CN111172318B - 一种用于对肉果秤锤树进行分子鉴定的rpl32-trnL分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于濒危肉果秤锤树分子鉴定的rpl32‑trnL分子标记及其应用。该分子标记为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明提供了一种用于对肉果秤锤树进行分子鉴定的rpl32‑trnL分子标记。该分子标记是在肉果秤锤树叶绿体全基因组序列测序和组装的基础上，通过比较秤锤树属植物叶绿体全基因组序列，分析筛选高变区域，然后以含有高变区的DNA片段作为设计引物的DNA模板，通过引物设计软件自主设计PCR引物，PCR扩增验证开发的分子标记。该分子标记可在物种水平上对肉果秤锤树进行鉴定，为今后种质资源的保护和生物多样性的检测提供重要信息。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于对肉果秤锤树进行分子鉴定的rpl32-trnL分子标记及其应用。
背景技术
秤锤树属(Sinojackia)是中国特有的落叶乔木或灌木，系统位置处于安息香科(Styracaceae)内孤立的寡种属，该类植物其形态特殊，在安息香科的系统发育研究中卓有价值。近年来，随着人类对自然资源开发利用的加快，秤锤树属植物的栖息地和生长环境受到影响甚至破坏，造成种质资源的急剧丧失。其中，棱果秤锤树在野外已处于灭绝状态。肉果秤锤树(Sinojackia sarcocarpa LQ Luo)开白色小花，植株外形美观，具有较好的观赏价值。此外，它还含有用于治疗关节炎、血栓闭塞性脉管炎和心绞痛等疾病的有效成分，可作为药用兼观赏的园林树种。然而，该物种目前也濒临灭绝，其模式种群栖息地仅局限于面积不足 200m2的区域，数量仅有十余株。物种的灭绝将导致基因丧失及生物多样性减少。当前，物种多样性保护已经成为公众关注的热点问题，开展肉果秤锤树的遗传保护工作迫在眉睫。
识别和评估濒危物种是维持生物多样性以及制定保护策略的重要前提。传统基于形态标准的物种鉴定往往需要专业知识，只有少数长期从事分类学的人员才能有效掌握。常规情况下，肉果秤锤树的分类和鉴定依据形态学、尤其是果实形态学。但是，肉果秤锤树的果实外形与秤锤树等相似，不同植株的果实形态会存在变异。因此，仅仅依靠果实形态来识别肉果秤锤树可导致分类错误，不利于肉果秤锤树种质资源的评价。
分子标记可广泛应用于植物分子鉴定及系统分析，在很大程度上弥补了形态分类结果的不足，成为植物系统分类学研究的有力工具。目前，核糖体ITS 基因和叶绿体基因(trnH-psbA、trnS-trnG、atpB–rbcL、rps4和trnL)已被用于秤锤树属植物的分子鉴定。植物叶绿体基因组结构保守、很少重组和突变且多数情况下是单亲遗传，在植物系统进化和物种鉴定研究中具有重要的实用价值。随着叶绿体基因组测序成本的降低及研究技术的成熟，越来越多的叶绿体基因组序列被揭示，基于这些序列的新型分子标记的进一步开发潜力将被充分认识和利用。
发明内容
为进一步丰富肉果秤锤树叶绿体来源的分子遗传标记，本发明提供一种用于肉果秤锤树分子鉴定的rpl32-trnL分子标记及其在肉果秤锤树物种鉴定等方面的应用。
本发明开发了一个能够在物种水平上对肉果秤锤树进行分子鉴定的 rpl32-trnL分子标记，该DNA片段的可变区位于rpl32和trnL两个基因序列之间。同时，还自行设计扩增rpl32-trnL分子标记相应靶序列的引物并测试其适用性。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种肉果秤锤树叶绿体全基因组分子标记开发方法，其特征是利用Mafft v7.037软件比较肉果秤锤树及其近缘种叶绿体全基因组序列，分析序列的插入、缺失和碱基替换等微结构差异式样，确定叶绿体基因组序列的可变区。使用 Mega-X v10.0.5软件计算可变区内叶绿体分子标记的总差异位点，选择差异位点较多、且含肉果秤锤树特异序列的高度差异区域作为DNA模板，设计PCR 扩增引物。
一种用于肉果秤锤树分子鉴定的rpl32-trnL分子标记，该rpl32-trnL分子标记为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
一种扩增上述rpl32-trnL分子标记的引物对，该引物对含有如SEQ ID NO.2 所示的上游引物，以及如SEQ ID NO.3所示的下游引物，具体序列如下。
上游引物-F：5'-TAGGAAGGACTAGAATATCCGTCAC-3'；(SEQ ID NO.2)
下游引物-R：5'-GCGTGTCTACCAATTTCACCAT-3'。(SEQ ID NO.3)
本领域技术人员熟知，在上述SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列中，可在其5’端或3’端分别增加1～10个碱基，所增加的碱基类型可根据肉果秤锤树基因组DNA上与SEQID NO.2和SEQ ID NO.3相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定，由此得到的引物对与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3 的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的DNA序列相同)。因此，上述在 SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的5’端或3’端分别增加1～10个碱基并能扩增得到基本相同DNA片段的引物对，均包括在本发明的引物对中。在本发明具体的实施方式中，本发明的引物对优选为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列。
一种用于对肉果秤锤树进行分子鉴定的rpl32-trnL分子标记，该rpl32-trnL 分子标记是由权利要求3所述的引物对以肉果秤锤树的叶绿体基因组DNA为模板，经PCR扩增得到的。
对本领域技术人员而言，也可以采用DNA化学合成的方法得到本发明的分子标记。
进一步地，采用上述分子标记鉴定肉果秤锤树的方法：
用上述引物对被检测肉果秤锤树的基因组DNA模板进行扩增，并通过凝胶电泳和DNA测序判断扩增产物中是否存在该分子标记。
一种肉果秤锤树全基因组芯片，包括上述rpl32-trnL分子标记。
上述rpl32-trnL分子标记在肉果秤锤树分子鉴定和分子育种中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种用于对肉果秤锤树进行分子鉴定的rpl32-trnL分子标记，该分子标记可在物种水平上对肉果秤锤树进行鉴定，能够为肉果秤锤树种质资源的保护及生物多样性检测提供重要信息。
附图说明
图1为肉果秤锤树与秤锤树属其它植物之间的高度变异区；
图2为琼脂糖凝胶电泳检测肉果秤锤树叶绿体rpl32-trnL分子标记PCR扩增产物的结果；
图3为肉果秤锤树rpl32-trnL分子标记PCR扩增产物测序结果与其它秤锤树属对应序列之间差异的序列图谱；
图4为基于肉果秤锤树PCR产物序列和其它秤锤树属rpl32-trnL分子标记对应靶序列构建的ML系统进化树。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
1、材料
PCR反应Mix、DNA Marker DL2000、DNA回收试剂盒等分子生物学试剂购自成都擎科梓熙生物技术有限公司。肉果秤锤树叶绿体全基因组序列来源于我们自己测序和组装的序列(Sinojackia sarcocarpa,GenBank登录号 MK351986.1)。用于亲缘关系鉴定和系统进化分析的其余24种植物叶绿体基因组序列来源于GenBank，其中细果秤锤树(Sinojackiamicrocarpa,MG719835.1)、狭果秤锤树(Sinojackia rehderiana,MF179499.1)、秤锤树(Sinojackia xylocarpa, KY709672.1)、北美银钟花(Halesia carolina,MG719830.1)、小叶白辛树 (Pterostyrax corymbosus,NC_041134.1)、陀螺果(Melliodendronxylocarpum, MF179500.1)、大叶双翅银钟花(Halesia diptera,MG719831.1)、长果秤锤树(Changiostyrax dolichocarpus,MG722902.1)、木瓜红(Rehderodendron macrocarpum,MG719844.1)、银钟花(Perkinsiodendron macgregorii, MG719841.1)、假赤杨(Alniphyllum pterospermum,MG719829.1)、ramirezii安息香(Styrax ramirezii,MG719843.1)、栓叶安息香(Styrax suberifolius,MG719828.1)、大花野茉莉(Styraxgrandiflorus,KX111381.1)、浙江安息香(Styrax zhejiangensis, MG702338.1)、滇木荷(Schima noronhae,KY406787.1)、印度木荷(Schima khasiana, KY406794.1)、亚当福桂树(Fouquieria diguetii,MG524997.1)、肋果茶(Sladenia celastrifolia,MF179494.1)、五列木(Pentaphylax euryoides,MF179498.1)、厚皮香 (Ternstroemia gymnanthera,MF179490.1)、茶梨(Anneslea fragrans,(MF179497.1)、狭叶杨桐(Adinandraangustifolia,MF179491.1)、翅柃(Eurya alata,MH782188.1)。
实施例1肉果秤锤树叶绿体基因组序列的获取及高变区的鉴定
1、采用SDS方法提取DNA
(1)选取50mg液氮研碎的叶片组织，加入550μL裂解液，轻轻摇匀，再加入蛋白酶K颠倒混匀，55℃孵育2h，期间可不间断的温和摇动以使裂解完全。
(2)10000rpm离心5min后吸取上清液，加入蛋白沉淀液(5M NaCl)，轻轻摇晃片刻后，将上清液放在-20℃放置几分钟，然后10000rpm离心10min，上清可再次离心除去微量蛋白沉淀。
(3)将上清液移入干净的EP管中，加入异丙醇，混匀，-20℃放置30min，10000rpm离心10min。
(4)倒出液体，用1mL75％乙醇洗涤沉淀两次，然后倒掉多余液体。如果还有少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出。
(5)室温晾干DNA后，用50μL ddH2O溶解DNA样品。
(6)加入1μL核糖核酸酶A(RNase A)并混匀，37℃温育15min后保存备用。
2、肉果秤锤树叶绿体全基因组序列测序与组装
采用Illumina HiSeqXten平台对步骤1提取得到的DNA样品进行叶绿体全基因组测序，Illumina原始序列读取是由NGS QC工具包v2.3.3编辑的。阅读长度和Phred质量评分的截止值百分比分别为80和30。采用SPAdes3.9.0软件进行高质量的组装，K-mer值设定为93,105,117,121。测序组装结果显示肉果秤锤树的叶绿体基因组序列为158,737bp，GC含量为37.24％，包含一个大单拷贝区(LSC,88,002bp)和一个小单拷贝区(SSC,18,555bp)，以及两个反向重复序列 26,090bp，叶绿体基因组共含137genes,包括90蛋白编码基因和1个假基因， 8个核糖体RNA基因以及38个转运RNA基因(GenBank登录号MK351986)。其基因注释表见表1。
表1肉果秤锤树叶绿体基因组基因注释表
3、叶绿体基因组序列高度可变位点区域的鉴定
采用Mafft 7.037软件将肉果秤锤树与狭果秤锤树、细果秤锤树以及秤锤树的叶绿体全基因组序列进行比对，分析秤锤树属植物叶绿体基因组序列的插入、缺失、碱基替换等微结构差异式样。确定了肉果秤锤树与近缘秤锤树属植物叶绿体基因组序列之间差异最大的位置分布于rpl32-trnL(UAG)和ycf1-ndhF两个区域。采用使用Mega-X v10.0.5软件中的MUSCLE工具对29个叶绿体分子标记进行序列比对。图1A显示分子标记ycf1-ndhF序列内有56个差异位点，图 1B显示分子标记rpl32-trnL(UAG)序列中存在31个差异位点。进一步分析发现， rpl32-trnL(UAG)的差异序列中含有更多的肉果秤锤树特异序列。通过分析已报道的部分叶绿体基因片段的遗传特征以和位点差异，表2显示rpl32-trnL(UAG) 序列内部位点差异率为2.67％，而ycf1-ndhF序列内部位点差异率为1.66％。可以确定最适合肉果秤锤树分子鉴定的高变区位于rpl32-trnL基因范围内。
图1中，“*”号表示该位置有碱基替换，“·”号表示该位置存在碱基插入，“▲”号表示该位置有碱基缺失，波浪线表示分子标记扩增引物的位置。
如图1中A所示，4种秤锤树的叶绿体全基因组序列中，ycf1-ndhF分子标记对应靶序列长为3378碱基对，内部共存在56个序列差异位点。就肉果秤锤树而言，49处碱基发生缺失、7处碱基发生替换。在DNA区段更适合作为狭果秤锤树的分子标记。
如图1中B所示，4种秤锤树的叶绿体全基因组序列中，rpl32-trnL分子标记对应靶序列长为1160碱基对，内部共存在31个序列差异位点。就肉果秤锤树而言，10处碱基发生插入、8处碱基发生缺失、13处碱基发生碱基替换。进一步分析表明，仅1处碱基替换发生在rpl32基因内部，其余30处碱基差异位点位于rpl32和trnL之间的基因间隔区。
表2叶绿体基因片段遗传特征以及位点差异
注:表格中最后的“位置”表示肉果秤锤树基因所对应的叶绿体基因组中碱基位置。
实施例2分子标记引物的开发与应用
1、根据实施例1中所确定的叶绿体基因组rpl32-trnL分子标记高变区，采用引物设计软件Primer Premier 5在高变区两端设计引物，引物具体序列如下：
上游引物-F：5'-TAGGAAGGACTAGAATATCCGTCA C-3'；(SEQ ID NO.2)
下游引物-R：5'-GCGTGTCTACCAATTTCACCAT-3'。(SEQ ID NO.3)
2、DNA提取
取100mg肉果秤锤树新鲜叶子，放入研钵中。用适量石英砂磨碎后，将约 100μL粉末加入1.5mL EP管中，加入600μL CTAB DNA提取液，65℃水浴30 min，用500μL氯仿/异戊醇(24:1)混合液抽提裂解液，10000rpm离心5min，获得上清液并转移到干净的Eppendorf管中，加入等量预冷异丙醇沉淀DNA。离心去上清，再用1mL 70％乙醇洗涤DNA沉淀1次，将沉淀溶解于无菌水中，即获得肉果秤锤树基因组DNA。
3、PCR扩增
以步骤2提取得到的DNA为模板，采用步骤1设计的引物进行PCR扩增，扩增体系包括：I5 PCR Master Mix 25μL、10μmol/L上下游混合引物2μL、模版 DNA 1μL，最后用ddH2O补足至50μL。
扩增程序为：98℃预变性3min，一个循环；然后98℃变性10s，56℃退火 15s，72℃延伸25s，共38个循环；最后72℃保持5min。
再采用浓度1％的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，其结果见图2，然后回收和纯化DNA片段后送公司进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物为 SEQ ID NO.1DNA片段，与分子标记rpl32-trnL相对应。
图2中条带M为DNA分子量标准DL2000，条带1为PCR产物；如图2 所示，扩增得到了一条大小约为1540bp的DNA条带，说明设计的引物在PCR 扩增时具有适用性。
同时，PCR扩增产物测序结果表明，该序列与肉果秤锤树rpl32-trnL分子标记的DNA序列一致，且存在31处差异的碱基序列，表明本申请中发现的高度可变碱基位点是客观存在的(参见图3)。
图3中“*”号表示该位置存在碱基替换，“·”号表示该位置存在碱基插入，“▲”号表示该位置发生了碱基缺失(箭头所指处存在8个碱基的缺失)，且图3中的Ⅰ～Ⅵ与图1B图中的Ⅰ～Ⅵ分别一一对应，即图3中的Ⅰ与图1B图中的Ⅰ相对应，其余Ⅱ～Ⅵ以此类推即可。
4、分子标记应用于肉果秤锤树的物种鉴定和系统进化分析
采用Mega-X v10.0.5软件中的MUSCLE工具，将肉果秤锤树rpl32-trnL分子标记PCR产物测序结果与其它24种植物rpl32-trnL分子标记的相应DNA片段进行比对，构建最大似然(ML)系统进化树。参数设置如下：自举法1,000次重复检验，核苷酸替换选择GeneralTime Reversible模型，位点变异速率取Gamma 分布，完全删除间隙/缺失数据，其结果见图4。
如图4所示，基于rpl32-trnL分子标记的PCR产物序列结果对肉果秤锤树进行系统发育分析，所构建的ML进化树能很好地将肉果秤锤树与其它植物区分开来。上述结果表明，本发明开发的rpl32-trnL分子标记及其引物在肉果秤锤树物种鉴定中具有较好的适用性。
图4中各分支旁数值为1 000次bootstrap检验后的置信度值。
序列表
<120> 一种用于对肉果秤锤树进行分子鉴定的rpl32-trnL分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1540
<212> DNA
<213> 肉果秤锤树(Sinojackia sarcocarpa)
<400> 1
taggaaggac tagaatatcc gtcactttat agaaaattaa gttaattttc tatttttaaa 60
taaataaaat aaatagaaaa ttaataaaaa aaaatgacta aaattttgtt tatcaagcta 120
tggatacttt aattaatttc tagtttcatt cgaattttaa aatttacaat taggcatatt 180
ctttcttcga tcttgaccaa ttaataaaaa aaatcacata aaatattcct tttcgttttg 240
tattttattt ctagtaatta tattgcgact aatatttact tcgattttca catatctata 300
tttattatta ttattttttt tttatgaaga gaatgttatc taaaaaacaa atagaaaatg 360
aatagtcaaa aatgattctt tttgaacaat agatgtcttt cacatccaac taaaataata 420
agaaacctct tcttttttaa atggccgttc caaaaaaacg tacttctata tcaaaaaaac 480
gtattcgtaa aaatatttgg aaaaggaaag gatattgggc agccttaaaa gcgttttcgt 540
tagggaaatc tctttcgagc ggaacttcaa aaagtttttt tgtgcgacaa acaaataagt 600
aatcaaaatt ttatatttaa aatgaaatta gccaactttt tgagtcaagt cgattcagat 660
tatttcattt taaatataaa attaatggtt tacattacct actgttttgg actaatcaat 720
atgaaatgga attctttttg ctcttatgat ttgtaggata ataattcttg tatttacgga 780
attaaaaaaa aaagactttt ctttgaaaaa agaataaaca caagatacaa gggtttacct 840
ttcttgttct tatatctatt tttttctggg gtgcgaattc ggattttcct gatcgaattt 900
tacaataata aaagtttttc ttctttctct agttctatat ctataaaaga gcagatataa 960
gatctttagt caaaattaat gaatggttga aattcaaatt aattgaattg attaaattaa 1020
aaatgtttct aaatttttat ttctctgaat tactatatat actcccacat atctcccgct 1080
ttcaaccgaa tctataaaag tttttaattg ggatattaac tatgaaaatg tgtcaaattt 1140
aagtgattca aaatagatcc tattttgtgt tcattaataa aatgcatttt tttgtttcgg 1200
atttttattt ttgaaatcag aaaaatgaga aatgaatcat taaaaaatga aaatgcgaaa 1260
agactttttt ggggttctat ccctggatag ggggtagaac tatccagtta caacaattca 1320
attccaaaag agcataaact acacaaaaaa tataagttca ataaaacgga tcccctaaac 1380
taaaacaatt aatcttcaaa cccctatgaa tttttagtca tcaatttgaa tgttttctaa 1440
aaaatactac attgaattga ctccttcaat ctcgacgatt gaatatgaat gggctattat 1500
aagtttgaac aagccgctat ggtgaaattg gtagacacgc 1540
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taggaaggac tagaatatcc gtcac 25
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgtgtctac caatttcacc at 22
Claims (5)
1.一种用于对肉果秤锤树进行分子鉴定的rpl32-trnL分子标记，其特征在于，所述rpl32-trnL分子标记为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；扩增所述rpl32-trnL分子标记的引物对如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
2.一种用于对肉果秤锤树进行分子鉴定的rpl32-trnL分子标记，其特征在于，所述rpl32-trnL分子标记是由权利要求1中所述的引物对以肉果秤锤树的叶绿体基因组DNA为模板，经PCR扩增得到的。
3.根据权利要求2所述的用于对肉果秤锤树进行分子鉴定的rpl32-trnL分子标记，其特征在于，所述rpl32-trnL分子标记为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.采用权利要求1所述的分子标记鉴定肉果秤锤树的方法，其特征在于，采用权利要求1中所述的引物对对被检测肉果秤锤树的叶绿体基因组DNA模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记。
5.权利要求1~3任一项所述的rpl32-trnL分子标记在肉果秤锤树分子育种或基因克隆中的应用。
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