

ccaaatattc tggatggcat taatattgtc cttccccaat tcctgggcat tttccacaca 4260

atgcaggaga ggtgcatgaa atcattacag gttattttgt gatcttcttc ataaatcact 4320

gcacatagct gttataggat tctgtattcc tttatctggt atgaacatcc atatgatatc 4380

attataacag ctgttttcac tttagtctgt agtcccaatc gcatatgcta aaacttttat 4440

cgttttctgc aaaggattca ggttattcat ttgtgctatt gacgaatata cttgttatta 4500

cttgttatat ctgttattgt ttcaaatact ttcttcccag ttcctttcaa caaccatgat 4560

acattgcttg gtaggttaga tagaaagtga cgattatgat gtttactatt aatttgtctc 4620

tgtttctttt ttatcctaaa ttgagattga agtatgtttt ctcaccacga ttaaaagttg 4680

aggacctatg atattgatat aaacttgatc ttgtagtttc acaccttcct gatctgatga 4740

cagtttagta gtttacagaa gatcttggag aactatgcat aaaaagaact taaccataat 4800

aaattcattt taggcgctca cttcatctgg accgaatgat agtggatata cccaacttca 4860

gaaagatttc tcagaggcaa gttttaccta tactgcatag tttatgatat gtctgctgtc 4920

ctttcatctg atttttctat attgttgtaa atccaacttc cttcaggtgt tggattttgt 4980

aaacgatgca attgtcactc tggatgcctt tgtcgatgct tatcaacctg ctgctttatt 5040

attttgtacc tcttttgaga cgaggtgcgc ttctactcat ccaacacaat atttgttcgc 5100

tgttccctta ataggcaatg atgcttatct accacttaat ttgcagctat ggagttgagg 5160

aactactgaa cactcttcca agattgtatg actcattgtt gccatctttg cttcatgggt 5220

ttcaagttat gtccagttcc caaagcaatg gagagactgc atctgacatt atactgagtg 5280

acatagttct tggtataagg atgctgtcaa ggagaactgt cagtttcgga tggagattat 5340

tggagttctg ctatttgaac aatcaacttg tggagcgtga tgttgaagct tgtacaaaga 5400

tgtttccagc taaagtcgaa gatcctatga tcaggggtga catcataatt caaacactca 5460

aggatatcaa tagagaagcc acattttcac aagatcatcc tggaaagaca ttcctccaag 5520

ctcttgaaaa ggagttcaag ttgatgaacc ggattggaga tattcgaaag aaaggtaaat 5580

gataaaaaat ctcaattaaa tgcttggtta ttttcatgtt tgtaaaattc cacacaacct 5640

tagtatccca ctattattat ttcagccaaa attgtctctt tagtttttca tccataaaca 5700

acatatacga tctaggaact ttattcagaa gttgtcatac aattattcta catatatgta 5760

ctgaattgcc tatgattcta tattctgtta ctatgcctgc tctcgccatc tatgcatgag 5820

tggttcttag aaagcttaaa acttccagct tgatccagca tattgatctc aatgaatgga 5880

aagagaaaga gccaaaacag aatcttatct atatttatat ctatactact taaaatgtat 5940

acgtggtggt gtctgttctg ccacaccatc cttaccactg acatttgggt cccacaatct 6000

atactattac atcaccctcc aacaagtcct cctatttcac tgctggttct ccccaaattt 6060

tgaatcacct acttgttcaa taaggaaaat cataaaagta ctacttggat taactatgtg 6120

cttaattgac ttaactagaa actcaatttg ttttccgttg caacgcatgg acttttggct 6180

agtaaaagga aaagatgctc tagcttctgt tgttttgttc tcataaagtt caccaataat 6240

attcccgtat taccctacat ttgattttat ttctgctcgc gtttgatcat tctggcactt 6300

ttgagttgtg ttcataagac atcacttttt ctgttttggc tagattctgt tgtgaagact 6360

gaaagagttt gctaaactgt cagcattatt ctgttgacat atatgctgta ttttcttgtt 6420

atctcaagtt tattgattgt gtcatagttt tatattgatg ccaaaacctt tggttgatgt 6480

attcaatatg ttcctccaat cgtaaacagg atggatacac atggatgatg agcagttcca 6540

gttcattgca cgcttgtgtg gatctactct gacatcttgg aatagtgtgc ctgatttgcc 6600

tgtctcttcc tatggtggtg aactacaaca taagaatgag gatactgcca tcactgagtc 6660

caagattact caaataaggg acctctttcc tgattatggg aagggtttcc tcgctgcatg 6720

cctggaagcc tacaaccaga acccagagga agttatccaa aggattttag atggaaccct 6780

ccatcaagat cttctagctc tggatacttc attagaagag atgccgcagc taaagcctgc 6840

agccactgtt gggaaagata agggcaaagg aatacttgtg gagactgagc ctcaaattat 6900

gaacaaaccc cataaggtta atactgagat gcatcgctat gttgaacatt cttcatcttc 6960

ttcagttcca tcagcatccc agggaccatc ctcatctgta ccatcagtcc cgcaaggtag 7020

atttacaagg aagaccaatg acgacgtgcc tgactctgca actctagact cacagaaagc 7080

aaaagatgct gttagatcag ctgtgcttga atcccagtat gaatatgatg atgagtatga 7140

tgactcgttc gatgatcttg gcttcagtgt ggtagaatca agttatgagg aaactgatgg 7200

tgccaatgat gccgagagtt cctcacaggg cccacggtgg agctcacaaa agaagacaca 7260

gttttatgtt aaggacggga agaactacag ctacaaggtt gctggttcag ttgctgtatc 7320

tagtgcccga gaagcggctg tcctgcgcaa tgttcagaaa gataccattc atggtcttgg 7380

ccgtggtgga aatgtacctc ttggagttcc caacaggcaa caacacagag acatggagga 7440

agaggagggt agcaatgcaa acaacttcgg cagaggaggc tccaacatag gcagaggagg 7500

ctcatatccc cgtggcgatc atggcagaag aggtggaagg gatcacggcg acccaccgcc 7560

ggagggcgag aacccaaacg ggccaccagg atttggccgt ggtggaagaa gagggggcag 7620

aaatcacggc aaccagccag aggcaaacga gaacccgaat ggccaacgtg gatttggccg 7680

tggcgcaaca agaggaggca ggaaccatga ccatccagcg gaggaccatg aagatccaga 7740

tgcagcacag ggcttcgctc gaggagggcc tgcacctcgt ggaggcagag gtggaaggag 7800

aggtggtggc cgggataacc atcaccggag agaccgtgcg atgaagaagc atatgcaagg 7860

attgacaggg ctttagttga tggttttcac catcgttttt cattgcggga actgtaaatg 7920

tgacagtatt tttttttgac gtggtctaga ctcggccaaa gcatacgatg ccttgaagca 7980

tccttatgat tactactcgt atattttacc catagcatgt ggaatcaaac tattgatgat 8040

catatttctt gtagcttcgg acagaataca aagtttgaat ctcataaatg aaagttaaat 8100

ctgtgttgct ctagtttctt gtggtgaaga atagttataa atcattaatc atttgcgtca 8160

gctaagaggc ccggtgctaa aggtactcga agccatgtga ctaatgctgt gctaatgatc 8220

cagatgggcc agcctatata gctacgcggt accccagacg ccgcagaagc agtgcgacgt 8280

tctgccggaa aaaccctccg ctaaggtcgc cgcgcaccgt gtgcccgcat ccgccatata 8340

gacggacagt gcatcggttt tctgggtgta cggtgtaccc cacgtgttag gtgacgtgac 8400

gtatcggttt tcaatagcgg ccgcgcgcgg ccagggcaat cgaatcgggt atcggccggc 8460

atcggtcacc ggagggatct cagccaaaga agtacgcaca ttgtcgtcgg taccagctgc 8520

agctagccca aatcctaaac ctcatttcaa cgtcgtcgtc ggcgtcgcca cctccagcgg 8580

ccacttcaac accgatggag cagctgtgag ccggtgaata gcgacctttc aggttcaaac 8640

gtgaaaggga gaaaaattag tggctgtgat gagccggcgc cattgtgtct gaatatatct 8700

gatgacacag gagagttacg ttctaacaa 8729

<210> 2

<211> 927

<212> PRT

<213> 稻属水稻（Oryza sativa L.）

<400> 2

Met Ser Ser Ala Pro Pro Pro Gln Gln Ser Lys Pro Ser Tyr Asn His Arg Arg His Asn 20

Asn Ala Ala Pro Arg His His His Gly Gln Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln 40

Pro Gln Gln Arg Tyr Val Pro Lys Pro Ala Ala Pro Lys Pro Ser Pro Pro Pro Thr Leu 60

Thr Thr Ala Leu Arg Ser Ser Ala Ser Pro Ser Ala Ser Gly Ala Gly Arg Val Gly Gly 80

Glu Ala Asp Gly Phe Val Ala Tyr Leu Pro His Asp Glu Val Val Ala Ala Gly Leu Gly 100

Gly Pro Asp Ala Gln Glu Ser Gln Ala Val Val Asp Leu Leu Asn Asp Ala Leu Ala Ala 120

Leu Leu Arg Ala Lys Pro Arg Glu Phe Trp Arg Gln Val Ala Gln Asn Thr Ser Leu His 140

Glu Phe Leu Asp Ser Tyr Leu Gln Phe Arg His Arg Trp Tyr Asp Leu Pro His Arg Ala 160

Pro Lys Gly Thr Val Ala Gly Leu Val Val Gly Glu Leu Glu Leu Cys Arg Arg Val Phe 180

Met Val Leu Tyr Arg Ile Ser Ser Asn Lys Asp Pro Gly Ala Phe Arg Gly Glu Ser Leu 200

Ser Met Lys Glu His Ala Ala Leu Leu Gln Glu Lys Arg Leu Leu Asp Leu Pro Lys Leu 220

Leu Asp Ile Cys Ala Ile Tyr Gly His Asp Asn Cys Lys Leu Thr Ser Ser Leu Val Glu 240

Asn Ala Ile Asn Val Gln Pro Asn Ile Leu Asp Gly Ile Asn Ile Val Leu Pro Gln Phe 260

Leu Gly Ile Phe His Thr Met Gln Glu Arg Cys Met Lys Ser Leu Gln Ala Leu Thr Ser 280

Ser Gly Pro Asn Asp Ser Gly Tyr Thr Gln Leu Gln Lys Asp Phe Ser Glu Val Leu Asp 300

Phe Val Asn Asp Ala Ile Val Thr Leu Asp Ala Phe Val Asp Ala Tyr Gln Pro Ala Ala 320

Leu Leu Phe Cys Thr Ser Phe Glu Thr Ser Tyr Gly Val Glu Glu Leu Leu Asn Thr Leu 340

Pro Arg Leu Tyr Asp Ser Leu Leu Pro Ser Leu Leu His Gly Phe Gln Val Met Ser Ser 360

Ser Gln Ser Asn Gly Glu Thr Ala Ser Asp Ile Ile Leu Ser Asp Ile Val Leu Gly Ile 380

Arg Met Leu Ser Arg Arg Thr Val Ser Phe Gly Trp Arg Leu Leu Glu Phe Cys Tyr Leu 400

Asn Asn Gln Leu Val Glu Arg Asp Val Glu Ala Cys Thr Lys Met Phe Pro Ala Lys Val 420

Glu Asp Pro Met Ile Arg Gly Asp Ile Ile Ile Gln Thr Leu Lys Asp Ile Asn Arg Glu 440

Ala Thr Phe Ser Gln Asp His Pro Gly Lys Thr Phe Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Phe 460

Lys Leu Met Asn Arg Ile Gly Asp Ile Arg Lys Lys Gly Trp Ile His Met Asp Asp Glu 480

Gln Phe Gln Phe Ile Ala Arg Leu Cys Gly Ser Thr Leu Thr Ser Trp Asn Ser Val Pro 500

Asp Leu Pro Val Ser Ser Tyr Gly Gly Glu Leu Gln His Lys Asn Glu Asp Thr Ala Ile 520

Thr Glu Ser Lys Ile Thr Gln Ile Arg Asp Leu Phe Pro Asp Tyr Gly Lys Gly Phe Leu 540

Ala Ala Cys Leu Glu Ala Tyr Asn Gln Asn Pro Glu Glu Val Ile Gln Arg Ile Leu Asp 560

Gly Thr Leu His Gln Asp Leu Leu Ala Leu Asp Thr Ser Leu Glu Glu Met Pro Gln Leu 580

Lys Pro Ala Ala Thr Val Gly Lys Asp Lys Gly Lys Gly Ile Leu Val Glu Thr Glu Pro 600

Gln Ile Met Asn Lys Pro His Lys Val Asn Thr Glu Met His Arg Tyr Val Glu His Ser 620

Ser Ser Ser Ser Val Pro Ser Ala Ser Gln Gly Pro Ser Ser Ser Val Pro Ser Val Pro 640

Gln Gly Arg Phe Thr Arg Lys Thr Asn Asp Asp Val Pro Asp Ser Ala Thr Leu Asp Ser 660

Gln Lys Ala Lys Asp Ala Val Arg Ser Ala Val Leu Glu Ser Gln Tyr Glu Tyr Asp Asp 680

Glu Tyr Asp Asp Ser Phe Asp Asp Leu Gly Phe Ser Val Val Glu Ser Ser Tyr Glu Glu 700

Thr Asp Gly Ala Asn Asp Ala Glu Ser Ser Ser Gln Gly Pro Arg Trp Ser Ser Gln Lys 720

Lys Thr Gln Phe Tyr Val Lys Asp Gly Lys Asn Tyr Ser Tyr Lys Val Ala Gly Ser Val 740

Ala Val Ser Ser Ala Arg Glu Ala Ala Val Leu Arg Asn Val Gln Lys Asp Thr Ile His 760

Gly Leu Gly Arg Gly Gly Asn Val Pro Leu Gly Val Pro Asn Arg Gln Gln His Arg Asp 780

Met Glu Glu Glu Glu Gly Ser Asn Ala Asn Asn Phe Gly Arg Gly Gly Ser Asn Ile Gly 800

Arg Gly Gly Ser Tyr Pro Arg Gly Asp His Gly Arg Arg Gly Gly Arg Asp His Gly Asp 820

Pro Pro Pro Glu Gly Glu Asn Pro Asn Gly Pro Pro Gly Phe Gly Arg Gly Gly Arg Arg 840

Gly Gly Arg Asn His Gly Asn Gln Pro Glu Ala Asn Glu Asn Pro Asn Gly Gln Arg Gly 860

Phe Gly Arg Gly Ala Thr Arg Gly Gly Arg Asn His Asp His Pro Ala Glu Asp His Glu 880

Asp Pro Asp Ala Ala Gln Gly Phe Ala Arg Gly Gly Pro Ala Pro Arg Gly Gly Arg Gly 900

Gly Arg Arg Gly Gly Gly Arg Asp Asn His His Arg Arg Asp Arg Ala Met Lys Lys His 920

Met Gln Gly Leu Thr Gly Leu 927

<210> 3

<211> 279

<212> DNA

<213> 稻属水稻（Oryza sativa L.）

<400> 3

gagttgagga actactgaac actcttccaa gattgtatga ctcattgttg ccatctttgc 60

ttcatgggtt tcaagttatg tccagttccc aaagcaatgg agagactgca tctgacatta 120

tactgagtga catagttctt ggtataagga tgctgtcaag gagaactgtc agtttcggat 180

ggagattatt ggagttctgc tatttgaaca atcaacttgt ggagcgtgat gttgaagctt 240

gtacaaagat gtttccagct aaagtcgaag atcctatga 279

Claims (10)

1.一种调控细胞程序化死亡与抗病性的水稻类病斑基因SPL35，其核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

2.根据权利要求1所述的水稻类病斑基因SPL35，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

3.包含权利要求1所述的水稻类病斑基因SPL35的植物表达载体或者宿主细胞系。

4.如权利要求3所述的宿主细胞系，其特征在于：所述宿主细胞系为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或者植物细胞。

5.如权利要求1或2所述的水稻类病斑基因SPL35在培育抗病植物品种中的应用。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗病植物品种是水稻品种，抗病是指抗真菌性或细菌性病害，优选为稻瘟病菌抗性，或稻白叶枯菌抗性。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述培育方法是通过注射接种突变体spl35，或者剪叶接种突变体spl35。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述注射接种是在分蘖期进行。

9.一种植物干扰RNA，其特征在于：其针对SPL35基因中一段特异的序列即如SEQ IDNO.3所示序列。

10.包含权利要求9所述的植物干扰RNA的RNAi干涉载体。