CN115287288B

CN115287288B - 水稻类病斑突变体及其应用

Info

Publication number: CN115287288B
Application number: CN202210079657.6A
Authority: CN
Inventors: 饶玉春; 陈振概; 陆天麒; 李永胜; 周剑君; 殷文晶; 芦涛
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Shenzhen Hongyue Enterprise Management Consulting Co ltd
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN115287288A

Abstract

本发明公开了水稻类病斑突变体及其应用，属于农业生物技术领域，水稻类病斑突变体为spl88基因的突变体；spl88基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其突变为经一个或几个碱基的突变导致spl88基因翻译提前终止。本发明突变体能够使水稻植株在分蘖盛期到抽穗期产生病斑，影响水稻的生长发育，改变其农艺性状，对于水稻类斑病研究、生长发育机制研究以及育种研究具有重要价值。

Description

水稻类病斑突变体及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及水稻类病斑突变体及其应用。

背景技术

植物类病斑是指在没有机械损伤、病原菌入侵且没有逆境胁迫下，植物体在自然生长下自发地产生类似病原菌侵染的坏死斑，该过程涉及细胞程序性死亡，其中斑点面积可以反应细胞死亡程度。根据类病斑突变体的表型可以将类病斑分为起始型和扩散型；起始型指的是植株没有受到病原物侵害，自发并随机在叶片或者植株上产生坏死斑，但随着植物体的生长不会扩散；扩散型又可称为蔓延型，即病斑会从起始发生的部位向周围随机扩散甚至蔓延到整个植株。

水稻产生类病斑的机制十分复杂，目前研究表明，大部分类病斑突变体对于稻瘟病菌或白叶枯病菌都表现出了增强的抗病性，因此，亟待对类斑病突变体进行深入研究，进而为水稻病原体广谱抗性的探索以及水稻的选育提供新的方向。

发明内容

本发明公开了水稻类病斑突变体，其能够使水稻植株在分蘖盛期到抽穗期产生病斑，影响水稻的生长发育，改变其农艺性状，对于水稻类斑病研究、生长发育机制研究以及育种研究具有重要价值。

水稻类病斑突变体为spl88基因的突变体；

spl88基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGAGCGGGGGCGGGCCGCCGAAGAAACGCAACTTCAAGATCGAGCTGTTCAAGCACCGCGTGGAGCTCGACCCCAAGTACGCGGAGCGGACATGGAAGGTCCTGGAGCACGCCATCCACGAGATCTACAACCACAACGCCAGTGGCCTCTCCTTCGAGGAGCTCTACAGGAGTGCCTACAACATGGTGCTCCACAAGTATGGTGAGAAGCTATATGATGGCCTGGAGAGAACTATGACATGGCGCTTGAAGGAAATATCAAAATCAATAGAGGCTGCACAGGGTGGTTTGTTTCTGGAGGAGCTGAATGCCAAGTGGATGGATCACAATAAGGCATTGCAGATGATCCGAGATATTCTAATGTACATGGATCGAACATATGTCCCGCAATCCCGTAGAACACCTGTTCATGAGCTTGGTTTGAATTTGTGGAGGGATCACATAATTCACTCTCCCATGATTCATAGTCGGCTGCTTGATACCCTTCTGGATCTTATTCACAGGGAGAGAATGGGTGAAATGATTAACAGAGGCCTGATGAGGAGCATAACGAAAATGTTAATGGATCTTGGTGCTGCTGTATATCAAGATGACTTTGAGAAGCCGTTTTTGGATGTTACAGCTAGCTTCTACAGTGGAGAGTCTCAGGAGTTCATTGAGTGCTGTGACTGTGGGAACTATCTTAAGAAGTCCGAGAGACGTCTCAATGAGGAAATGGAACGTGTCTCACACTACTTGGATTCTGGCACTGAGGCAAAGATAACTAGTGTGGTTGAGAAAGAAATGATTGCCAATCACATGCATAGATTGGTTCATATGGAAAACTCAGGCCTTGTAAATATGCTTGTAGATGACAAATATGACGACTTGGCTAGGATGTACAACTTATTCCGAAGGGTTTTTGATGGGCTATCGACAATCAGAGATGTGATGACTTCATACCTAAGGGAAACAGGGAAGCAGTTAGTGACAGATCCTGAGAGGTTGAAAGACCCAGTGGAATTTGTTCAGCGCTTGTTAAATGAGAAGGACAAGCATGATAAGATCATCAACGTTGCTTTTGGCAATGACAAAACTTTCCAGAATGCTCTAAATTCATCCTTTGAGTACTTCATCAACTTAAACAACAGGTCACCTGAATTCATATCGTTGTATGTTGATGATAAACTTCGGAAAGGATTGAAAGGAGCCACAGAAGAGGATGTGGAGGTTATTCTGGACAAAGTCATGATGCTGTTTCGGTACCTCCAGGAGAAGGATGTATTTGAGAAGTACTACAAGCAGCATTTGGCGAAAAGACTATTGTCTGGCAAAACTGTTTCTGATGATGCTGAGAGGAGTATGATAGTTAAACTCAAGACAGAATGTGGGTACCAGTTCACTTCCAAATTAGAGGGCATGTTCACTGACATGAAGACCTCTCAGGACACTATGATAGACTTTTATGCCAAGAAGTCTGAGGAACTTGGCGATGGCCCAACACTTGATGTCCACATTCTTACAACTGGTTCTTGGCCAACACAGCCCTGCCCTCCCTGCAACCTTCCAACTGAAATCCTTGCAATATGTGATAAGTTCCGGACATACTACCTTGGAACTCACAGTGGCCGGAGATTGACATGGCAAACAAACATGGGAACAGCTGACATAAAAGCCACATTTGGGAAAGGTCAGAAGCATGAACTAAATGTATCCACTTATCAGATGTGTGTTCTCATGCTGTTTAATTCTACCGATGGGTTAACCTACAAAGACATCGAACAAGATACTGCGATACCTGCCTCGGATCTAAAGAGATGCCTTCAATCTCTTGCTTGTGTCAAGGGGAAGAATGTTCTCCGCAAGGAACCCATGAGCAAAGATATATCGGAGGATGACACATTCTACTTCAACGACAAGTTCACAAGCAAGCTTGTTAAGGTCAAGATTGGGACAGTAGTGGCGCAAAAGGAATCTGAGCCAGAGAAACAAGAGACTCGTCAACGGGTTGAGGAGGACAGGAAACCTCAAATTGAGGCTGCTATCGTCAGGATTATGAAATCCAGGAGGGTCTTGGATCATAACAGCATTGTAGCTGAGGTTACCAAGCAATTGCAAGCCCGATTCATGCCGAATCCTGTTGTCATAAAGAAACGCATAGAATCTCTAATTGAGCGTGAATTCTTAGAGAGGGACAAAGCAGATAGGAAGTTATATCGCTATCTTGCATAG，

编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MSGGGPPKKRNFKIELFKHRVELDPKYAERTWKVLEHAIHEIYNHNASGLSFEELYRSAYNMVLHKYGEKLYDGLERTMTWRLKEISKSIEAAQGGLFLEELNAKWMDHNKALQMIRDILMYMDRTYVPQSRRTPVHELGLNLWRDHIIHSPMIHSRLLDTLLDLIHRERMGEMINRGLMRSITKMLMDLGAAVYQDDFEKPFLDVTASFYSGESQEFIECCDCGNYLKKSERRLNEEMERVSHYLDSGTEAKITSVVEKEMIANHMHRLVHMENSGLVNMLVDDKYDDLARMYNLFRRVFDGLSTIRDVMTSYLRETGKQLVTDPERLKDPVEFVQRLLNEKDKHDKIINVAFGNDKTFQNALNSSFEYFINLNNRSPEFISLYVDDKLRKGLKGATEEDVEVILDKVMMLFRYLQEKDVFEKYYKQHLAKRLLSGKTVSDDAERSMIVKLKTECGYQFTSKLEGMFTDMKTSQDTMIDFYAKKSEELGDGPTLDVHILTTGSWPTQPCPPCNLPTEILAICDKFRTYYLGTHSGRRLTWQTNMGTADIKATFGKGQKHELNVSTYQMCVLMLFNSTDGLTYKDIEQDTAIPASDLKRCLQSLACVKGKNVLRKEPMSKDISEDDTFYFNDKFTSKLVKVKIGTVVAQKESEPEKQETRQRVEEDRKPQIEAAIVRIMKSRRVLDHNSIVAEVTKQLQARFMPNPVVIKKRIESLIEREFLERDKADRKLYRYLA；

上述突变为经一个或几个碱基的突变导致spl88基因翻译提前终止。

进一步地，上述突变体为：

spl88基因第132碱基C缺失，SEQ ID NO.3所示：

ATGAGCGGGGGCGGGCCGCCGAAGAAACGCAACTTCAAGATCGAGCTGTTCAAGCACCGCGTGGAGCTCGACCCCAAGTACGCGGAGCGGACATGGAAGGTCCTGGAGCACGCCATCCACGAGATCTACAACACAACGCCAGTGGCCTCTCCTTCGAGGAGCTCTACAGGAGTGCCTACAACATGGTGCTCCACAAGTATGGTGAGAAGCTATATGATGGCCTGGAGAGAACTATGACATGGCGCTTGAAGGAAATATCAAAATCAATAGAGGCTGCACAGGGTGGTTTGTTTCTGGAGGAGCTGAATGCCAAGTGGATGGATCACAATAAGGCATTGCAGATGATCCGAGATATTCTAATGTACATGGATCGAACATATGTCCCGCAATCCCGTAGAACACCTGTTCATGAGCTTGGTTTGAATTTGTGGAGGGATCACATAATTCACTCTCCCATGATTCATAGTCGGCTGCTTGATACCCTTCTGGATCTTATTCACAGGGAGAGAATGGGTGAAATGATTAACAGAGGCCTGATGAGGAGCATAACGAAAATGTTAATGGATCTTGGTGCTGCTGTATATCAAGATGACTTTGAGAAGCCGTTTTTGGATGTTACAGCTAGCTTCTACAGTGGAGAGTCTCAGGAGTTCATTGAGTGCTGTGACTGTGGGAACTATCTTAAGAAGTCCGAGAGACGTCTCAATGAGGAAATGGAACGTGTCTCACACTACTTGGATTCTGGCACTGAGGCAAAGATAACTAGTGTGGTTGAGAAAGAAATGATTGCCAATCACATGCATAGATTGGTTCATATGGAAAACTCAGGCCTTGTAAATATGCTTGTAGATGACAAATATGACGACTTGGCTAGGATGTACAACTTATTCCGAAGGGTTTTTGATGGGCTATCGACAATCAGAGATGTGATGACTTCATACCTAAGGGAAACAGGGAAGCAGTTAGTGACAGATCCTGAGAGGTTGAAAGACCCAGTGGAATTTGTTCAGCGCTTGTTAAATGAGAAGGACAAGCATGATAAGATCATCAACGTTGCTTTTGGCAATGACAAAACTTTCCAGAATGCTCTAAATTCATCCTTTGAGTACTTCATCAACTTAAACAACAGGTCACCTGAATTCATATCGTTGTATGTTGATGATAAACTTCGGAAAGGATTGAAAGGAGCCACAGAAGAGGATGTGGAGGTTATTCTGGACAAAGTCATGATGCTGTTTCGGTACCTCCAGGAGAAGGATGTATTTGAGAAGTACTACAAGCAGCATTTGGCGAAAAGACTATTGTCTGGCAAAACTGTTTCTGATGATGCTGAGAGGAGTATGATAGTTAAACTCAAGACAGAATGTGGGTACCAGTTCACTTCCAAATTAGAGGGCATGTTCACTGACATGAAGACCTCTCAGGACACTATGATAGACTTTTATGCCAAGAAGTCTGAGGAACTTGGCGATGGCCCAACACTTGATGTCCACATTCTTACAACTGGTTCTTGGCCAACACAGCCCTGCCCTCCCTGCAACCTTCCAACTGAAATCCTTGCAATATGTGATAAGTTCCGGACATACTACCTTGGAACTCACAGTGGCCGGAGATTGACATGGCAAACAAACATGGGAACAGCTGACATAAAAGCCACATTTGGGAAAGGTCAGAAGCATGAACTAAATGTATCCACTTATCAGATGTGTGTTCTCATGCTGTTTAATTCTACCGATGGGTTAACCTACAAAGACATCGAACAAGATACTGCGATACCTGCCTCGGATCTAAAGAGATGCCTTCAATCTCTTGCTTGTGTCAAGGGGAAGAATGTTCTCCGCAAGGAACCCATGAGCAAAGATATATCGGAGGATGACACATTCTACTTCAACGACAAGTTCACAAGCAAGCTTGTTAAGGTCAAGATTGGGACAGTAGTGGCGCAAAAGGAATCTGAGCCAGAGAAACAAGAGACTCGTCAACGGGTTGAGGAGGACAGGAAACCTCAAATTGAGGCTGCTATCGTCAGGATTATGAAATCCAGGAGGGTCTTGGATCATAACAGCATTGTAGCTGAGGTTACCAAGCAATTGCAAGCCCGATTCATGCCGAATCCTGTTGTCATAAAGAAACGCATAGAATCTCTAATTGAGCGTGAATTCTTAGAGAGGGACAAAGCAGATAGGAAGTTATATCGCTATCTTGCATAG；

或spl88基因第381碱基T缺失，SEQ ID NO.4所示：

ATGAGCGGGGGCGGGCCGCCGAAGAAACGCAACTTCAAGATCGAGCTGTTCAAGCACCGCGTGGAGCTCGACCCCAAGTACGCGGAGCGGACATGGAAGGTCCTGGAGCACGCCATCCACGAGATCTACAACCACAACGCCAGTGGCCTCTCCTTCGAGGAGCTCTACAGGAGTGCCTACAACATGGTGCTCCACAAGTATGGTGAGAAGCTATATGATGGCCTGGAGAGAACTATGACATGGCGCTTGAAGGAAATATCAAAATCAATAGAGGCTGCACAGGGTGGTTTGTTTCTGGAGGAGCTGAATGCCAAGTGGATGGATCACAATAAGGCATTGCAGATGATCCGAGATATTCTAATGTACATGGATCGAACATAGTCCCGCAATCCCGTAGAACACCTGTTCATGAGCTTGGTTTGAATTTGTGGAGGGATCACATAATTCACTCTCCCATGATTCATAGTCGGCTGCTTGATACCCTTCTGGATCTTATTCACAGGGAGAGAATGGGTGAAATGATTAACAGAGGCCTGATGAGGAGCATAACGAAAATGTTAATGGATCTTGGTGCTGCTGTATATCAAGATGACTTTGAGAAGCCGTTTTTGGATGTTACAGCTAGCTTCTACAGTGGAGAGTCTCAGGAGTTCATTGAGTGCTGTGACTGTGGGAACTATCTTAAGAAGTCCGAGAGACGTCTCAATGAGGAAATGGAACGTGTCTCACACTACTTGGATTCTGGCACTGAGGCAAAGATAACTAGTGTGGTTGAGAAAGAAATGATTGCCAATCACATGCATAGATTGGTTCATATGGAAAACTCAGGCCTTGTAAATATGCTTGTAGATGACAAATATGACGACTTGGCTAGGATGTACAACTTATTCCGAAGGGTTTTTGATGGGCTATCGACAATCAGAGATGTGATGACTTCATACCTAAGGGAAACAGGGAAGCAGTTAGTGACAGATCCTGAGAGGTTGAAAGACCCAGTGGAATTTGTTCAGCGCTTGTTAAATGAGAAGGACAAGCATGATAAGATCATCAACGTTGCTTTTGGCAATGACAAAACTTTCCAGAATGCTCTAAATTCATCCTTTGAGTACTTCATCAACTTAAACAACAGGTCACCTGAATTCATATCGTTGTATGTTGATGATAAACTTCGGAAAGGATTGAAAGGAGCCACAGAAGAGGATGTGGAGGTTATTCTGGACAAAGTCATGATGCTGTTTCGGTACCTCCAGGAGAAGGATGTATTTGAGAAGTACTACAAGCAGCATTTGGCGAAAAGACTATTGTCTGGCAAAACTGTTTCTGATGATGCTGAGAGGAGTATGATAGTTAAACTCAAGACAGAATGTGGGTACCAGTTCACTTCCAAATTAGAGGGCATGTTCACTGACATGAAGACCTCTCAGGACACTATGATAGACTTTTATGCCAAGAAGTCTGAGGAACTTGGCGATGGCCCAACACTTGATGTCCACATTCTTACAACTGGTTCTTGGCCAACACAGCCCTGCCCTCCCTGCAACCTTCCAACTGAAATCCTTGCAATATGTGATAAGTTCCGGACATACTACCTTGGAACTCACAGTGGCCGGAGATTGACATGGCAAACAAACATGGGAACAGCTGACATAAAAGCCACATTTGGGAAAGGTCAGAAGCATGAACTAAATGTATCCACTTATCAGATGTGTGTTCTCATGCTGTTTAATTCTACCGATGGGTTAACCTACAAAGACATCGAACAAGATACTGCGATACCTGCCTCGGATCTAAAGAGATGCCTTCAATCTCTTGCTTGTGTCAAGGGGAAGAATGTTCTCCGCAAGGAACCCATGAGCAAAGATATATCGGAGGATGACACATTCTACTTCAACGACAAGTTCACAAGCAAGCTTGTTAAGGTCAAGATTGGGACAGTAGTGGCGCAAAAGGAATCTGAGCCAGAGAAACAAGAGACTCGTCAACGGGTTGAGGAGGACAGGAAACCTCAAATTGAGGCTGCTATCGTCAGGATTATGAAATCCAGGAGGGTCTTGGATCATAACAGCATTGTAGCTGAGGTTACCAAGCAATTGCAAGCCCGATTCATGCCGAATCCTGTTGTCATAAAGAAACGCATAGAATCTCTAATTGAGCGTGAATTCTTAGAGAGGGACAAAGCAGATAGGAAGTTATATCGCTATCTTGCATAG。

上述水稻类病斑突变体能够影响水稻的生长发育，改变其农艺性状，可应用于水稻育种中。

进一步地，上述水稻育种中应用包括杂交育种或分子育种。

进一步地，上述水稻类病斑突变体能够使水稻植株变矮、分蘖数减少，可应用于抗倒伏水稻育种。

进一步地，上述水稻类病斑突变体可应用于抗病性水稻育种。

进一步地，上述水稻类病斑突变体可应用于制备水稻类斑病研究实验用材料。

进一步地，上述水稻类病斑突变体可应用于制备水稻生长发育机制研究实验用材料。

综上所述，本发明水稻类病斑突变体能够影响水稻的生长发育，改变其农艺性状，进一步阐明了水稻类病斑产生的机制及其作用机理，对于植株防卫应激反应机制和细胞程序性死亡的研究具有重要的意义和价值；基于该突变体，可尝试通过基因工程或遗传工程方法增强作物对不良环境的抗性。

附图说明

图1所示为野生型秀水11(WT)与spl88-1、spl88-2突变材料的表型分析；

A.野生型和spl88-1、spl88-2突变材料分蘖盛期时表型图，标尺为15cm；

B.野生型与spl88-1、spl88-2突变材料分蘖盛期叶片表型，标尺为3cm；

图2所示为野生型与spl88-1、spl88-2突变材料接白叶枯病病菌后剑叶表型和防御相关基因表达分析；

A.野生型与突变体接菌15天后表型，bar＝3cm；

B.接菌15天后白叶枯病斑长度；

C.防御相关基因表达情况；

*表示t检验在0.05水平上差异显著，**表示t检验在0.01水平上差异显著；

图3所示为野生型与突变材料的主要农艺性状比较；

A.株高；B.分蘖数；C.分支数；D.每穗粒数；E.千粒重；F.结实率；

数据为平均值±标准差(n＝10)，*表示t检验在0.05水平上差异显著，**表示t检验在0.01水平上差异显著；

图4所示为野生型与突变材料叶绿素含量和最大光合速率测定结果；

A.野生型与突变材料剑叶叶绿素含量；

B.野生型与突变材料剑叶最大光合速率；

图5所示为野生型与突变材料叶绿体超微结构；

C-H.野生型与突变材料叶肉细胞叶绿体超微结构观察，

C、E、G.bar＝1μm，D、F、H.bar＝0.5μm；

图6所示为野生型与突变材料叶片表面结构；

I-N：野生型与突变材料叶片气孔孔径观察，

I、K、M.bar＝300μm，J、L、N.bar＝30μm；

图7所示为spl88基因的图位克隆；

A.SPL88基因的初定位；B-C：SPL88基因精细定位；

D.LOC_Os02g51180基因结构；E-F：SPL88-1、SPL88-2基因突变位点序列分析；

图8所示为pl88-1突变材料突变氨基酸序列；

图9所示为pl88-2突变材料突变氨基酸序列。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1突变材料的获得

以粳稻品种秀水11为实验材料进行EMS化学诱变：

清水浸种8小时，然后沥出水分，倒入已经配比好的1％EMS溶液浸泡诱变8小时，期间用小木棍搅拌多次确保混合均匀。

诱变完成后用流动水冲洗净有毒的EMS溶液，25℃催芽后播种，单株插秧单株收种，生长时期按常规大田管理。

水稻材料种植于浙江省金华市浙江师范大学生化学院试验田，常规管理；在大田条件下观察发现2株在分蘖盛期起始在叶尖出现病斑，从分蘖盛期到抽穗期，病斑越发严重，逐渐蔓延到整个叶片(图1)，将这两种类病斑突变材料分别记为spl88-1、spl88-2。

将秀水11与2种突变材料分别接白叶枯病病菌，15天后观察剑叶表型，测量白叶枯病斑长度，并qRT-PCR检测防御相关基因表达情况，结果如图2所示，突变材料对于白叶枯病菌的抗性明显增强。

2种水稻类病斑突变材料分别自交，获得稳定遗传类病斑表型的后代，用于以下实验：

对比野生型与突变材料的主要农艺性状，发现突变材料的株高、分蘖数、分支数、每穗粒数、千粒重和结实率均显著性下降(图3)。

突变材料从分蘖盛期到成熟期叶片上都存在病斑，在分蘖盛期采取野生型与突变材料叶片进行叶绿素含量测定，结果如图4所示，突变材料叶绿素a、叶绿素b都显著低于野生型。

此外，对分蘖盛期植株的光合速率进行测定，发现突变材料的最大光合速率也发生了显著性的降低。

为了进一步探究突变材料叶绿素含量降低的原因，在分蘖盛期对野生型和突变材料进行了透射电镜观察。结果如图5所示，突变材料的叶绿体发生皱缩，内部片层结构变得紊乱。更为明显的是，突变材料叶绿体内的嗜锇颗粒明显增多。

气孔孔径是影响光合作用的重要因素，利用扫描电镜对分蘖盛期野生型与突变材料的叶片进行观察，结果如图6所示，突变材料的气孔孔径大于野生型。

以上结果表明，突变材料叶绿体结构的改变导致了其类病斑表型的出现，从而负调控植株的生长发育。

实施例2群体构建和遗传分析

将突变材料spl88-1、spl88-2分别与和常规籼稻南京6号进行正反交，F1植株均表现出正常野生型表型，说明突变材料表型受隐性核基因控制。统计F2分离群体分离比(表1、表2)，结果表明，正常表型的植株和突变材料表型的植株的分离比经过卡方检验接近3:1分离，这表明突变材料类病斑、株高、分蘖数等表型是由一对单隐性核基因控制。

表1水稻类病斑突变材料spl88-1的遗传分析

表2水稻类病斑突变材料spl88-2的遗传分析

实施例3spl88基因的精细定位

设计均匀分布于水稻12条染色体的SSR引物，对突变材料与秀水11、南京6号进行多态性筛选；然后用21个spl88-1/南京6号、spl88-2/南京6号中F2类病斑单株进行连锁分析，初步确认目标基因所在的染色体位置；基因组DNA采用CTAB法提取，具体步骤如下：

①、称取0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入600μL的CTAB溶液配制的DNA提取缓冲液(2％(m/V)CTAB，100mmol/L Tris-Cl，20mmol/L EDTA，1.4mol/LNaCl；pH8.0)，65℃水浴40分钟。再加600μL的氯仿:异戊醇(24:1的体积比)，并混匀。10,000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。

②、在上述步骤①离心后所得的上清液中加2/3～1倍体积预冷(至4℃)的异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀。13,000rpm离心8分钟，倒出上清液。

③、再用70％(体积浓度)的已醇200μL洗涤上述步骤②所得的DNA沉淀物。

④、将上述洗涤后的DNA晾干并溶于100μLTE缓冲液或纯水中。

⑤、紫外分光光度法检测上述步骤④所得的DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。完整合适的DNA用于PCR扩增，不完整的DNA则重新提取，直至获得完整的DNA。

PCR反应体系采用10μL体系：DNA模板1μL，10×PCR缓冲液1μL，正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，dNTPs 1μL，rTaq酶0.2μL，加ddH₂O补足10μL。PCR扩增程序如下：94℃下预变性4min；94℃下变性30s，55℃～60℃下退火30s(温度因引物不同而异)，72℃下延伸30s，40个循环；最后72℃下延伸10min。

PCR产物用4％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像仪拍照并读胶。利用筛选的120对SSR引物进行spl88基因连锁分析，发现在第2号染色体的末尾附近处表现出连锁现象。

在连锁标记上下游设计新的Indel标记，用上述21个单株将目的基因区间锁定在分子标记M1与M10之间。

在M1-M10区间再次设计新的分子标记，用579个F2单株最终将该基因定位在M5和M6之间大约84kb的区间内，引物序列见表3。

表3精细定位所用分子标记

通过网站(http://rice.uga.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/#search)查询发现，该区域内包含14个ORF。如图3所示，通过测序比对发现两突变材料均在基因LOC_Os02g51180发生突变(对应秀水11中该基因编码区序列如SEQ ID NO.1所示)；其中，spl88-1突变材料该基因编码区的第132个碱基C发生缺失，使得组氨酸变成苏氨酸，导致提前终止，其突变核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如图4所示；spl88-2突变材料该基因编码区的第381位碱基T缺失，从而导致提前终止，其突变核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如图5所示。

综上，本发明所获得的spl88基因上的碱基缺失导致的蛋白质翻译提前终止造成了水稻植株变矮，类病斑表型的出现。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 浙江师范大学

<120> 水稻类病斑突变体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2211

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

atgagcgggg gcgggccgcc gaagaaacgc aacttcaaga tcgagctgtt caagcaccgc 60

gtggagctcg accccaagta cgcggagcgg acatggaagg tcctggagca cgccatccac 120

gagatctaca accacaacgc cagtggcctc tccttcgagg agctctacag gagtgcctac 180

aacatggtgc tccacaagta tggtgagaag ctatatgatg gcctggagag aactatgaca 240

tggcgcttga aggaaatatc aaaatcaata gaggctgcac agggtggttt gtttctggag 300

gagctgaatg ccaagtggat ggatcacaat aaggcattgc agatgatccg agatattcta 360

atgtacatgg atcgaacata tgtcccgcaa tcccgtagaa cacctgttca tgagcttggt 420

ttgaatttgt ggagggatca cataattcac tctcccatga ttcatagtcg gctgcttgat 480

acccttctgg atcttattca cagggagaga atgggtgaaa tgattaacag aggcctgatg 540

aggagcataa cgaaaatgtt aatggatctt ggtgctgctg tatatcaaga tgactttgag 600

aagccgtttt tggatgttac agctagcttc tacagtggag agtctcagga gttcattgag 660

tgctgtgact gtgggaacta tcttaagaag tccgagagac gtctcaatga ggaaatggaa 720

cgtgtctcac actacttgga ttctggcact gaggcaaaga taactagtgt ggttgagaaa 780

gaaatgattg ccaatcacat gcatagattg gttcatatgg aaaactcagg ccttgtaaat 840

atgcttgtag atgacaaata tgacgacttg gctaggatgt acaacttatt ccgaagggtt 900

tttgatgggc tatcgacaat cagagatgtg atgacttcat acctaaggga aacagggaag 960

cagttagtga cagatcctga gaggttgaaa gacccagtgg aatttgttca gcgcttgtta 1020

aatgagaagg acaagcatga taagatcatc aacgttgctt ttggcaatga caaaactttc 1080

cagaatgctc taaattcatc ctttgagtac ttcatcaact taaacaacag gtcacctgaa 1140

ttcatatcgt tgtatgttga tgataaactt cggaaaggat tgaaaggagc cacagaagag 1200

gatgtggagg ttattctgga caaagtcatg atgctgtttc ggtacctcca ggagaaggat 1260

gtatttgaga agtactacaa gcagcatttg gcgaaaagac tattgtctgg caaaactgtt 1320

tctgatgatg ctgagaggag tatgatagtt aaactcaaga cagaatgtgg gtaccagttc 1380

acttccaaat tagagggcat gttcactgac atgaagacct ctcaggacac tatgatagac 1440

ttttatgcca agaagtctga ggaacttggc gatggcccaa cacttgatgt ccacattctt 1500

acaactggtt cttggccaac acagccctgc cctccctgca accttccaac tgaaatcctt 1560

gcaatatgtg ataagttccg gacatactac cttggaactc acagtggccg gagattgaca 1620

tggcaaacaa acatgggaac agctgacata aaagccacat ttgggaaagg tcagaagcat 1680

gaactaaatg tatccactta tcagatgtgt gttctcatgc tgtttaattc taccgatggg 1740

ttaacctaca aagacatcga acaagatact gcgatacctg cctcggatct aaagagatgc 1800

cttcaatctc ttgcttgtgt caaggggaag aatgttctcc gcaaggaacc catgagcaaa 1860

gatatatcgg aggatgacac attctacttc aacgacaagt tcacaagcaa gcttgttaag 1920

gtcaagattg ggacagtagt ggcgcaaaag gaatctgagc cagagaaaca agagactcgt 1980

caacgggttg aggaggacag gaaacctcaa attgaggctg ctatcgtcag gattatgaaa 2040

tccaggaggg tcttggatca taacagcatt gtagctgagg ttaccaagca attgcaagcc 2100

cgattcatgc cgaatcctgt tgtcataaag aaacgcatag aatctctaat tgagcgtgaa 2160

ttcttagaga gggacaaagc agataggaag ttatatcgct atcttgcata g 2211

<210> 2

<211> 736

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Met Ser Gly Gly Gly Pro Pro Lys Lys Arg Asn Phe Lys Ile Glu Leu

1 5 10 15

Phe Lys His Arg Val Glu Leu Asp Pro Lys Tyr Ala Glu Arg Thr Trp

20 25 30

Lys Val Leu Glu His Ala Ile His Glu Ile Tyr Asn His Asn Ala Ser

35 40 45

Gly Leu Ser Phe Glu Glu Leu Tyr Arg Ser Ala Tyr Asn Met Val Leu

50 55 60

His Lys Tyr Gly Glu Lys Leu Tyr Asp Gly Leu Glu Arg Thr Met Thr

65 70 75 80

Trp Arg Leu Lys Glu Ile Ser Lys Ser Ile Glu Ala Ala Gln Gly Gly

85 90 95

Leu Phe Leu Glu Glu Leu Asn Ala Lys Trp Met Asp His Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Gln Met Ile Arg Asp Ile Leu Met Tyr Met Asp Arg Thr Tyr Val

115 120 125

Pro Gln Ser Arg Arg Thr Pro Val His Glu Leu Gly Leu Asn Leu Trp

130 135 140

Arg Asp His Ile Ile His Ser Pro Met Ile His Ser Arg Leu Leu Asp

145 150 155 160

Thr Leu Leu Asp Leu Ile His Arg Glu Arg Met Gly Glu Met Ile Asn

165 170 175

Arg Gly Leu Met Arg Ser Ile Thr Lys Met Leu Met Asp Leu Gly Ala

180 185 190

Ala Val Tyr Gln Asp Asp Phe Glu Lys Pro Phe Leu Asp Val Thr Ala

195 200 205

Ser Phe Tyr Ser Gly Glu Ser Gln Glu Phe Ile Glu Cys Cys Asp Cys

210 215 220

Gly Asn Tyr Leu Lys Lys Ser Glu Arg Arg Leu Asn Glu Glu Met Glu

225 230 235 240

Arg Val Ser His Tyr Leu Asp Ser Gly Thr Glu Ala Lys Ile Thr Ser

245 250 255

Val Val Glu Lys Glu Met Ile Ala Asn His Met His Arg Leu Val His

260 265 270

Met Glu Asn Ser Gly Leu Val Asn Met Leu Val Asp Asp Lys Tyr Asp

275 280 285

Asp Leu Ala Arg Met Tyr Asn Leu Phe Arg Arg Val Phe Asp Gly Leu

290 295 300

Ser Thr Ile Arg Asp Val Met Thr Ser Tyr Leu Arg Glu Thr Gly Lys

305 310 315 320

Gln Leu Val Thr Asp Pro Glu Arg Leu Lys Asp Pro Val Glu Phe Val

325 330 335

Gln Arg Leu Leu Asn Glu Lys Asp Lys His Asp Lys Ile Ile Asn Val

340 345 350

Ala Phe Gly Asn Asp Lys Thr Phe Gln Asn Ala Leu Asn Ser Ser Phe

355 360 365

Glu Tyr Phe Ile Asn Leu Asn Asn Arg Ser Pro Glu Phe Ile Ser Leu

370 375 380

Tyr Val Asp Asp Lys Leu Arg Lys Gly Leu Lys Gly Ala Thr Glu Glu

385 390 395 400

Asp Val Glu Val Ile Leu Asp Lys Val Met Met Leu Phe Arg Tyr Leu

405 410 415

Gln Glu Lys Asp Val Phe Glu Lys Tyr Tyr Lys Gln His Leu Ala Lys

420 425 430

Arg Leu Leu Ser Gly Lys Thr Val Ser Asp Asp Ala Glu Arg Ser Met

435 440 445

Ile Val Lys Leu Lys Thr Glu Cys Gly Tyr Gln Phe Thr Ser Lys Leu

450 455 460

Glu Gly Met Phe Thr Asp Met Lys Thr Ser Gln Asp Thr Met Ile Asp

465 470 475 480

Phe Tyr Ala Lys Lys Ser Glu Glu Leu Gly Asp Gly Pro Thr Leu Asp

485 490 495

Val His Ile Leu Thr Thr Gly Ser Trp Pro Thr Gln Pro Cys Pro Pro

500 505 510

Cys Asn Leu Pro Thr Glu Ile Leu Ala Ile Cys Asp Lys Phe Arg Thr

515 520 525

Tyr Tyr Leu Gly Thr His Ser Gly Arg Arg Leu Thr Trp Gln Thr Asn

530 535 540

Met Gly Thr Ala Asp Ile Lys Ala Thr Phe Gly Lys Gly Gln Lys His

545 550 555 560

Glu Leu Asn Val Ser Thr Tyr Gln Met Cys Val Leu Met Leu Phe Asn

565 570 575

Ser Thr Asp Gly Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Glu Gln Asp Thr Ala Ile

580 585 590

Pro Ala Ser Asp Leu Lys Arg Cys Leu Gln Ser Leu Ala Cys Val Lys

595 600 605

Gly Lys Asn Val Leu Arg Lys Glu Pro Met Ser Lys Asp Ile Ser Glu

610 615 620

Asp Asp Thr Phe Tyr Phe Asn Asp Lys Phe Thr Ser Lys Leu Val Lys

625 630 635 640

Val Lys Ile Gly Thr Val Val Ala Gln Lys Glu Ser Glu Pro Glu Lys

645 650 655

Gln Glu Thr Arg Gln Arg Val Glu Glu Asp Arg Lys Pro Gln Ile Glu

660 665 670

Ala Ala Ile Val Arg Ile Met Lys Ser Arg Arg Val Leu Asp His Asn

675 680 685

Ser Ile Val Ala Glu Val Thr Lys Gln Leu Gln Ala Arg Phe Met Pro

690 695 700

Asn Pro Val Val Ile Lys Lys Arg Ile Glu Ser Leu Ile Glu Arg Glu

705 710 715 720

Phe Leu Glu Arg Asp Lys Ala Asp Arg Lys Leu Tyr Arg Tyr Leu Ala

725 730 735

<210> 3

<211> 2210

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

atgagcgggg gcgggccgcc gaagaaacgc aacttcaaga tcgagctgtt caagcaccgc 60

gtggagctcg accccaagta cgcggagcgg acatggaagg tcctggagca cgccatccac 120

gagatctaca acacaacgcc agtggcctct ccttcgagga gctctacagg agtgcctaca 180

acatggtgct ccacaagtat ggtgagaagc tatatgatgg cctggagaga actatgacat 240

ggcgcttgaa ggaaatatca aaatcaatag aggctgcaca gggtggtttg tttctggagg 300

agctgaatgc caagtggatg gatcacaata aggcattgca gatgatccga gatattctaa 360

tgtacatgga tcgaacatat gtcccgcaat cccgtagaac acctgttcat gagcttggtt 420

tgaatttgtg gagggatcac ataattcact ctcccatgat tcatagtcgg ctgcttgata 480

cccttctgga tcttattcac agggagagaa tgggtgaaat gattaacaga ggcctgatga 540

ggagcataac gaaaatgtta atggatcttg gtgctgctgt atatcaagat gactttgaga 600

agccgttttt ggatgttaca gctagcttct acagtggaga gtctcaggag ttcattgagt 660

gctgtgactg tgggaactat cttaagaagt ccgagagacg tctcaatgag gaaatggaac 720

gtgtctcaca ctacttggat tctggcactg aggcaaagat aactagtgtg gttgagaaag 780

aaatgattgc caatcacatg catagattgg ttcatatgga aaactcaggc cttgtaaata 840

tgcttgtaga tgacaaatat gacgacttgg ctaggatgta caacttattc cgaagggttt 900

ttgatgggct atcgacaatc agagatgtga tgacttcata cctaagggaa acagggaagc 960

agttagtgac agatcctgag aggttgaaag acccagtgga atttgttcag cgcttgttaa 1020

atgagaagga caagcatgat aagatcatca acgttgcttt tggcaatgac aaaactttcc 1080

agaatgctct aaattcatcc tttgagtact tcatcaactt aaacaacagg tcacctgaat 1140

tcatatcgtt gtatgttgat gataaacttc ggaaaggatt gaaaggagcc acagaagagg 1200

atgtggaggt tattctggac aaagtcatga tgctgtttcg gtacctccag gagaaggatg 1260

tatttgagaa gtactacaag cagcatttgg cgaaaagact attgtctggc aaaactgttt 1320

ctgatgatgc tgagaggagt atgatagtta aactcaagac agaatgtggg taccagttca 1380

cttccaaatt agagggcatg ttcactgaca tgaagacctc tcaggacact atgatagact 1440

tttatgccaa gaagtctgag gaacttggcg atggcccaac acttgatgtc cacattctta 1500

caactggttc ttggccaaca cagccctgcc ctccctgcaa ccttccaact gaaatccttg 1560

caatatgtga taagttccgg acatactacc ttggaactca cagtggccgg agattgacat 1620

ggcaaacaaa catgggaaca gctgacataa aagccacatt tgggaaaggt cagaagcatg 1680

aactaaatgt atccacttat cagatgtgtg ttctcatgct gtttaattct accgatgggt 1740

taacctacaa agacatcgaa caagatactg cgatacctgc ctcggatcta aagagatgcc 1800

ttcaatctct tgcttgtgtc aaggggaaga atgttctccg caaggaaccc atgagcaaag 1860

atatatcgga ggatgacaca ttctacttca acgacaagtt cacaagcaag cttgttaagg 1920

tcaagattgg gacagtagtg gcgcaaaagg aatctgagcc agagaaacaa gagactcgtc 1980

aacgggttga ggaggacagg aaacctcaaa ttgaggctgc tatcgtcagg attatgaaat 2040

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<211> 2210

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

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tcttagagag ggacaaagca gataggaagt tatatcgcta tcttgcatag 2210

Claims

1.水稻类病斑突变体，其特征在于，所述水稻类病斑突变体为spl88基因的突变体；所述spl88基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述突变体为所述spl88基因第132碱基C缺失，SEQ ID NO.3所示；或所述spl88基因第381碱基T缺失，SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述的水稻类病斑突变体在水稻育种中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括杂交育种或分子育种。

4.权利要求1所述的水稻类病斑突变体在抗倒伏水稻育种中的应用。

5.权利要求1所述的水稻类病斑突变体在抗白叶枯病水稻育种中的应用。

6.权利要求1所述的水稻类病斑突变体在制备水稻类斑病研究实验用材料中的应用。

7.权利要求1述的水稻类病斑突变体在制备水稻生长发育机制研究实验用材料中的应用。