CN105713905A - 一种水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1及其应用 - Google Patents

一种水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、重组表达载体、以及所述启动子的应用。具体而言，本发明的发明人从日本晴的DNA序列中意外发现一段具有罕见特异性的启动子片段，该启动子可以驱动外源基因在水稻雄配子体中高度特异表达，而在其他任何部位均未发现明显表达。本发明克隆、分离并利用GUS染色方法鉴定了该启动子在雄配子体中的特异性。本发明所获得的启动子可有效用于水稻雄性不育的分子机理研究，及杂交水稻的应用研究，并且考虑到本发明启动子特异性表达的部位的特殊性，其在改良水稻品种方面的应用很可能为转基因水稻的发展带来深远影响。

Description

一种水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻雄配子体高度特异表达启动子及其应用，该启动子能够在作物基因工程中驱动目标基因在雄配子体中高度特异表达，从而达到研究水稻雄性不育分子机理的目的。
背景技术
杂种优势的利用是提高作物产量和改良作物品种的重要途径之一。三系及两系杂交稻的成功正是雄性不育系的实际应用。在植物基因工程创建雄性不育过程中，造成植物花器官败育是必然途径，花粉(花药)特异性表达启动子与育性的研究密切相关。目前已在不同物种中发现了多种花粉特异性启动子，其特异型表达机理也得到初步分析。如在烟草中发现的花药绒毡层特异表达基因启动子TA29，呈现严格的花药专一性。Mariani等将启动子TA29分别与核酸酶Bamase和RnaseTl基因融合后转化植物，这两种核酸酶基因在花药中特异表达，破坏绒毡层，获得雄性不育烟草和油菜，开创了基因工程创造雄性不育系的先河，至今已在烟草、油菜等植物上获得成功。但是，这种来自于双子叶植物的启动子大都难以在单子叶农作物中表达，因此，要获得广泛应用于作物生产实践的基因工程雄性不育系材料，必须从单子叶植物中发掘和利用新的启动子。
水稻是中国乃至世界上最重要的粮食作物之一，也是良好的单子叶植物模式生物。但是，当前广泛使用的水稻启动子中，大部分都是组成型启动子，其在多数或全部组织中保持持续的活性，这会增加植物的代谢负担，影响植株发育。
因此从水稻中发掘花粉(花药)特异启动子，从分子水平上揭示花粉发育的机理特别是花药花粉基因特异表达调控至关重要。但是，目前所报道的花粉特异启动子还很少，难以满足研发和生产的需要。尤其是在雄配子体中特异表达的启动子，更是从未见过有相关报道。
因此，本发明希望提供一种雄配子体高度特异表达启动子，为雄性不育植物基因工程和杂交水稻研究提供可用的遗传资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻雄配子体高度特异表达的启动子，获得含有该启动子序列的宿主菌、转化子以及该启动子的应用。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻雄配子体高度特异表达启动子，所述水稻雄配子体高度特异表达启动子包含下述序列之一或者下述序列的互补序列之一：
(a)SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列；
(b)SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列；
(c)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(d)在SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(e)与SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；
(f)与SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；
(g)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(h)在SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(i)SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(j)SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(k)与带有SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列；
(l)与带有SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列。
上面(c)-(l)中所列的水稻雄配子体高度特异表达启动子序列与SEQIDNo:1和2所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在雄配子体中表达。
序列表中SEQIDNo:1和2所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)的序列，本文中称为OsPoll1或启动子OsPoll1。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)中一段长度为1848bp的DNA序列具有驱动目标基因在水稻雄配子体高度特异表达的作用。并且分离克隆得到了该DNA序列。
需要说明的是：序列表中SEQIDNo:1与SEQIDNo:2的主要区别在于SEQIDNo:1比SEQIDNo:2的序列开头多出了22个bp“agaagaggacacatttatacgc”，其为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，序列末尾也多出了22个bp“agacattcaccaggaaaccact”，其为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)；序列表中SEQIDNo:2中的DNA序列为纯获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指SEQIDNo:1中的DNA序列，也可以指SEQIDNo:2中的DNA序列。换言之，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
优选地，本发明提供的水稻雄配子体高度特异表达启动子的DNA序列由SEQIDNo:1或2所示的序列，即OsPoll1或启动子OsPoll1构成。
另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻雄配子体高度特异表达启动子的表达盒。
又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻雄配子体高度特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻雄配子体高度特异表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-OsPoll1，该重组表达载体为将本发明的启动子即OsPoll1或启动子OsPoll1构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-OsPoll1。
或者待表达基因可以为任何对作物的雄配子体性状具有改善能力的基因。通过本发明的启动子驱动该基因在雄配子体中特异性地集中表达，从而实现改善水稻雄配子体相应性状的功能。
另一方面，本发明还可以利用所述启动子获得相应宿主菌，即本发明提供一种利用所述启动子获得宿主菌的方法。所述宿主菌包含本发明提供的上述水稻雄配子体高度特异表达启动子、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。
另一方面，本发明还可以利用所述启动子获得相应转化子，即本发明提供一种利用所述启动子获得转化子的方法。所述转化子包含本发明提供的上述水稻雄配子体高度特异表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。
再一方面，本发明提供上述水稻雄配子体高度特异表达启动子在培育转基因作物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻雄配子体高度特异表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育。
所述应用具体包括：
A)、以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增所述水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1；
B)、将所扩增的目的片段与目标基因相连，进而获得相应重组载体；
C)、利用冻融法将所获得的重组载体转入根癌农杆菌中；
D)、通过农杆菌介导方法利用所获得的根癌农杆菌对成熟水稻种子进行遗传转化；
E)、利用转化后的水稻种子培育相应的水稻植株。
并且优选地，所述应用可以用于改良作物生长特性，所述作物为禾本科作物，例如水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦、黑麦、玉米等，优选为水稻。
综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)中的一段具有转录调控作用的DNA序列，并将其命名为OsPoll1(序列表中的SEQIDNo:1或2)。具体而言，发明人发现该序列具有驱动基因在雄配子体中高度特异性表达的能力，提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连接到作物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株仅在花粉中及授粉后后花粉管部位有蓝色出现，在其他器官组织中均没有着色，从而证明该序列具有驱动基因高度特异的在雄配子体表达的活性。
本发明所述的启动子序列可与作物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组作物表达载体，经转化后，可在雄配子体高度特异地驱动靶标基因的表达。
技术效果
本发明所克隆的水稻启动子OsPoll1能够调控基因在植株雄配子体中高度特异表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对水稻雄配子体进行改造，可以得到雄性不育系，制备优良的杂交水稻。驱动雄配子体发育相关基因表达，对雄配子体形成的分子机理进行研究。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为将OsPoll1启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-OsPoll1示意图，其中示出了利用OsPoll1启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
图3为10周龄OsPoll1-GUS转基因植物各组织GUS染色图。各组织与GUS染液中染色24h后，出现蓝色染色代表GUS表达。根(A)、茎(B)、成熟叶片(C)中均无GUS表达。在小花(D)中，GUS仅在雄蕊中出现，而不在颖壳等其他部位表达；对完整雄蕊的观察(E)及放大后对雄蕊的后端(F)和前端(G)均表明GUS染色出现于雄蕊的花药室内；进一步观察(H)发现GUS染色仅在花粉中出现，在花药壁和药隔的组织中均无GUS表达；同时，雌蕊自身无GUS染色出现，仅在授粉后后花粉管部位出现表达(I)。标尺为1mm。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1
含有酶切位点的OsPoll1启动子的获得
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(OryzasativaLcv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsPoll1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。
本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1中A部分，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQIDNo:3)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQIDNo:4)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，引物序列如下：
正向引物：AAGCTTCACTCGTGTGGAGATGATTTTCHindIII
反向引物：GTCGACAGTGGTTTCCTGGTGAATGTCTSalI
由深圳华大基因公司合成。
步骤2、启动子OsPoll1的获得
以水稻品种日本晴DNA为模板，利用上述正向引物、反向引物扩增启动子OsPoll1，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1892bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和SalI进行双酶切验证，结果如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsPoll1，其核酸序列如SEQIDNo:1所示。
作物表达载体的构建和农杆菌的转化
从上面“启动子OsPoll1的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和SalI双酶切，回收启动子OsPoll1片段。同时利用HindIII和SalI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的OsPoll1片段和pCAMBIA1391片段用T4DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子OsPoll1与Gus基因融合的作物表达载体pCAMBIA1391-OsPoll1(图1B)，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。
利用启动子OsPoll1驱动Gus报告基因在水稻中表达
步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化
成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤组织与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。
采用上述“作物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照YongboDuan(YongboDuan，ChenguangZhai，etal.Anefficientandhigh-throughputprotocolforAgrobacteriummediatedtransformationbasedonphosphomannoseisomerasepositiveselectioninJaponicarice(OryzasativaL.)[J].PlantCellReport，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
共获得39株OsPoll1-pCAMBIA1391植株(OsPoll1-Gus转基因水稻植株)。
步骤2、GUS组织化学染色
参照Jefferson(JeffersonRA等人.GUSfusion：β-Glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplant[J].EMBOJ.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用75％乙醇处理，至组织中叶绿素完全脱掉。结果见图3(需要说明的是，由于专利文本中不接受彩色图片，因此，本申请的发明人将彩色的图3修改为灰度图像，但是，即便这样，基于图3中的颜色深浅度，也可以清晰地分辨出各部位是否发生染色)，根(A)、茎(B)、成熟叶片(C)中均无GUS表达，表明OsPoll1在营养组织中不表达。在小花(D)中，GUS仅在雄蕊中出现，而不在颖壳等其他部位表达；对完整雄蕊的观察(E)及放大后对雄蕊的后端(F)和前端(G)均表明GUS染色出现于雄蕊的花药室内；进一步观察(H)发现GUS染色仅在花粉中出现，在花药壁和药隔的组织中均无GUS表达；同时，雌蕊自身无GUS染色出现，仅在授粉后花粉管部位出现表达(I)。上述实验结果表明OsPoll1启动子具有高度特异的雄配子体表达活性。
实施例2
为了验证本发明的序列表SEQIDNo.2中的序列与SEQIDNo.1中的序列具有同样的功能，本发明基于SEQIDNo.2中的序列利用其他引物也进行了类似于上面实施例1的实验。
经实验验证，SEQIDNo.2中的序列也具有驱动Gus基因在雄配子体中高度特异表达的作用。由于实验方法和结果与实施例1类似，这里不再详述。
虽然本发明以水稻为例进行描述，但是申请人认为，本发明所获得启动子的应用场景不限于水稻，本发明启动子可以用于各种禾本科作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。本领域的技术人员可以预期，本发明的启动子能够在这些禾本科作物中能够实现与本发明相同的效果。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1，其特征在于，所述水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1包含下述序列之一或者下述序列的互补序列之一：
(a)SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列；
(b)SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列；
(c)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(d)在SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(e)与SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；
(f)与SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；
(g)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(h)在SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(i)SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(j)SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；
(k)与带有SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列；
(l)与带有SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1，其特征在于，所述水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1由SEQIDNo:1或2所示的DNA序列构成，或者所述水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1由SEQIDNo:1或2所示的DNA序列的互补序列构成。
3.根据权利要求1所述的水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1，其特征在于，所述水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1分离自日本晴水稻的成熟种子，分离所采用的扩增引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
4.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的水稻雄配子体高度特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1连接于载体中待表达的基因序列的上游。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-OsPoll1，其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体；或者所述待表达基因是具有改善雄配子体性状功能的基因。
7.一种根据权利要求1所述的水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将权利要求1所述的水稻雄配子体高度特异表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
A)、以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增所述水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1；
B)、将所扩增的目的片段与目标基因相连，进而获得相应重组载体；
C)、利用冻融法将所获得的重组载体转入根癌农杆菌中；
D)、通过农杆菌介导方法利用所获得的根癌农杆菌对成熟水稻种子进行遗传转化；
E)、利用转化后的水稻种子培育相应的水稻植株。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良作物生长特性，所述作物为禾谷类作物：水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦、黑麦、玉米等。
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